L’objectif de ce protocole est d’utiliser des titrages redox surveillés par résonance paramagnétique électronique (EPR) pour identifier différents cofacteurs de Saccharomyces cerevisiae Nar1. Les titrages redox offrent un moyen très robuste d’obtenir des potentiels médians de différents cofacteurs actifs redox dans les enzymes et les protéines.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
EPR surveillé Redox titrage des cofacteurs de
Dans cet article
Résumé
Résumé
Résonance paramagnétique électronique (RPE) surveillée titrages redox sont une méthode puissante pour déterminer le potentiel milieu de cofacteurs dans les protéines et d'identifier et de quantifier les cofacteurs dans leur état redox détectable.
La technique est complémentaire de l'électrochimie directe (voltamétrie) approche, car il ne offre pas d'informations sur les taux de transfert d'électrons, mais ne établit l'état des cofacteurs redox identité et dans la protéine à l'étude. La technique est largement applicable à ne importe quelle protéine contenant une résonance paramagnétique électronique (RPE) cofacteur détectable.
Un titrage typique nécessite 2 ml avec une concentration de protéine du cofacteur dans la plage de 1 à 100 uM. La protéine est titré avec un réducteur chimique (dithionite de sodium) ou l'oxydant (ferricyanure de potassium) pour poises l'échantillon à un certain potentiel. Un fil de platine et une électrode de référence Ag / AgCl sont reliés à un voltmètre pour mesurer le potentiel de la solution de protéine. Un ensemble de 13 médiateurs redox différentes est utilisé pour équilibrer entre les cofacteurs redox de la protéine et les électrodes. Les échantillons sont prélevés à différents potentiels et les spectres résonance paramagnétique électronique, caractéristiques pour les différents cofacteurs redox dans la protéine, sont mesurés. Le tracé de l'intensité du signal par rapport au potentiel de l'échantillon est analysée en utilisant l'équation de Nernst, afin de déterminer le potentiel du point milieu cofacteur.
Introduction
Il est frappant de constater que les procédés chimiques les plus fondamentaux maintien de la vie sur cette planète, la photosynthèse, fixation de l'azote et de la respiration, sont catalysées par de grands complexes de protéines contenant un large éventail de cofacteurs redox organiques et inorganiques. Il a été estimé qu'environ 30% de toutes les protéines contiennent un ou plusieurs cofacteurs métalliques. 1,2 Identifier et caractériser les cofacteurs redox peuvent être établies par électrochimie directe (par exemple, le film protéines voltamétrie) ou titrages redox. Les deux techniques sont complémentaires dans leur nature et leur appli....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Préparation de l'installation et Solutions
- Préparer la solution tampon contenant 100 mM de Tris, 250 mM de NaCl et 10% de glycerol à pH 8,5. Purger le tampon par rinçage avec de l'argon. Introduire le tampon dans une chambre anaérobie.
- Diviser le tampon en deux portions. Pour une partie (tampon A) ajouter 1 mM de DL-dithiothréitol (DTT, M 154,25 g / mol) et 1 mM de L-cystéine. L'autre partie (tampon B) ne contient pas d'agents de réduction.
- Préparer des solutions oxydantes et de réducteur. Ajouter 1 ml de solution de 2, 20 et 200 mM de ferricyanure de potassium (FIC, M 329,26 g / mol) et de dithi....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Le titrage redox du cluster fer-soufre contenant des protéines Nar1 de Saccharomyces cerevisiae a abouti à l'identification de trois cofacteurs différents: Nar1: une grappe [3FE-4S], un centre [4Fe-4S] et un mononucléaires centre Fe (Figure 1) . Les signaux EPR sont caractérisés par leurs valeurs de g: pour la [3FE-4S] + g z 2,01, 2,00 g croisé (figure 1B); pour la [4Fe-4S] +, z g 2,02 g 1,93 y, x 1,82 g
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La série de 13 médiateurs redox permet un équilibre redox dans la solution dans la gamme de -0,45 à 0,3 V par rapport à SHE (tableau 1 et figure 3). Bien au-dessus et en dessous de ces potentiels tous les médiateurs sont soit complètement réduits ou complètement oxydés et donc pas davantage l'équilibre redox avec les centres actifs de la protéine peuvent se produire. Ce est une notion importante, car parfois dans la littérature titrages redox sont effectuées avec seulement deux ou t.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de la combinaison études national de recherches néerlandais, Catalyse contrôlée par le design des produits chimiques (NRSC-catalyse) de la recherche. Dr HY Steensma et le Dr van Heusden GPH de l'Université de Leiden sont reconnus pour leur soutien à l'expression recombinante de S. cerevisiae Nar1.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Électrode de référence (Ag/AgCl) | Radiomètre | ||
| Chimie | Sigma-Aldrich | ||
| Spectromètre EPR | Bruker | ||
| N,N',N' -tétraméthyl-p-phénylendédiamine (TMPD) · ; (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophénol indophénol (DCIP), sel | 620-45-1 | ||
| Éthosulfate de phénazine (PES) | 10510-77-7 | ||
| Bleu | 122965-43-9 | ||
| Résorufine, sel | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (carmin d’indigo) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phénosafranine | 81-93-6 | ||
| Safranine O | 477-73-6 | ||
| Rouge | 553-24-2 | ||
| Benzyle viologène | 1102-19-8 | ||
| Méthyl viologène | 1910-42-5 |
Références
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzym....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
