Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

Résumé

Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l'excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.

Résumé

Les canaux biliaires intra et extra-hépatiques du foie sont distincts de développement, et peuvent être affectés différemment par certaines maladies. Toutefois, les différences entre cholangiocytes intra et extra-hépatiques, et entre les cellules néonatales et adultes, ne sont pas bien comprises.

Méthodes pour l'isolement de cholangiocytes de canaux biliaires intra-hépatiques sont bien établis ^1-4. Isolement de cellules canalaires extra-hépatiques, en particulier du nouveau-né, n'a pas encore été décrit, bien que ce serait d'une grande utilité dans la compréhension des différences entre les populations de cholangiocytes distinctes et dans l'étude des maladies telles que l'atrésie biliaire qui semblent cibler les canaux extra-hépatiques. Décrit ici est une technique optimisée pour isoler les cellules des voies biliaires extra-hépatiques deux nouveau-nés et de la souris adulte. Cette technique donne une population de cellules avec une contamination minimale pur à partir de cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes.

Cette méthod est basé sur l'enlèvement des canaux extra-hépatiques et de la vésicule biliaire, suivie par une dissection minutieuse et gratter pour enlever les couches de graisse et des fibroblastes. Les structures sont noyées dans des couches épaisses de collagène et cultivées pendant 3 semaines environ pour permettre excroissance de cholangiocytes en monocouches, qui peuvent ensuite être traitées à la trypsine et étalées re pour une utilisation expérimentale.

Introduction

L'origine et le développement de cholangiocytes intra et extra-hépatiques sont nettement différents. Le foie se développe à partir d'un diverticule de l'intestin antérieur endoderme ventral ^5. La région caudale du diverticule forme l'arbre biliaire extra-hépatique, tandis que la région crânienne génère l'arbre biliaire intrahépatique ^5. Cholangiocytes de conduits intrahépatiques sont dérivées de cellules progénitrices autour de la plaque canalaire dans les régions péri portail ^6. Ces cellules ont la capacité de se différencier en hépatocytes ou soit des cholangiocytes ^6. Cela a d'importantes implicat....

Protocole

Toute la procédure est effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans des conditions humaines en vertu d'un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection des locaux et l'utilisation des animaux (IACUC).

1. Préparation de l'équipement et Solutions

1. Mettre en place la table chirurgicale de la souris à proximité de la hotte de culture de tissu et l'incubateur (Figure 1A). Remarque: L'équipement nécessaire comprend un microscope de dissection, une source de lumière, de 12,5 cm de long ciseaux iris droites, 6 pou....

Résultats

L'utilisation de ce protocole les résultats dans l'isolement d'une population de nouveau-nés cholangiocytes extra-hépatiques de souris avec une excellente pureté, tel que démontré par K19 immunofluorescence (Figures 2A et 2B); nous obtenons des résultats similaires à isoler des cellules de souris adultes. Nous avons observé que cela prend 3 semaines pour les cellules de canaux biliaires fraîchement isolées pour former des monocouches sur des gels de collagène épais. Les cholangiocytes croîtr.......

Discussion

Décrite ici est une technique pour isoler cholangiocytes pures à partir des voies biliaires extra-hépatiques de souris de souris de tous les âges, y compris les nouveau-nés. La technique offre l'avantage que cholangiocytes extra-hépatiques peuvent être étudiés séparément cholangiocytes intra-hépatiques, et peut faciliter les études pour identifier les principales différences entre ces populations de cellules. Nous avons récemment publié une étude démontrant diminué cils dans cholangiocytes extra-hépatiques isolés pa.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, utilisé dans les milieux BEC
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, utilisé dans les milieux BEC
MEM avec des acides aminés non essentiels	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Insuline-transfertrine-sélénium	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Concentré de lipides chimiquement définis	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Pénicilline-Streptomycine	Cellgro	30-002-CI	5 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Gentamicin	Gibco/ Life technologies	15750-060	0,2 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Éthanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 ml, utilisé dans le milieu BEC
vitaminique MEM	Gibco/ Life technologies	11120-052	5 ml, utilisé dans le milieu BEC
Inhibiteur de la trypsine de soja	Biowhittaker	17-605E	5 ml, utilisé dans le milieu BEC. Le solvant est PBS, mélanger à 5 mg/ml concentration de stock
L-glutamine	Cellgro	25-005-CL	5 ml, utilisé dans le milieu BEC
Extrait hypophysaire bovin	Gemini	500-102	1,1 ml, utilisé dans le milieu BEC
Dexaméthasone	Sigma Aldrich	D4902	0,5 ml, utilisé dans le milieu BEC, Stock conc 393 μ ; g/ml dilué avec
l’éthanol 3 3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma Aldrich	T6397	0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, Stock conc 3,4 mg/ml dilué avec de l’éthanol
Facteur de croissance épidermique	Millipore	01-101	0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, 25 μ ; g/ml dilué avec DMEM F12+1 %BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5 ml, utilisé dans les milieux BEC, à utiliser à une concentration de base de 0,411 mg/ml et dilué avec DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Collagène à queue de rat	BD Biosciences	354236	variable en fonction de la concentration de collagène
PBS 10x	USB Corporation	75889	utilisation à 10x, sterlie, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration
de collagène dH2O	N/A	N/A	stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène
NaOH 10 N	Fischer Scientific	ss255-1	Diluer à 1 N, stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène
collagénase de type XI de Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	diluer dans du DMEM et un filtre stérile avant utilisation
trypsine-EDTA (1x) 0,25	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, incuber max 10 min
trypsine-EDTA (10x) 0,5 %	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, incubation max 10 min
Microscope de dissection	Nikon	SMZ645	Autres modèles acceptables
Source lumineuse (illuminateur à fibre optique)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Autres modèles acceptables
12,5 cm ciseaux à iris droits	Kent Scientific		Autres modèles acceptables
Pince incurvée non dentelée 6" avec pointes fines	Microscopie électronique Sciences		Autres modèles
acceptables Pince en acier inoxydable dentelée de 4 po avec pointes fines	Sciences de la microscopie		Autres modèles acceptables

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