Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

Résumé

Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l'excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.

Résumé

Les canaux biliaires intra et extra-hépatiques du foie sont distincts de développement, et peuvent être affectés différemment par certaines maladies. Toutefois, les différences entre cholangiocytes intra et extra-hépatiques, et entre les cellules néonatales et adultes, ne sont pas bien comprises.

Méthodes pour l'isolement de cholangiocytes de canaux biliaires intra-hépatiques sont bien établis ^1-4. Isolement de cellules canalaires extra-hépatiques, en particulier du nouveau-né, n'a pas encore été décrit, bien que ce serait d'une grande utilité dans la compréhension des différences entre les populations de cholangiocytes distinctes et dans l'étude des maladies telles que l'atrésie biliaire qui semblent cibler les canaux extra-hépatiques. Décrit ici est une technique optimisée pour isoler les cellules des voies biliaires extra-hépatiques deux nouveau-nés et de la souris adulte. Cette technique donne une population de cellules avec une contamination minimale pur à partir de cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes.

Cette méthod est basé sur l'enlèvement des canaux extra-hépatiques et de la vésicule biliaire, suivie par une dissection minutieuse et gratter pour enlever les couches de graisse et des fibroblastes. Les structures sont noyées dans des couches épaisses de collagène et cultivées pendant 3 semaines environ pour permettre excroissance de cholangiocytes en monocouches, qui peuvent ensuite être traitées à la trypsine et étalées re pour une utilisation expérimentale.

Introduction

L'origine et le développement de cholangiocytes intra et extra-hépatiques sont nettement différents. Le foie se développe à partir d'un diverticule de l'intestin antérieur endoderme ventral ^5. La région caudale du diverticule forme l'arbre biliaire extra-hépatique, tandis que la région crânienne génère l'arbre biliaire intrahépatique ^5. Cholangiocytes de conduits intrahépatiques sont dérivées de cellules progénitrices autour de la plaque canalaire dans les régions péri portail ^6. Ces cellules ont la capacité de se différencier en hépatocytes ou soit des cholangiocytes ^6. Cela a d'importantes implications cliniques étant donné que cholangiopathies peuvent cibler spécifiquement une catégorie de cholangiocytes. Par exemple, l'atrésie biliaire affecte d'abord les canaux extra-hépatiques du nouveau-né, alors que le syndrome d'Alagille affecte voies biliaires intrahépatiques.

Il existe des descriptions multiples de l'isolement des cholangiocytes intra-hépatiques et les unités de la voie biliaire à partir des souris et des rats. Dansinvestigateurs ont isolé des cellules individuelles par l'isolement de la gaine et l'excroissance subséquente, ou par digestion du foie et de la tirer vers le bas anticorps cholangiocytes exprimant des marqueurs de surface cellulaire spécifiques ^4.1. Les unités des canaux biliaires fonctionnels et polarisés ont été isolées par digestion du foie et de la filtration de la taille ^7. Biliaires unités de conduits sont capables de répondre à des stimuli de sécrétion et de démontrer la sécrétion de liquide ^7, tandis que il a été démontré cholangiocytes isolés à développer des structures canalaire in vitro ^1,2. Limites de ces méthodes comprennent la nécessité d'une expertise technique spécialisée et un équipement spécial pour la perfusion du foie avec des enzymes digestives. En outre, il existe un risque de contamination par des cellules mésenchymateuses ^3.

Procédé pour isoler extrahépatiques cholangiocytes des canaux biliaires, en particulier de voies biliaires extra-hépatiques néonatales, n'a pas été précédemment décrit. Le présent document décrit une technique simplifiée pour isoler un nouveau-nés ainsi que des cellules des canaux biliaires extra-hépatiques adultes à des niveaux élevés de pureté. Cette technique facilitera l'étude des différences entre cholangiocytes et la recherche sur les mécanismes des maladies comme atrésie des voies biliaires qui impliquent les conduits extra-hépatiques et extra-hépatiques intra.

Protocole

Toute la procédure est effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans des conditions humaines en vertu d'un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection des locaux et l'utilisation des animaux (IACUC).

1. Préparation de l'équipement et Solutions

1. Mettre en place la table chirurgicale de la souris à proximité de la hotte de culture de tissu et l'incubateur (Figure 1A). Remarque: L'équipement nécessaire comprend un microscope de dissection, une source de lumière, de 12,5 cm de long ciseaux iris droites, 6 pouces pince courbe en dents de scie non avec des pointes fines, et 4 pouces de pince dents de scie avec des pointes courbes (figure 1B).
2. Placez instruments stérilisés dans un bécher en verre de 70% d'alcool sur la table d'opération.
3. Remplir trois 60 mm boîtes de Pétri stériles avec les médias de l'isolement stérile (tableau 1); placer deux sur la table chirurgicale et un dans le capot, le tout sur la glace.
4. Placez collagène de queue de rat,stérile 10x tampon phosphate salin (PBS), de l'eau stérile, NaOH stérile 1 et biliaire cellules épithéliales (BEC) des médias (tableau 1) dans la hotte de culture de tissus. Remarque: Le collagène doit être sur la glace.

2. Cholagogue Isolement et culture

1. Euthanasier les souris néonatale entre 0-3 jours de la vie, par exposition au dioxyde de carbone jusqu'à inconscient suivie par dislocation cervicale, conformément aux lignes directrices du IACUC (figure 1C).
   Remarque: les souris plus âgées peuvent être utilisés en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
2. Placer l'animal en décubitus dorsal et une petite incision horizontale traversant la ligne médiane dans la région du bassin. Étendre cette incision latéralement et vers le haut des deux côtés de l'abdomen, en formant un rabat en forme d'U. Tournez rabat pour exposer les organes abdominaux. Une fois que l'abdomen est ouvert, déplacer soigneusement les intestins hors de la cavité abdominale vers la droite de l'animal pour une meilleure visualisation du foie et de la voie biliaire principale. Remarque: il peut être nécessaire d'étendre les incisions latérales dans la cage thoracique d'obtenir une meilleure identification du foie.
3. Utilisation du microscope à dissection, d'identifier la voie biliaire, du foie et des intestins. Identifier le canal cholédoque premier (figure 1D), en utilisant la prudence, car les structures sont très délicates. Avec les pinces dentelées et non dentelées, méticuleusement propre et enlever le tissu conjonctif y compris la graisse autour de la bile. Utiliser une pince pour maintenir le conduit et l'autre pour le nettoyage.
4. Utiliser une technique similaire pour nettoyer la vésicule biliaire.
5. Placer les conduits nettoyés et la vésicule biliaire dans le premier plat de milieux d'isolement sur la glace. Massez doucement les structures avec les forceps non dentelés tandis que dans les médias pour éliminer davantage le tissu conjonctif et enlever la bile de la vésicule biliaire.
6. Transférer les conduits et la vésicule biliaire à la deuxième plat de milieux d'isolement.
7. Après isolement de conduites et de la vésicule biliaire à partir de 5 animaux, transférer lepièces à la troisième boîte de Pétri, dans la hotte. Remarque: si les cellules doivent être isolé à partir de plus de cinq animaux, faire en lots, en utilisant des solutions fraîches pour chaque groupe de 5 animaux.
8. Préparer des gels de collagène épais dans la hotte de culture de tissus:
   Remarque: tous les plats de taille peut être utilisé. Une boîte de culture de 60 mm avec un volume final de 3 ml de collagène pour chaque groupe de 5 nouveau-nés fonctionne bien. Ce doit être préparé au moment de l'intégration conduits fraîchement isolés.
   1. Placer rat tail collagène, 10x stérile saline tamponnée au phosphate (PBS 10x), dH ₂ O stérile, et N NaOH stérile sur de la glace 1.
   2. Calculer les volumes de dH ₂ 0, 10x PBS, NaOH, et le collagène nécessaire pour des gels ayant une concentration finale de 2 mg / ml de collagène dans du PBS 1x, en utilisant un volume de 1 N de NaOH égale à 0,023 fois le volume de collagène ajoutée. Remarque: Si autre source de collagène est utilisé, suivre les instructions du fabricant pour la neutralisation et la formation de gel.
   3. Mélanger dH ₂ 0, 10x PBS, et 1 N NaOH, puis ajouter le collagène et pipette bien pour assurer un mélange homogène.
9. Une fois que la solution de collagène est épaissie à une consistance de gel à la température ambiante, immédiatement incorporer les conduits dans le collagène.
10. Placer à l'étuve à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 30 minutes pour permettre au collagène de se solidifier.
11. Une fois gel a solidifié (couleur passe de transparent à blanc), superposition avec 3,5 ml de milieu BEC (tableau 1) et incuber à 37 ° C, 5% de CO _2.
12. Retirez le support BEC 3 fois par semaine et le remplacer par 3,5 ml de milieu frais.

3. Cholangiocytes à isolation primaire du collagène épais Gels

Remarque: dans les 3 semaines, feuilles de cholangiocytes (cellules avec de gros noyaux s'étendant directement à partir de conduits intégrés) seront visibles dans le collagène d'épaisseur. Si il ya un grand nombre de fibroblastes dans le plat, il doit être jeté. Si quelques régions du plat ontcroissance de fibroblastes, ceux-ci peut être découpé avec un scalpel et enlevée avant le fractionnement des cholangiocytes.

1. Préparer minces gels de collagène:
   1. Diluer le collagène à une concentration de 1 mg / ml avec du PBS stérile. Remarque: utiliser 1 ml pour 100 plaque mm; ajuster en conséquence pour d'autres plats de taille.
   2. Fais la solution de collagène uniformément avec une spatule de cellule (grands plats) ou de la pointe de la pipette (petits plats), puis laisser à température ambiante pendant 10 min.
   3. Couvrir la plaque avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% _de CO2 pendant 10 min.
   4. Retirer la plaque de l'incubateur et laver avec du PBS 1X. Aspirer immédiatement 1x PBS.
   5. Manteau avec une seconde couche mince de collagène, d'étalement par rotation de la plaque ou plaque de placer sur un agitateur. Incuber à 37 ° C, 5% _de CO2 pendant 10 min.
   6. Après collagène est solidifié, la plaque de couverture avec DMEM/F12 et incuber à 37 ° C, 5% _de CO2 pendant 30 min.
2. Diviser les cellules de egels ick de collagène:
   1. Avec une spatule de culture cellulaire ou d'un grattoir de cellules, gratter doucement gel de collagène de la plaque de sorte qu'elle est flottant.
   2. Préparer une solution de collagénase en diluant de type XI collagénase (voir la liste des matériaux) à 10 mg / ml avec DMEM/F12. Mélangez bien et filtre stérile.
   3. Ajouter 1 ml de solution de collagénase (ci-dessus) par boîte de 60 mm de cellules en collagène d'épaisseur. Ne retirez pas le support BEC (qui devrait être de 3 ml). Incuber plat pendant 30 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   4. Retirer la solution contenant des cellules, et placer dans 15 ml de tube conique.
   5. Isoler à 2200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre suspendre le culot dans un volume similaire de DMEM/F12.
   6. Spin nouveau solution à 2200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant.
   7. Remettre en suspension le culot dans 3 ml de trypsine à 0,5%, et les incuber à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 5 min. Après incubation, la pipette la solution de haut en bas pour briser les feuilles de cholangiocytes. Ajouter 5 ml de BEC médias unesolution de filage ème à 1500 g pendant 5 min.
   8. Retirer le surnageant et remettre le culot en DMEM/F12, puis tourner solution à 1500 g pendant 5 min.
   9. Retirer le surnageant et re suspendre le culot dans les médias BEC (tableau 1). Cellules de la plaque sur faites précédemment minces gels de collagène.

4. Passage et le stockage des cellules

Note: les cellules minces sur des gels de collagène peuvent être divisées selon les besoins.

1. Laver les plaques avec du PBS stérile avant l'incubation dans 0,25% de trypsine à 37 ° C pendant 10 à 15 min.
2. Neutraliser avec un volume égal de milieu BEC, et un culot à 1500 g pendant 5 min. Rincer culot avec DMEM/F12, alors culot à 1500 g pendant 5 min.
3. Resuspendre les cellules dans des milieux BEC pour la distribution de collagène revêtu des boîtes de culture cellulaire.
   Remarque: En variante, les cellules peuvent être remises en suspension dans un support de stockage et stockées dans un congélateur C -80 ° ou de l'azote liquide (tableau 1).

Résultats

L'utilisation de ce protocole les résultats dans l'isolement d'une population de nouveau-nés cholangiocytes extra-hépatiques de souris avec une excellente pureté, tel que démontré par K19 immunofluorescence (Figures 2A et 2B); nous obtenons des résultats similaires à isoler des cellules de souris adultes. Nous avons observé que cela prend 3 semaines pour les cellules de canaux biliaires fraîchement isolées pour former des monocouches sur des gels de collagène épais. Les cholangiocytes croîtr...

Discussion

Décrite ici est une technique pour isoler cholangiocytes pures à partir des voies biliaires extra-hépatiques de souris de souris de tous les âges, y compris les nouveau-nés. La technique offre l'avantage que cholangiocytes extra-hépatiques peuvent être étudiés séparément cholangiocytes intra-hépatiques, et peut faciliter les études pour identifier les principales différences entre ces populations de cellules. Nous avons récemment publié une étude démontrant diminué cils dans cholangiocytes extra-hépatiques isolés pa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, utilisé dans les milieux BEC
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, utilisé dans les milieux BEC
MEM avec des acides aminés non essentiels	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Insuline-transfertrine-sélénium	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Concentré de lipides chimiquement définis	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, utilisé dans les milieux BEC
Pénicilline-Streptomycine	Cellgro	30-002-CI	5 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Gentamicin	Gibco/ Life technologies	15750-060	0,2 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Éthanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 ml, utilisé dans le milieu BEC
vitaminique MEM	Gibco/ Life technologies	11120-052	5 ml, utilisé dans le milieu BEC
Inhibiteur de la trypsine de soja	Biowhittaker	17-605E	5 ml, utilisé dans le milieu BEC. Le solvant est PBS, mélanger à 5 mg/ml concentration de stock
L-glutamine	Cellgro	25-005-CL	5 ml, utilisé dans le milieu BEC
Extrait hypophysaire bovin	Gemini	500-102	1,1 ml, utilisé dans le milieu BEC
Dexaméthasone	Sigma Aldrich	D4902	0,5 ml, utilisé dans le milieu BEC, Stock conc 393 μ ; g/ml dilué avec
l’éthanol 3 3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma Aldrich	T6397	0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, Stock conc 3,4 mg/ml dilué avec de l’éthanol
Facteur de croissance épidermique	Millipore	01-101	0,5 ml, utilisé dans les milieux BEC, 25 μ ; g/ml dilué avec DMEM F12+1 %BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5 ml, utilisé dans les milieux BEC, à utiliser à une concentration de base de 0,411 mg/ml et dilué avec DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 ml, utilisé dans les milieux BEC et 500 μ ; l dans l’isolement
Collagène à queue de rat	BD Biosciences	354236	variable en fonction de la concentration de collagène
PBS 10x	USB Corporation	75889	utilisation à 10x, sterlie, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration
de collagène dH2O	N/A	N/A	stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène
NaOH 10 N	Fischer Scientific	ss255-1	Diluer à 1 N, stérile, utilisé pour fabriquer du collagène, la quantité utilisée dépend de la concentration de collagène
collagénase de type XI de Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	diluer dans du DMEM et un filtre stérile avant utilisation
trypsine-EDTA (1x) 0,25	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, incuber max 10 min
trypsine-EDTA (10x) 0,5 %	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, incubation max 10 min
Microscope de dissection	Nikon	SMZ645	Autres modèles acceptables
Source lumineuse (illuminateur à fibre optique)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Autres modèles acceptables
12,5 cm ciseaux à iris droits	Kent Scientific		Autres modèles acceptables
Pince incurvée non dentelée 6" avec pointes fines	Microscopie électronique Sciences		Autres modèles
acceptables Pince en acier inoxydable dentelée de 4 po avec pointes fines	Sciences de la microscopie		Autres modèles acceptables

Solution de  % électronique