Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Résumé

Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Résumé

Protéines de canaux ioniques sont des dispositifs universels de communication rapide à travers les membranes biologiques. La signature temporelle du flux ionique qu'ils génèrent dépend des propriétés intrinsèques de chaque protéine de canal ainsi que le mécanisme par lequel il est généré et contrôlé et représente un domaine important de la recherche actuelle. D'informations sur la dynamique de fonctionnement des protéines de canal ionique peut être obtenue par l'observation de longues étendues de courant produites par une seule molécule. Décrit ici est un protocole permettant d'obtenir un canal de patch-clamp enregistrements actuels attachés cellulaires pour un canal ionique ligand fermée, le récepteur de NMDA, exprimé de manière hétérologue dans des cellules HEK293 ou nativement dans les neurones corticaux. Également des instructions sur la façon d'adapter la méthode à d'autres canaux ioniques d'intérêt en présentant l'exemple du canal PIEZO1 mécano-sensible. Cette méthode peut fournir des données concernant les propriétés de conductance de la chaîne et la séquence temporelle de l'OPEconformations n-fermées qui constituent le mécanisme d'activation de la chaîne, aidant ainsi à comprendre leurs fonctions en matière de santé et de la maladie.

Introduction

Communication rapide à travers les membranes biologiques repose presque exclusivement sur les oligomères pores formant les protéines membranaires, communément appelées canaux. Ces protéines sont très différentes dans les signaux d'activation, les mécanismes de déclenchement et les propriétés de conductance. protéines de la Manche dont les pores sont sélectifs pour les ions sont classés comme des canaux ioniques; leur activation produit des courants ioniques à travers la membrane, et leurs réponses peuvent être enregistrées avec une haute résolution en temps réel en utilisant des techniques électrophysiologiques. Les signaux d'activation couvrent un large éven....

Protocole

1. Culture cellulaire et l'expression des protéines

1. Maintenir des cellules HEK293 (numéro ATCC CRL-1573) entre les passages 22 et 40, qui comprend des passages effectués par l'ATCC, en culture monocouche dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / mélange streptomycine à 5% de CO ₂ et 37 ° C. Entre expériences, les cellules de passage dans des flacons T25 à 5-20 dilutions dans un volume final de 10 ml. Remarque: En utilisant des cellules au cours de ces passages garantit la santé des cellules favorable qui permettra la formation de joint optimal et stabilité de patch.
2. Pour la trans....

Résultats

Recombinant récepteurs NMDA

Récepteurs NMDA se lient et de répondre à l'action concomitante des deux co-agonistes: glutamate et la glycine. Ils assemblent comme hétérotétramères de deux sous-unités glycine GluN1 et sous-unités GluN2 liaison deux glutamate de liaison. Sous-unités GluN2 sont codés par quatre gènes (AD) et de ces formes les plus largement transcrites dans le cerveau sont GluN2A chez les adultes et chez les animaux jeunes GluN2B. En raison de la diversité de.......

Discussion

Dans le domaine de canal ionique, un domaine important de la recherche est consacrée à la compréhension de la séquence d'événements qui conduit à la voie d'ouverture ou le mécanisme de déclenchement de la voie. Pour la plupart des canaux, ce processus est complexe et implique plusieurs étapes cinétiques qui ne peuvent être déduites à partir d'un signal multicanal macroscopique. En revanche, les expériences peuvent être conçus où l'observation de la séquence des événements ouverts / fermés dans l'enre.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Produits chimiques	Sigma	Divers
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Microscope inversé à fond clair	Olympus	1x51	Nikon propose également des microscopes similaires
Boîte fluorescente	X-cite	Series 120
Guide de lumière liquide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulateur	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplificateur	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Extracteur	Narishige	PC-10
Polisseuse	Narishige	Microforge MF-830
Cage de Faraday	TMC	8133306
Pince à pression à grande vitesse	ALA Scientific Instruments ALA	HSPC
Pompe à pression/vide	ALA Scientific Instruments ALA	PV-PUMP	Pour HSPC-1