Un Ex vivo Système de culture à étudier la thyroïde développement

Résumé

Ce protocole décrit la dissection d’anlagen thyroïdien embryonnaire de souris et la culture d’explants sur des filtres semiporeux ou sur des lames de plastique de microscopie. Ce système est idéal pour étudier les événements morphogénétiques ou de différenciation survenant au cours du développement thyroïdien d’embryons de type sauvage ou knock-out, et se prête à des expériences de gain et de perte de fonction.

Résumé

La thyroïde est une glande endocrine bilobated localisée à la base du cou, la production des hormones thyroïdiennes T3, T4, et la calcitonine. T3 et T4 sont produites par des thyrocytes différenciés, organisés en sphères fermées appelées follicules, tandis que la calcitonine est synthétisée par les cellules C, intercalés entre les follicules et un réseau dense de capillaires sanguins. Bien que l'architecture et les fonctions de la thyroïde adultes ont été abondamment décrits et étudiés, la formation des unités de "angio-folliculaires", la répartition des cellules C dans le parenchyme et les communications paracrines entre les cellules epitheliales et endotheliales est loin d'être compris.

Cette méthode décrit les étapes successives de la souris thyroïde embryonnaire ébauches dissection et de sa culture sur des filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscopie en plastique. Dans un délai de quatre jours de ce système de culture récapitule fidèlement dans le développement de la thyroïde vivo. En effet, (i) milliardsobation de l'organe se produit (pour les explants de E12.5), (ii) les précurseurs thyrocytes organiser dans les follicules et polarisent, (iii) thyrocytes et C-cellules se différencient, et (iv) les cellules endothéliales présentes dans le tissu microdisséquée prolifèrent, migrent dans l' lobes de la glande thyroïde, et associer étroitement avec les cellules épithéliales, comme ils le font in vivo.

tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents. En outre, des explants de la culture peut être manipulé par l'addition d'inhibiteurs, des anticorps bloquants, des facteurs de croissance, ou même des cellules ou du milieu conditionné. Développement ex vivo peut être analysée en temps réel, ou à n'importe quel moment de la culture par immunocoloration et RT-qPCR.

En conclusion, la culture de la thyroïde des explants combiné avec l'aval l'ensemble du montage ou sur des sections d'imagerie et de profil d'expression génique offre un système puissant pour manipuler et étudier morphogénétiques et de différenciation des événements de la thyroïde organogenesis.

Introduction

La glande thyroïde est une collection de sphères épithéliales indépendants, appelés follicules, entouré par un réseau dense de capillaires endothéliales. Cette organisation permet la fonction thyroïdienne: capillaires endothéliales fournissent thyrocytes avec de l'iode, nécessaires à la synthèse des hormones T3 et T4, et de distribuer ces derniers à l'ensemble du corps. Dispersés entre les follicules capillaires et, C-cellules produisent l'hormone calcitonine hypocalcémique ^1. Bien que l'architecture et les fonctions de la thyroïde adulte sont bien connus, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement embryonnaire de la thyroïde (formation du follicule et la différenciation) sont loin d'être compris.

Au cours de l'embryogenèse, les thyrocytes progéniteur origine comme un épaississement (l'ébauche de la ligne médiane) de la paroi ventrale de l'endoderme de l'intestin antérieur au jour embryonnaire (e) de 8,5 dans l'embryon de souris, tandis que les cellules C progéniteurs sont créés à E11.5 sous forme de saillies en forme de goutte d'eau ( le bo ultimobranchialematrices) de la quatrième poches pharyngées ^2-6. Le bourgeon de la ligne médiane se détache alors de l'endoderme, élargit bilatéral de fusionner à E13.5 avec les organismes ultimobranchiaux de chaque côté de la trachée. Enfin, thyrocytes organisent dans les follicules et C-cellules se différencient.

Les connaissances actuelles sur la formation de la thyroïde provient principalement de l'analyse histologique des tissus fixés, mais les événements morphogénétiques impliqués dans la formation de la thyroïde sont très dynamique et impliquer les communications et les interactions entre les différents types de cellules et avec la matrice extracellulaire. Des travaux récents ont montré que les progéniteurs de thyrocyte produisent des niveaux élevés de VEGF pour recruter des cellules endothéliales de la thyroïde en développement, et, à son tour, recrutent les cellules endothéliales favorisent la formation de follicules et de la différenciation des cellules C ^7.

La plupart des études ex vivo sur la thyroïde ont été effectués sur des cellules de la thyroïde dérivé adultes isolés, cultivés soit sur ​​culture de tissus 2D plastique dparoisses ou dans des matrices 3D. L'utilisation de ces types de cultures, les cellules folliculaires différenciées soit rester polarisé et organisées en follicules ou réacquérir une organisation 3D ^8-10. Cependant, ces cellules épithéliales purs, explantées à partir de leur environnement physiologique, et cultivées en 2D, ne tiennent pas compte des interactions avec la matrice extracellulaire, les cytokines, les facteurs de croissance et d'autres types cellulaires tels que les cellules endotheliales ou les nerfs qu'ils rencontrent normalement in vivo. Une étude très agréable a récemment décrit un protocole de différenciation des cellules ES en utilisant des follicules thyroïdiens une étape finale de la culture en 3D matrigel ^11. Cependant, ces cultures 3D manquent de contact avec d'autres types cellulaires.

Sur la base de l'expertise précédente sur le pancréas et les glandes salivaires culture d'organes ^{12 à 14,} un procédé pour la dissection de souris embryonnaire thyroïde anlagen et mise en culture des explants sur les filtres semi-poreuses ou sur des lames de microscope en plastique a été développé.

Quandtravailler avec des embryons E12.5, la double origine de la anlagen de la thyroïde (ébauche de la ligne médiane et les deux organes latéraux ultimobranchiaux) a imposé la microdissection d'un grand fragment de tissu. Celui-ci contenait la trachée, mais pas l'œsophage, et s'étendait des artères du pharynx arc jusqu'à l'enflure aryténoïde. Lorsqu'elle est cultivée sur les filtres, l'ébauche de la ligne médiane s'étend latéralement de chaque côté de la trachée, où ils fusionnent avec les organes ultimobranchiaux pour former les deux lobes de la glande thyroïde, toujours reliés par un isthme.

En culture, les cellules épithéliales prolifèrent, organisent dans les follicules et se différencient en thyrocytes et les cellules C, en fonction de leur origine. Les cellules endothéliales contenues dans le tissu microdisséquée prolifèrent et envahissent les lobes de la glande thyroïde pour enfin associer étroitement à la structure épithéliale folliculaire, indépendamment de la circulation sanguine ou des facteurs circulants également. Comme le développement des explants récapitule fidèlement in vivo développerment, ce système de culture est optimale pour étudier les événements morphogénétiques et de différenciation qui se produisent au cours du développement de la glande thyroïde.

tissus de la thyroïde peuvent être obtenus auprès de type sauvage, KO ou embryons transgéniques fluorescents, et le système de culture est prête à perte et expériences de gain de fonction. Enfin, imagerie time-lapse d'explants de la thyroïde marqués par fluorescence sur des plats en plastique de microscopie pourrait être exploitée afin de mieux étudier la cinétique et la continuité des mouvements morphogénétiques qui se produisent in vivo. Imagerie time-lapse a déjà été utilisée pour étudier la morphogenèse de ramification du pancréas ^15,16 ou le bourgeon urétéral ^17.

Protocole

Les souris ont été soulevées et traitées selon les principes de protection des animaux de laboratoire du Comité de protection des animaux de l'Université. Toutes les procédures et protocoles ont été approuvés par le Comité.

1. Revêtement de microscopie en plastique Culture Chambers

REMARQUE: Effectuer toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Les deux types de revêtement sont fonctionnellement équivalents.

1. Manteau plastique chambres de culture avec de la fibronectine un jour avant l'isolement des tissus de la thyroïde:
   1. Diluer la fibronectine stérile à une concentration finale de 50 pg / ml dans du milieu M199 supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,25 pg / ml de fungizone et ¹² 2 mM de glutamine.
   2. Couvrir les puits avec 200 ul de fibronectine dilué et incuber pendant une nuit dans un réfrigérateur à 4 C °.
   3. Le jour de la dissection, la fibronectine aspirer, rincer les puits une fois avec M199 et ajouter un volume minimum de 200 pi de M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal.
   4. Laissez les chambres revêtues dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à plaquer les explants.
2. Manteau de plastique avec des chambres de culture collagène de type I de 2 heures avant l'isolement des tissus de la thyroïde:
   1. Diluer le type collagène stérile à une concentration finale de 50 pg / ml dans du HCl 10 mM. NOTE: Gardez collagène solution stock sur la glace.
   2. Couvrir les puits avec 200 pi de Type dilué collagène et incuber pendant 2 heures à température ambiante (RT).
   3. Aspirer la solution de collagène de type I, rincer les puits une fois avec M199 et ajouter un volume minimum de 200 pi de M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal.
   4. Laissez les chambres revêtues dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à plaquer les explants.

2. Dissection de la thyroïde Anlagen contenant des tissus (E12.5) ou de la thyroïde lobes (E13.5-e14.5)

REMARQUE: Utiliser des outils de dissection et des assiettes propres Petri / culture. Les étapes générales et des incisions décrites ci-dessous sont les mêmes pour E12.5 et E14.5 embryons.

1. Sacrifier les souris femelles expiré enceinte à l'embryon désiré (e) d'une journée (à partir de E12.5 E14.5 à) et enlever l'utérus à l'aide d'instruments de dissection.
2. Placez l'utérus disséqué dans une plaque de 10 cm contenant HBSS.
3. Tenir une extrémité de l'utérus avec une pince et ouvrir l'utérus avec de petits ciseaux pour libérer progressivement tous les embryons.
4. Séparez les embryons du placenta avec des ciseaux et de transférer les embryons avec leurs membranes extra-embryonnaires dans une nouvelle plaque de 10 cm contenant HBSS.
5. Retirer le sac jaune et l'amnios. NOTE: De ce point, travailler sous une loupe binoculaire avec transillumination par le bas; augmentant le grossissement avec des étapes de dissection. Utiliser des aiguilles de tungstène dans les capillaires de verre comme des outils de dissection.
6. En utilisant les aiguilles commeun couteau et une fourchette, retirer la partie supérieure de la tête, y compris la mâchoire supérieure et les oreilles (figure 1A, couper le long d'une).
7. Maintenez l'embryon sur le dos et retirez d'abord une pièce supplémentaire du tube neural (figure 1A, couper le long de b), puis la partie inférieure de l'embryon, juste sous les membres antérieurs et au-dessus du coeur (figure 1B).
8. Transférer la tranche d'embryon contenant la langue (pour orienter le tissu) et la région du cou dans une nouvelle plaque de 10 cm contenant HBSS.
9. Retirez le tube neural et les tissus postérieurs à l'oesophage / trachée (figure 1C, couper le long d'une).
10. Doucement la section tranche de tissu le long des deux côtés de la langue (figure 1C, couper le long de b et b ').
11. Localiser l'oesophage et de la trachée, dans le prolongement de la langue, et disséquer la langue, laissant le aryténoïde gonflement (figure 1D, couper le long d'une), et le tissu sur both côtés de l'œsophage / trachée (figure 1D, couper le long de b et b ').
12. Retirer l'œsophage, la trachée et les placer avec sa face ventrale vers le haut.
13. Disséquer les tissus non désirés tels que le thymus (Figure 1E) et tous les tissus situés latéralement par rapport aux artères des arcs branchiaux. Pour E13.5 ou des embryons E14.5, visualiser les lobes de la glande thyroïde de chaque côté de la trachée (figure 1F; lignes pointillées de rouge) et disséquer en outre les lobes de la trachée.
14. Transférer la région de la trachée isolée E12.5, ou les lobes de la glande thyroïde E13.5-E14.5 dans une plaque de culture de 35 mm contenant du milieu M199 préchauffé additionné d'antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal. Transfert explants en utilisant une pointe de filtre préalablement mouillée sur une micropipette P-200. Pour explants de E12.5, couper l'extrémité de la pointe pour élargir l'ouverture. NOTE: En routine, et si les embryons ont le même génotype, effectuez les étapes 6 et 7 sur tous les embryons, lan 9-11, et enfin 12 et 13.

3. Placage et de la Culture de la thyroïde explants

1. Laver les explants par transferts successifs dans trois puits d'une plaque à 24 puits contenant 1 ml de milieu de culture préchauffé (= M199 supplémenté avec des antibiotiques, de la glutamine et 10% de sérum de veau foetal).
2. Placage de lobes thyroïdiens sur enrobés microscopie chambres de culture en plastique:
   1. Aspirer le milieu de culture M199 à partir des chambres revêtues.
   2. Soigneusement, transférer les explants de la thyroïde dans les chambres de culture à l'aide d'une micropipette et pointes à filtre. Placez une explantation dans le centre de chaque chambre.
   3. Retirer l'excès de milieu et placer la chambre de culture dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO ₂₎ pendant 2 heures pour laisser les explants attachent à la matrice.
   4. Ajouter lentement de 200 à 300 ul de milieu de culture préchauffé à chaque puits.
   5. Incuber la culture à long terme dans l'incubateur de culture tissulaire.
3. Plaquage orégion de la trachée de f ou de la thyroïde lobes sur les filtres semi-poreux:
   1. Remplissez le nombre de puits d'une plaque de 24 puits avec 330 pi nécessaire de milieu de culture préchauffé.
   2. filtres de place (par exemple 0,4 um filtre Millipore) sur le support, en prenant soin d'éviter le piégeage de bulles d'air au-dessous du filtre de la culture.
   3. Soigneusement, en utilisant une micropipette et pointes à filtre, transférer les explants de la thyroïde avec un volume minimal de support sur le centre des filtres (de 4/filter maximum).
   4. Éliminer l'excès de fluide et de l'espace sur les explants avec une aiguille de tungstène.
   5. Incuber la culture à long terme dans l'incubateur de culture tissulaire. REMARQUE: les changements du milieu de culture tous les deux jours sous la hotte à flux laminaire. Culture des explants jusqu'à 7 jours.

4. Tout le montage immunofluorescence protocole de coloration pour la thyroïde explants

Déloger explants cultivés sur des filtres (après l'étape 2 ci-dessous) à l'aide d'aiguilles ou de tungstènepinces fines et transfert dans une plaque de 24 puits pour toutes les étapes, sauf pour le primaire (étape 5) et secondaire (étape 7) incubations d'anticorps (plaque 96 puits). Pour explants adhérentes en culture sur des chambres de plastique de microscopie, effectuer toutes les étapes dans les chambres de culture.

1. Aspirer M199 milieu de culture et fixer l'expiant avec glacée paraformaldéhyde 4% (PFA) pour 20 min (500 pi dans un plat de 24 puits et 300 pi dans des lames de microscopie).
2. Laver 2x 10 min dans une solution saline tamponnée de Tris avec du Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de Triton X-100) à la température ambiante.
3. Traiter les explants immédiatement ou conserver à -20 ° C. NOTE: Pour le stockage à long terme à -20 ° C, déshydrater les explants dans du methanol, en augmentant progressivement la concentration de methanol dans du TBST pour atteindre 100% de methanol. Lorsque vous êtes prêt à continuer avec l'immunomarquage (étape 4), réhydrater les explants en ajoutant progressivement TBST au méthanol.
4. Remplacer TBST avec la solution de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du TBST) Et incuber sur une bascule mer-scie pendant 30-60 min à température ambiante.
5. Diluer l'anticorps primaire dans la solution de blocage (100-200 pi par l'état). Transférer les explants de «filtre» à partir d'une plaque de 24 puits à une plaque de 96 puits. Incuber les explants avec des anticorps primaires sur une bascule mer en dents de scie durant la nuit à 4 ° C.
6. Le lendemain, jeter la solution d'anticorps primaire, transférer les explants de "filtre" de retour dans une plaque de 24 puits et laver au moins cinq fois avec TBST sur une bascule mer-scie pendant 45-60 min chacun à température ambiante.
7. Diluer l'anticorps secondaire (par exemple de chèvre anti-X-Alexa Fluor à 1:2000 dilution) dans du TBST contenant 1% de sérum de chèvre normal et incuber les explants avec cette dilution pendant une nuit sur ​​une bascule de mer scie à 4 ° C et dans l'obscurité. Pour contre-coloration nucléaire, inclure une ug / ml de bis-benzimide (Hoechst) conjointement avec la solution d'anticorps secondaire.
8. Le lendemain, jeter la solution d'anticorps secondaire et laver 5x avec TBST sur une mer-scierocker pendant 45-60 min chacun à température ambiante. Au cours des lavages, garder les explants dans l'obscurité.
9. Effectuer un lavage supplémentaire dans TBST remuant doucement pendant une nuit à 4 ° C dans l'obscurité.
10. Postfix Les explants immunocolorées dans 4% PFA à 4 ° C pendant 10 min.
11. Laver 2x 10 min avec du TBST.
12. Transférer les explants soit progressivement dans le methanol à 100% pour le stockage à long terme à -20 ° C, ou à analyser immédiatement. Pour explants cultivés sur les filtres, et immunocolorées dans une plaque de 24 puits, transfert dans une chambre de microscopie (par exemple LabTek ou Ibidi) avec TBST ou mieux un milieu de montage fluorescent avant l'analyse avec un multiphotonique ou microscope confocal.

5. Extraction d'ARN à partir de la thyroïde

Travailler dans un environnement exempt de RNase. Par conséquent, utiliser de l'acide nucléique et la nucléase libre embouts de pipette et nettoyer les deux banc et de l'équipement de contaminants et RNases. Ce protocole est basé sur un mélange phénol / chloroforme, effectuer la première étapes (1 à 7) sous une hotte chimique.

1. Homogénéiser un explant de la thyroïde ou deux lobes de la glande thyroïde avec 300 ul de solution d'extraction d'ARN à l'aide d'un pilon jetable pour 1,5 ml tube. Entre échantillons, laver le pilon dans 2% de SDS, puis de l'eau, puis de l'éthanol.
2. Ajouter 100 ul de solution d'extraction d'ARN, vortex 10 sec et incuber à température ambiante pendant 10 min.
3. Vortex pendant 30 secondes et ajouter 20 ng d'ARNt pour chaque échantillon.
4. Vortex pendant 1 min et ajouter 80 ul de chloroforme.
5. Vortex vigoureusement pendant 30 secondes et incuber 15 min à température ambiante.
6. Spin pendant 15 min à 19 000 xg dans un (4 ° C) centrifugeuse réfrigérée.
7. Transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure incolore dans un nouveau tube contenant 20 pg de glycogène coprécipitant.
8. Vortex et ajouter 200 ul d'alcool à 100% de l'isopropanol.
9. Vortex vigoureusement pendant 15-30 secondes et laisser ARN précipité à -20 ° C pendant 2-3 heures ou à -80 ° C pendant 1 heure.
10. Spin pendant 30 min à 19 000xg à 4 ° C, et éliminer le surnageant.
11. Laver le culot avec 450 pi de froid de 75% d'éthanol et vortex pour déloger le culot.
12. Spin pendant 10 min à 19 000 xg à 4 ° C, et éliminer le surnageant.
13. Sécher le culot sous le capot pendant 5 min.
14. Reprendre le culot avec 10 ul d'eau exempte de RNase et incuber 10 min à température ambiante.
15. Essai concentration d'ARN, conserver à -80 ° C ou transcription inverse de l'analyse de l'expression des gènes.

Résultats

anlages de la thyroïde (de la ligne médiane et UB, avec les tissus environnants), et des lobes de la glande thyroïde sont disséqués à partir d'embryons de souris à E12.5 et e13.5/e14.5, respectivement (figure 1). Au bout d'une journée dans la culture sur filtre, l'ébauche de la ligne médiane est visible (Figure 2A) en tant que tissu allongé s'étendant au-dessus de la trachée. Il se forme progressivement deux lobes de chaque côté de la trachée. Si lobes thyroïdiens isolés (E13.5 E14.5) o...

Discussion

Ce document décrit une méthode pour disséquer et de culture des explants de la thyroïde (E12.5) ou lobes (E14.5) afin d'étudier et de mieux comprendre les événements complexes conduisant à la formation de la thyroïde. En raison de la double origine de la ébauches de la thyroïde (le bourgeon de la ligne médiane et les deux corps ultimo-latérales), et leur petite taille, un fragment de tissu de E12.5 rostrale localisée aux artères du pharynx arc, et contenant la trachée, mais pas l'œsophage est microdissection. Co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
µ ;-lame 8 puits, ibiTreat, culture tissulaire traitée,	stérile proxylab	80826
Collagène de type I, queue de rat	Millipore	08-115
Fibronectine du plasma humain	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Fil de tungstène	Goodfellow	LS237450
insert de plaque de culture (12 mm de diamètre)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadhérine	BD Biosciences	610182	1/1 000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261