Statique Essai d'adhésion pour l'étude de l'intégrine activation dans les lymphocytes T

Summary

Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.

Abstract

L'adhérence des lymphocytes T sont nécessaires pour de multiples fonctions de cellules T, y compris la migration vers les sites d'inflammation et la formation de synapses immunologiques avec des cellules présentatrices d'antigène. Les cellules T accomplir adhérence régulée en contrôlant les propriétés adhésives des intégrines, une classe de molécules d'adhésion cellulaire hétérodimères constitués de paires de protéines transmembranaires qui interagissent avec les molécules cibles sur des cellules ou des partenaires de la matrice extracellulaire. L'intégrine la plus importante des cellules T est la fonction lymphocytaire antigène associé (LFA) -1, composé de sous-unités β2 et aL, dont la cible est la molécule d'adhésion intracellulaire (ICAM) -1. La capacité d'une cellule T pour contrôler l'adhérence provient de la capacité à réguler les états d'affinité des intégrines individuelles. Signalisation inside-out décrit le processus par lequel des signaux à l'intérieur d'une cellule provoquent les domaines externes de intégrines à assumer un état activé. Une grande partie de notre connaissance de ces phénomènes complexes est basée sur mécanisteDes études effectuées dans simplifiée dans des systèmes de modèles in vitro. Le test d'adhésion des lymphocytes T décrit ici est un excellent outil qui permet aux cellules T à adhérer à des molécules cibles, dans des conditions statiques, puis utilise un lecteur de plaque fluorescente de quantifier l'adhérence. Ce dosage a été utile dans la définition de l'adhérence des substances stimulant ou inhibiteur qui agissent sur les lymphocytes, ainsi que la caractérisation des événements de signalisation impliquées. Bien que décrit ici pour LFA-1 - ICAM-1 médiée adhérence; ce dosage peut être facilement adapté pour permettre l'étude d'autres interactions adhésives (par exemple, VLA-4 - fibronectine).

Introduction

L'adhérence des lymphocytes T est un processus fondamental dans la réponse immunitaire ^1. Il est nécessaire pour l'interaction des lymphocytes T avec les cellules endothéliales décorer les parois capillaires, pour l'antigène des cellules présentatrices de balayage (APC) à l'intérieur des ganglions lymphatiques, et pour la formation de synapses immunologiques (IS) avec des cellules cibles ^2. Ces exigences sont fonctionnellement distincte et cinétique. Le processus de lymphocytes extravasation se compose de la chimio-attraction, roulement, adhérence ferme et la transmigration. La transition de roulement pour raffermir l'adhérence des lymphocytes T nécessite de répondre à un signal de récepteur couplé à la protéine G rapidement. Cette réponse donne une interaction ligand des intégrines qui ralentit et arrête la cellule de roulement ^3. Un changement immédiat dans avidité intégrine médiatise ce processus. Migration nécessite interactions betweenTcells dynamiques et les cellules endothéliales avec la formation d'adhérences à l'extrémité avant »et la rupture des adhérences à l'extrémité arrière 'avec un intervalle d'environ une minute entre la formation et la rupture ^4. L'IS forme inminutes, mais doit rester intact pendant des heures ^6.

Fait intéressant, une molécule d'adhérence, la fonction des lymphocytes membre de la famille des intégrines antigène associé (LFA) - 1, est essentiel pour tous ces processus ^5. LFA-1 médie l'adhésion grâce à des interactions avec plusieurs membres de la superfamille des immunoglobulines. Le ligand le plus largement étudié avec la plus forte affinité pour le LFA-1 est la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1. Lymphocytes circulants non activés expriment une faible affinité de LFA-1 sur la surface cellulaire, et par conséquent ne peuvent pas adhérer à des surfaces ICAM-1-enduit. LFA-1, l'affinité est variable et régulée par plusieurs événements de signalisation telles que la protéine G couplée activation du récepteur, la stimulation de cytokines, et des signaux médiés par des récepteurs de cellules T (TCR). L'forme de haute affinité résultant de LFA-1 transmet activation intracellulaire vers l'espace extracellulaire trâce interactions avec ICAM-1. Cette voie est appelée inside-out signalisation ^7. De même, la signalisation par LFA-1 de l'espace extracellulaire est appelé en dehors dans la signalisation.

Le intracellulaire cascades impliqués dans l'envers et à l'extérieur dans la signalisation de signalisation sont un axe majeur de la recherche actuelle. La petite GTPase Rap1 a récemment émergé comme l'élément clé de l'intérieur-out signalisation qui est commun aux deux ligature TCR et de signalisation ⁸ cytokine. Le rôle essentiel des Rap1 dans l'activation des intégrines est mis en évidence par la découverte que la surexpression de Rap1 stimule l'adhérence de l'intégrine-dépendant des cellules T, tandis que l'adhésion des cellules T est bloqué par l'expression d'Rap1 dominant négatif ^9. Ces avancées dans notre compréhension de la régulation de l'intégrine par Rap1 ont été réalisées en utilisant des outils in vitro. Parmi eux se trouve l'analyse de l'adhérence statique décrit ici.

L'objectif global de cette méthode est d'étudier Tcellule adhérence à ICAM-1 des surfaces revêtues. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer objectivement et quantifier l'affinité de LFA-1 vers ses homologues de ligands dans les cellules vivantes au temps réel, dans différentes conditions. Cette technique utilise des puits de polystyrène revêtus d'ICAM-1 pour imiter les surfaces cellulaires que les cellules T interagissent avec. De nombreux tests d'adhésion sur les cellules T ont été décrites précédemment statique expérimentalement complexe. Ces dosages souvent requis pour les cellules T à être marquées de façon radioactive, utilisés cellules cornéennes bovines en culture pour créer une matrice extracellulaire comme substrat pour T adhésion cellulaire, ou appelé à la stimulation des cellules T non-physiologique pendant une durée prolongée, de promouvoir T adhésion cellulaire ^10. L'utilisation de la mesure fluorométrique pour quantifier les lymphocytes T suite à l'incubation de l'adhérence est une méthode plus sensible et précise de la quantification par rapport à la cytométrie en flux et la microscopie, qui sont utilisés dans de nombreux autres systèmes de dosage ^11. En outre, par microscopie de cellule uniqueic analyse de l'intégrine localisation ne permet pas de la large population sur la base de l'analyse de la même manière que la mesure fluorométrique. Alors que l'activation de LFA-1 anticorps spécifiques de l'Etat sont disponibles dans le commerce, ces anticorps offrent une faible sensibilité par rapport à la méthode décrite ici. Le principal avantage par rapport aux techniques alternatives est sa simplicité et la possibilité d'examiner de multiples conditions expérimentales simultanément. Lors de l'examen de cette méthode pour une application spécifique, il faut prendre en compte que les cellules T doivent être sélectionnés négativement, fraîchement isolées, et marqué avec un marqueur fluorescent.

Protocol

Une. Enrobage du puits de microplaques

Remarque: Le but de cette étape est de recouvrir les surfaces de polystyrène avec ICAM-1 pour servir de ligands pour les cellules T de LFA-1.

1. Préparer les solutions suivantes:
   1. Préparer la solution de revêtement par remise en suspension recombinante d'ICAM-1 avec un tampon phosphate salin (PBS) (137 mM NaCl, KCl 2,7, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) enrichi en calcium (1 mM CaCl ₂₎ et de magnésium (MgCl 2 nM _2). Assurez-vous que la concentration finale de ICAM-1 est de 10 pg / ml, faites partir d'une solution de 0,7 mg / ml et conservé dans un congélateur à -80 ° C.
   2. Préparer la solution d'adhérence par l'enrichissement du PBS avec 0,5% de l'homme (ou bovine) de sérum-albumine (HSA / BSA), 2 mM de _MgCl2, et 1 mM de _CaCl2.
   3. Préparer la solution de lavage par addition de 2 mM de _MgCl2 et 1 mM de CaCl ₂ à PBS. Réchauffer toutes les solutions à 37° C avant utilisation.
2. Laver les puits avec 24 50 ul de solution de lavage. Il s'agira notamment de puits non lavés, (PMA cellules traitées) positifs et négatifs (puits non revêtus) Commandes. Pour chaque condition énoncée au moins trois puits (triple).
3. Ajouter 50 ul de solution de revêtement dans chaque puits. Ne pas ajouter aux puits témoins non revêtus. Incuber pendant une heure à l'intérieur 37 ° C incubateur.
4. Aspirer la solution de revêtement en douceur, sans permettre à la pointe de toucher le fond des puits. Laver une fois avec 50 ul de solution de lavage.
5. Ajouter 50 ul de solution d'adhérence et incuber la microplaque pendant une heure à l'intérieur de 37 ° C incubateur.
6. Aspirer délicatement et laver une fois avec 50 solution de lavage ul. Utilisation de la plaque, le même jour, cependant, il est possible de le maintenir à 4 ° C pendant une nuit, et l'utiliser le jour suivant.

2. Cellules T Isolation de sang

1. Ajouter T enrichissement cellulaire humaine cocktail à 50 pl / ml of sang entier (par exemple pour 3 ml d'anticoagulant (héparine, EDTA, ou citrate) sang total, ajouter 150 ul de cocktail). Mélangez bien.
2. Incuber 20 min à température ambiante.
3. Pour un tube à centrifugation de 50 ml ajouter 3 ml de sang traité et d'un volume égal de PBS (sans calcium ni magnésium) enrichi avec 1% de D-glucose à température ambiante. Mélanger doucement avec une pipette Pasteur.
4. Ajouter 15 ml de Ficoll-Paque PLUS pour le tube de centrifugation.
5. Superposer soigneusement les 6 ml dilué un échantillon de sang sur le milieu d'isolement des lymphocytes.
6. Centrifugeuse à 400 g pendant 20 min à 20 ° C avec de brisure.
7. Prélever la couche supérieure à l'aide d'une pipette Pasteur propre, en laissant la couche de lymphocytes non perturbée à l'interface. La couche supérieure de plasma peut être conservé pour une utilisation ultérieure. Aide d'une pipette Pasteur propre transférer la couche de lymphocytes à un tube à centrifuger propre.
8. Ajouter 3 volumes (9 ml) de PBS pour les lymphocytes. Suspendre les cellules par doucement draaile eux dans et hors d'une pipette Pasteur.
9. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à 20 ° C.
10. Retirer le surnageant. Les lymphocytes devraient maintenant être suspendus dans le milieu approprié à l'application. Transférer les cellules dans un ballon de culture T-75 dans 20 ml du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine.

3. Préparation des cellules

Remarque: Une condition préalable est que les cellules devant être étiquetés avec un réactif fluorescent. Dans ce protocole utiliser carboxy succinimidylester fluorescéine (CFSE), la protéine fluorescente cependant verte (GFP) des cellules exprimant sont une alternative acceptable.

1. Comptez 2,4 x 10 ⁶ cellules T (1 x 10 ⁵ pour chaque puits) en utilisant un hématimètre.
2. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture dépourvu de sérum (de privation de sérum). Incuber les cellules pendant 2 heures dans le 37 ° C incubateur.
3. Centrifuger les cellules pendant 5 min (400 x g). Aspirer les médias etremettre en suspension dans 1 ml de PBS.
4. Ajouter CFSE à 1:1000 dilution (bouillon à base de 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante.
5. Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de PBS 37 ° C et centrifuger à 400 g pendant 5 min.
6. Re-suspendre culot de cellules avec 1,2 ml de la solution d'adhérence préchauffé (1 x 10 ⁵ cellules par 50 ul).

4. Stimulation des cellules

Remarque: Afin de lancer l'adhérence, les cellules doivent être stimulées. Dans l'expérience suivante, les cellules sont stimulées par l'intermédiaire du TCR l'aide d'anticorps anti-CD3 de reticulation, mais soluble SDF-1 pourrait servir d'alternative. Selon le but des expériences, divers réactifs pharmacologiques pourraient être ajoutés avant ou pendant la stimulation d'étudier l'impact sur l'adhésion cellulaire. Phorbol myristate acétate (PMA) est un ester de phorbol qui est structurellement similaire à la deuxième glycérol messager diacylique (DAG) et active la kinase multiple doncs en aval de la TCR (principalement la protéine kinase C); ici, il est utilisé comme contrôle positif.

1. Réchauffez la microplaque à 37 ° C.
2. Diviser les cellules vides dans 8 tubes de 1,5 ml (150 pl dans chaque tube), un tube pour chaque condition.
3. Traiter les cellules en conséquence:
   1. Stimuler un tube avec de la PMA à 10 ng / ml pour servir de témoin positif. Maintenir trois tubes non traité, pour servir de témoin pour la stimulation ("pas de stimulation"), le contrôle de chargement non lavé ("pas de lavage"), et le contrôle de ICAM-1 revêtement («non couché»).
   2. Stimuler quatre tubes avec différentes concentrations d'anticorps anti-CD3 (0,1, 1, 5 et 10 pg / ml). Passez à l'étape suivante sans retard.
4. Aliquotes de 50 pi de mélange de cellules stimulées dans chaque puits vide. Le nombre final de cellules par puits est de 1 x 10 ^5.
5. Placer la microplaque à 37 ° C incubateur pendant 15 min.
   Remarque: Certaines lignées de cellules T nécessitent une stimulation plus courte temps de tion. Pendant ce temps, les cellules se déposeront au fond du puits et de se conformer aux ligands cibles.

5. Laver à l'extérieur des cellules non-adhérentes

Remarque: Le but de cette étape est d'éliminer les cellules qui ne sont pas capables de former des contacts étroits avec les surfaces revêtues de ligands. Utiliser une pipette multicanaux pour cette étape afin de faire en sorte que les mêmes forces physiques sont appliqués à tous les puits. Il est important de conserver les puits témoins non lavées indiqués pour aider au calcul du pourcentage de cellules adhérentes.

1. Ajouter 150 ul de solution d'adhérence à chaud chacun des puits. Secouer doucement la plaque pendant quelques secondes avant de retirer le support des puits. Ne pas toucher le fond des puits avec les conseils.
2. Répétez cette étape trois fois. Changer le sens de la pipette lors du pipetage du tampon et de sortie.

6. Détermination du pourcentage de cellules adhérentes

_content "> Remarque: Dans cette étape d'un lecteur de plaque fluorescente est utilisé pour mesurer l'intensité de fluorescence dans chaque puits L'intensité est en corrélation directe avec le nombre de cellules adhérentes..

1. Allumez le lecteur de plaque. Ouvrez le logiciel de lecture de plaque en cliquant sur l'icône de raccourci sur le bureau.
   1. Dans le menu "Groupe", cliquez sur "Nouveau" pour créer un nouveau protocole.
   2. Dans le menu "Actions", choisissez l'option "Lire". Cliquez sur "l'intensité fluorescente" et cliquez sur l'onglet "Ok".
   3. Du menu déroulant, sélectionnez "onde d'excitation 485» et «longueur d'onde d'émission 528". Hit l'onglet "Ok".
   4. Dans le menu d'option "optique", sélectionnez "Bas" et cliquez sur l'onglet "Ok". Retour au menu "Actions" et régler la température à 37 ° C et cliquez sur "Ok".
   5. Insérer la microplaque dans le lecteur de plaque etcliquez sur "Exécuter". Le résultat sera exporté dans Excel feuille de calcul.
2. Calculer le pourcentage de cellules adhérentes en utilisant la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les puits lavés) / (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les cellules non lavés) x 100%.

Results

Ci-dessous est un exemple d'analyse de l'adhérence en utilisant des cellules T primaires stimulées avec diverses concentrations d'anticorps anti-CD3. Il est utile de connaître la fluorescence des cellules sales (c'est à dire de la charge totale). Cellules non stimulées servent de témoin négatif et les cellules traitées sont des PMA le contrôle positif pour les anticorps anti-CD3. Cellules étalées dans des puits non revêtus servent de contrôle pour ICAM-1. Dans une expérience typique, le pourcentage de cellules ...

Discussion

Il existe plusieurs tests pour étudier les signaux de LFA-1 et l'activation T adhésion cellulaire ^12. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer LFA-1 affinité Etats dans les cellules vivantes en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement soit plié ou étendu LFA-1. Une des limites de cette méthode est qu'elle ne tient pas compte de l'avidité des intégrines. essais de migration sont des outils utiles, mais ils mesurent la migration, et non adhérence maigre à un point de tem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lecteur de plaques	BioTek	Synergy H1 Hybrid
Pipette multicanaux	Fisher	21-377-829
Microplaque 96 puits avec fond optique	Corning Costar	3603
Recombinant ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anticorps anti-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
Sondes moléculaires	CFSE	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS contenant du calcium et du magnésium	Gibco
Lymphocytes périphériques	par exemple souris ou humain
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	499609
logiciel Open Gen 5	BioTek	Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Tubes à centrifuger de 15 et 50 ml	Fisher	352099, 352070
Pipettes Pasteur jetables en plastique	Fisher	13-711-7M
Fioles de culture T-75	Fisher	50-754-1366
RosetteKit d’encerclement de cellules T SepSep	StemCell Technologies	15061