La mesure du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l'isolement de protoplastes et l'analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d'une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
La mesure de la perméabilité à l'eau Coefficient osmotique (P
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'étude des mécanismes de régulation PAQ est cruciale pour la compréhension des relations de l'eau, tant au niveau de la plante entière et cellulaire. Présenté ici est une méthode simple et très efficace pour la détermination du coefficient de perméabilité à l'eau osmosée (P f) dans des protoplastes végétaux, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques telles que les ovocytes de grenouille. La première étape de l'analyse est l'isolement de protoplastes à partir du tissu de la plante d'intérêt par digestion enzymatique dans une chambre avec une solution isotonique appropriée. La deuxième étape consiste en un test de provocation osmotique: protoplastes immobilisés sur le fond de la chambre sont soumises à une perfusion constante de départ avec une solution isotonique et suivis par une solution hypotonique. Le gonflement de la cellule est une vidéo enregistrée. Dans la troisième étape, les images sont traitées hors ligne pour donner des changements de volume, et l'évolution dans le temps des changements de volume sont corrélées avec l'évolution temporelle de la variation de la osmolarité de la chambre à fluide de perfusion, en utilisant une procédure d'ajustement de courbe écrit dans Matlab (la PfFit '), pour obtenir P f.
Introduction
L'absorption d'eau et le débit à travers les membranes cellulaires est une exigence fondamentale pour l'existence de l'usine à la fois au niveau de la plante entière et cellulaire. Au niveau cellulaire, les aquaporines (AQP) jouent un rôle clé dans la régulation du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de la membrane de la cellule 1-3.
A ce jour, plusieurs procédés ont été utilisés pour mesurer la f P endogène de protoplastes à partir de différents organes de la plante (par exemple les racines, le mésophylle, endoderme, etc., Examiné par Chaumont et a....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1 Préparation de solutions
- Préparer isotonique (600 mOsm) et hypotonique (500 mOsm) des solutions contenant 10 mM de KCl, CaCl2 1 mM, et 8 M 2 (N-morpholine) d'acide -ethanesulphonic (MES), pH 5,7 et ajuster l'osmolarité avec les quantités appropriées d' D-sorbitol: 540 mm pour les isotonique et 440 mM pour la solution hypotonique. Vérifier l'osmolarité de la solution (à moins de 3% de la valeur cible) à l'aide d'un osmomètre.
- Préparer une pâte sèche de «mélange enzymatique» contenant les enzymes suivantes: 0,55 g cellulases, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polyvinylpyrrolidone K 30, 0,33 g de BSA (voir le t....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Afin de déterminer la P f et comparer l'activité des différents AQP, les protoplastes du mésophylle des feuilles de Arabidopsis sont utilisés. Ces protoplastes ont été trouvés à avoir de faibles basale (arrière-plan) des niveaux P f 7 et peuvent servir comme un système fonctionnel d'expression pour permettre des mesures P f reproductibles.
Protoplastes d'une feuille adulte à partir d'une ancienne usine d'Arabidopsis de 6 semaine.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Décrit ici est un procédé simple et très efficace pour la mesure de la P f de protoplastes végétaux isolés, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques, par exemple., Les ovocytes de grenouille 11. Cette méthode est basée sur la mesure de la P f en réponse à un défi osmotique de la cellule. A la différence des autres méthodes basées sur cette approche, cependant, le changement de solutions, à savoir, d'osmolarité, n'est pas instantanée, mais .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national belge pour scienti fi de la recherche (FNRS), l'Pôles d'attraction interuniversitaires Programme-belge Politique scientifique et les «Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" FC, de la Fondation Israël science Jérusalem ( ISF) à MM (Grant # 1311-1312), et à NM (Grant # 1312-1312).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Toute source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com N’importe quelle source, acide anal. |
| 2-(N-morpholine)-éthanesulfonique (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Toute source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com N’importe quelle source, anal. |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603< | a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A9418-5G | http:// www.sigmaaldrich.com |
| Sulfate de protamine | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylène cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Graisse silicone sous vide | lourde Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in. ? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=vrai& attachments=CoA |
| Microscope inversé ; | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Pompe péristaltique | BIO-RAD | EP-1 Econo ; Pump | http://www.bio-rad.com |
| Appareil photo numérique en niveaux de gris | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver' plugin pour ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Logiciel libre | |
| ImageJ | NIH | a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/ Logiciel libre | |
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connecteurs, collecteur | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html ? ACTION=S | |
| Sets de perfusion Burette (colonnes) | Welford | IF-BR-001 | |
| http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M emballage Scotch tape 1'', transparent | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8 tout ruban adhésif transparent (ruban adhésif, etc.) est susceptible d’être acceptable |
Références
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
