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Évaluation non invasive de la Cardiac Malformations en auto-immune expérimentale myocardite par résonance magnétique microscopie imagerie chez la souris

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DOI :

10.3791/51654

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20 juin 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude démontre l’établissement réussi de l’imagerie par microscopie par résonance magnétique en tant qu’outil non invasif pour évaluer les anomalies cardiaques chez les souris atteintes de myocardite auto-immune. Les données indiquent que la technique peut être utilisée pour surveiller la progression de la maladie chez les animaux vivants.

Résumé

La myocardite est une inflammation du myocarde, mais seulement environ 10% de ces manifestations cliniques montrent affectées de la maladie. Pour étudier les réponses immunitaires de lésions cardiaques, différents modèles murins de myocardite ont été largement utilisés. Cette étude a porté expérimental myocardite auto-immune (EAM) induite par la myosine cardiaque chaîne lourde (MyHC)-α 334-352 chez la souris A / J; les animaux atteints développent une myocardite lymphocytaire mais sans signes cliniques apparents. Dans ce modèle, l'utilité de la microscopie par résonance magnétique (MRM) en tant que modalité non invasive pour déterminer les changements structurels et fonctionnels cardiaques chez les animaux immunisés avec des α-myosine de 334 à 352 est représentée. EAM et souris saines ont été imagées par un 9.4 T (400 MHz) de 89 mm de balayage vertical de l'alésage de base équipé d'une radio-fréquence sonde d'imagerie 4 cm mille-pattes et 100 g / gradients de trois axes cm. Images cardiaques ont été acquis auprès des animaux anesthésiés à l'aide d'une séquence d'impulsions cine basée à écho de gradient, et l'animals ont été suivis par la respiration et l'oxymétrie de pouls. L'analyse a révélé une augmentation de l'épaisseur de la paroi ventriculaire chez les souris EAM, avec une diminution correspondante dans le diamètre intérieur du ventricule, en comparaison avec les souris saines. Les données suggèrent que des modifications morphologiques et fonctionnelles dans les cœurs enflammées peuvent être surveillés de manière non invasive par MRM d'animaux vivants. En conclusion, MRM offre un avantage de l'évaluation de la progression et la régression des lésions du myocarde dans les maladies provoquées par des agents infectieux, ainsi que la réponse aux traitements.

Introduction

L'insuffisance cardiaque est la principale cause de décès et la myocardite est une cause prédominante de l'insuffisance cardiaque chez les jeunes adolescents 1. La plupart des patients atteints de myocardite restent asymptomatiques et la maladie est spontanément résolues 2. Cependant, 10-20% des personnes touchées peut développer une maladie chronique, conduisant à une cardiomyopathie dilatée (DCM) 3. Divers modèles animaux ont été développés pour étudier la pathogenèse de la myocardite immunitaire. La maladie peut être induite dans la myocardite sensibles A / J et des souris Balb / c par immunisation d'animaux avec la myosine cardiaque chaîne lourde (MyHC)-α ou de ses fragments peptidiques immunodominants ou par infection avec des agents pathogènes comme les virus Coxsackie B3 9.4. Cette étude consiste à MyHC-α myocardite 334-352 induite chez des souris A / J. Malgré montrant infiltrations du myocarde, les animaux de myocardite touchés semblent cliniquement normaux; diagnostic est basé sur l'évaluation histologique des coeurs pour l'inflammation 7 unee échocardiographie 10.

Microscopie par résonance magnétique (MRM) est une méthode couramment utilisée pour obtenir l'imagerie cardiovasculaire avec une haute résolution plans en trois dimensions, l'évaluation des détails fonctionnels permettant au niveau des vaisseaux sanguins minute (jusqu'à 10 um de diamètre), mais ce niveau de pouvoir de résolution est pas réalisable avec la formation d'image par résonance magnétique routine (MRI) de la procédure de balayage, dans lequel, la résolution est généralement obtenu jusqu'à 1 mm de 11 à 14. MRM offre un avantage car elle permet l'acquisition d'images à haute résolution et aussi pour obtenir des paramètres de performance dans les points de temps au début de processus de la maladie 14. Cliniquement, l'imagerie MRM a été largement appliquée pour étudier les paramètres de fonctionnement du malade cardiaque, pulmonaire ou cérébrale 15-17. Dans cette étude, l'utilisation d'une technique de MRM comme un outil non invasif pour déterminer des anomalies cardiaques par A / J souris atteintes de la myocardite auto-immune est signalée. Plus précisément, til imagerie par MRM permet la quantification de paramètres fonctionnels tels que le ventricule gauche (LV) du volume en fin de diastole et de la fraction d'éjection (FE) avec une précision raisonnable 18. Les définitions des paramètres respectifs sont les suivants: fin de LV volume télédiastolique, le volume de sang dans le ventricule gauche à la fin du cycle de diastole, et la fraction d'éjection, le volume systolique / volume en fin de diastole. L'analyse des données est réalisée en utilisant le logiciel sectoriel librement développé pour le traitement des images DICOM cardiovasculaires conforme acquises par les scanners à résonance magnétique 19. Les données ont révélé une augmentation de l'épaisseur de la paroi ventriculaire gauche dans les animaux myocarditic, correspondant à une diminution de la LV en fin de diastole volume, le volume d'éjection et de la fraction d'éjection, par rapport à ces paramètres fonctionnels chez les souris en bonne santé.

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Protocole

ÉTHIQUE DÉCLARATION:

Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l'Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. L'induction de myocardite auto-immune expérimentale

  1. Préparer la solution de peptide en dissolvant MyHC-α 334-352 1x dans une solution saline tamponnée au phosphate à une concentration finale de 2 mgs/1.5 ml.
  2. Préparer la toxine de pertussis (PT) par addition de 1 ml de PBS 1x stérile à un flacon contenant 50 ug de PT lyophilisé pour obtenir une concentration stock de 50 ng / ul. Prenez 20 pi de stock dans un tube de 1,5 ml stérile et ajouter 980 ul de PBS stérile 1x pour obtenir une concentration de travail de 1 ng / ul.
  3. Préparer l'adjuvant complet de Freund (CFA) en ajoutant 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (VTT) extrait de 10 ml de CFA pour obtenir une concentration finalede 5 mg / ml.
  4. Préparer l'émulsion peptide-CFA. REMARQUE: Pour EAM induction, l'émulsion peptide-CFA a été administré à 150 pi contenant 100 ug de myosine-α 334-352 par animal. Par exemple, pour immuniser des souris dix utilisent 1,5 ml de peptide-CFA émulsion contenant 1 mg d'α-myosine 334-352.
    1. Pour préparer 1,5 ml d'émulsion, aliquote de 750 ul de myosine-α 334-352 solution de peptide dans un tube de 1,5 ml, et CFA complétées par des VTT dans un autre tube de 1,5 ml. Utilisation d'un 3 ml seringue Luer-lok, aspirer la solution de peptide en premier, suivi par l'extrait CFA / VTT.
    2. Fixer la seringue à un robinet 3 voies et connectez l'autre sortie du robinet à un vide 3 ml seringue. Réglez la perméabilité du robinet d'arrêt de sorte que le mélange peptide-CFA flux d'une seringue à l'autre avec assez bonne résistance.
    3. Mélanger en appuyant sur le contenu d'une seringue à l'autre à plusieurs reprises ~ 1 min, puis placer la totalité de l'ensemble sur la glace pendant environ 3 min. Répétez cetteProcédure d'au moins 10x.
    4. Déterminer la compatibilité de l'émulsion en plaçant soigneusement un minuscule gouttelette de l'eau plate dans un bêcher de 100 ml en verre. La gouttelette ne devrait pas se disperser dans l'eau. Si c'est le cas, continuer à mélanger jusqu'à ce que la consistance désirée.
    5. Transférer le contenu de l'émulsion à partir de 3 ml de seringues dans 1 ml seringues Luer-Lok par le remplacement de l'une des deux seringues de 3 ml attachés au robinet d'arrêt de la seringue de 1 ml, et fixer une aiguille 27 ½ G à la seringue de 1 ml.
  5. Injecter 150 pi de l'émulsion peptide-CFA en doses fractionnées voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales de six à huit semaines femme âgée de souris A / J (~ 75 pi de chacun).
  6. Administrer 100 pi de suspension PT (100 ng) par voie intrapéritonéale à chaque animal le jour 0 et le jour 2 après immunisation.
  7. Répétez la procédure de vaccination le jour 7 en administrant 150 ul de peptide-CFA émulsion en doses fractionnées sous-cutanée dans chaque côté de til sternum (~ 75 pi de chacun). Préparer cette émulsion fraîche comme ci-dessus. Puis, le jour 21, soumettre les animaux à l'imagerie de la MRM, consultez l'étape 3.

2. Traitement des animaux

  1. Placez chaque souris dans une chambre d'induction de l'anesthésie mélange contenant isoflurane d'air de 2% avec un coussin chauffant placé en dessous pour maintenir la chaleur, et transférer l'animal à un détenteur d'animaux spécialement conçu (figure 1).
  2. Immobiliser l'animal en position couchée sur le support de l'animal de sorte que son nez s'insère dans le cône de nez pour maintenir l'anesthésie (figure 1). Fixer la tête de la souris avec une morsure-bar attenant à dents avant de la souris.
  3. Mettre en marche le dispositif de chauffage par soufflage d'air avec son tuyau d'évacuation inséré dans l'alésage vertical du scanner afin de maintenir la température du corps de l'animal au cours de l'expérience.
  4. Maintenir l'anesthésie à 0,5 à 2% d'isoflurane avec un débit de 2 ml / min pendant toute la session de formation d'image. Confirmeranesthésie selon la méthode orteil de pincement, pas de mouvement prévu.
  5. Mettre en place un capteur pneumatique d'oreiller, la queue de souris / cheville impulsion de capteur à fibre optique d'oxymétrie, et la sonde de température rectale de surveiller la respiration, la fréquence cardiaque et la température corporelle, respectivement (Figure 1). Remarque: la synchronisation cardiaque est effectuée par oxymétrie de pouls, qui permet une surveillance non invasive de la saturation artérielle en oxygène du sang. Le capteur d'oxymétrie de pouls doit être fixée à la cheville gauche, et le pied doit être effectuée avec une boucle de fil et du ruban adhésif afin de maintenir la cheville dans le capteur. Imagerie en MRM est atteint par gating la respiration et des signaux cardiaques, sans l'utilisation de tout agent de contraste.

3. Acquisition de l'image

  1. Après la préparation de l'animal (Figure 1), placer la souris dans le centre du dispositif de balayage MRM avec le coeur placé dans le centre du champ de vision (FOV), où l'homogénéité du champ magnétique est maximale. NOTE: Un grand alésage(89 mm) 9.4 T aimant vertical alésage équipé avec des dégradés de trois axes de 100 g / cm et un 4 cm de radio-fréquence (RF) de la bobine d'imagerie doit être utilisée pour obtenir haute résolution en trois dimensions (3D) des images. Remarque: Assurez-vous de fournitures non-magnétiques en utilisant un scanner IRM.
  2. Exécutez l'interface d'imagerie et sélectionnez "Nouvelle étude" dans le menu "Options étude". Tapez "mtune" à la barre de commande et exécutez-le pour tirer vers le haut le «Tune GUI". Ensuite, sélectionnez "Démarrer sonde Tune" et cliquez sur le bouton "Autoscale". Le Tune GUI changera pour montrer la RFsignal. Utiliser les boutons syntoniser / match à distance à la fin de la bobine pour régler la de bobine à radiofréquence à la fréquence de résonance du proton (400 MHz). Dans l'onglet "Démarrage" aller à la page «Prévisualisation» pour lancer l'étalonnage de la fréquence et de la puissance en cliquant sur les boutons associés. Cliquez sur le bouton XYZ (rapide) sur la "onglet" Shim étude 'onglet à tirer vers le haut la page de calage.Aller à la page de cale, sélectionnez toutes les itérations, et cliquez sur le bouton de cale pour effectuer un calage automatique.
  3. Sélectionnez une séquence de scout de l'onglet «étude» de l'interface d'imagerie pour localiser le cœur de souris. Dans l'onglet "Acquisition" changer le FOV de 35 mm 2 et de garder les paramètres par défaut de la machine. Cliquez sur Démarrer pour exécuter la séquence; ajuster la position de la porte de l'animal si le cœur n'est pas dans le centre de FOV, réaccorder la bobine RF et obtenir les images de repérage de nouveau.
  4. Cliquez sur le bouton de séquence "GEMS" sur l'onglet "étude" puis entrez les paramètres d'acquisition sur l'onglet correspondant "Acquérir" pour obtenir deux plans orthogonaux le long de l'axe court et à long axe du cœur 20,21. REMARQUE: les paramètres d'acquisition typiques pour une analyse en écho de gradient sont: l'épaisseur de la tranche, 1 mm; temps de répétition (TR), 200 ms; temps d'écho (TE), 2,67 ms (minimum); angle de bascule, 25 °; inplane taille de la matrice, de 128 x 128; FOV, 22 mm2; certain nombre d'acquisitions, 4; et un temps d'acquisition d'environ 1 min et 30 sec.
  5. Dans l'onglet "Adv", sélectionnez la séquence "CINE" pour recueillir les oxymétrie de pouls-dépendants court axe ciné images IRM afin de mesurer les paramètres anatomiques et fonctionnels BT. Ajustez la position et l'angle des tranches d'imagerie basée sur la vue grand axe du cœur par le vol stationnaire de la souris et en faisant glisser. Entrez les paramètres d'imagerie suivants sur l'onglet "Acquisition" pour obtenir la séquence de ciné en écho de gradient: TR 500 ms; TE, 5 ms; FOV, 22 mm 2; matrice d'acquisition, 256 x 256; épaisseur de coupe, 1 mm; certain nombre d'acquisitions, 8; nombre de cadres, 6; et un temps d'acquisition de ~ 17 min. Cliquez sur Démarrer pour commencer l'acquisition.
  6. Convertir les images au format DICOM acquises à l'aide de l'onglet "I / O" du logiciel d'imagerie et de transférer les fichiers correspondants au centre de données pour le traitement.
  7. A la fin de la procédure d'imagerie, le toutomment les souris de se remettre de l'anesthésie dans les filtre-top cages. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal et les conserver pour d'autres études selon les besoins.

4. Analyse des données de résonance magnétique cardiaque Microscopie Imagerie

  1. Utilisez un logiciel de segment à analyser les paramètres anatomiques et fonctionnelles de la LV 19. En chargeant les images au format ciné DICOM dans le logiciel en utilisant le "Ouvrir un fichier d'image (s)" sous-menu du menu "Fichier". Sur l'interface utilisateur, sélectionnez 'MRGE »comme la technique d'imagerie," Cine », comme le type d'image et de« petit axe mi-ventriculaire », comme le plan de la vue de l'image.
  2. Préciser les délais pour être utilisé pour fin de diastole et systole fin par le "délai fixé actuelle à la fin de diastole" et "Set calendrier actuel pour mettre fin à la systole" sous-menus du menu "Edition" respectivement.
  3. Cliquez d'abord sur le bouton "LV" de commande, puis le "ENDO" et "PEV" boutons de commande sur le panneau en bas à droite pour dessiner manuellement l'endocarde du ventricule gauche et épicarde respectivement. Enlever les muscles papillaires en appuyant sur le bouton de commande correspondant afin d'augmenter la précision des calculs.
  4. Lire les paramètres BT chiffrés tels que le volume diastolique, le volume systolique, le volume systolique, et la fraction d'éjection sur le panneau en haut à droite. Cliquez sur le bouton de commande "Misc" puis sur le bouton "Mesure étrier" de commande pour mesurer les paramètres de BT tels que l'épaisseur de la paroi, et le diamètre du ventricule 22.
  5. Cliquez sur le "Save deux piles d'images et de segmentation" sous-menu du menu "Fichier" pour enregistrer les images, y compris les segmentations, dans «tapis». Format à retraiter les images si nécessaire.

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Résultats

Dans ce rapport, l'utilité de la technique MRM en tant que modalité non-invasive pour déterminer les changements structurels et fonctionnels dans les cœurs des animaux atteints de l'EAM est affiché. Myocardite a été induite chez des souris A / J par l'immunisation des animaux avec MyHC-α 334-352 en CFA 7, et les animaux ont été soumis à des expériences GRM 21 jours après la vaccination. L'imagerie par MRM a été effectuée sur des animaux vivants, sous anesthésie à l'isoflurane à 9,4 T (400 ...

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Discussion

Cette étude décrit la procédure de MRM et de son utilité comme outil non invasif pour déterminer des anomalies cardiaques chez des souris atteintes de myocardite auto-immune. Depuis les caractéristiques histologiques de l'EAM ressemblent myocardite postinfectious de l'homme, des modèles de souris sont couramment utilisés pour délimiter les mécanismes immunitaires de lésions cardiaques 23-25. Cependant, les animaux atteints de myocardite apparaissent cliniquement normaux, et le diagnostic est fait sur ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (HL114669). CM est récipiendaire d’une bourse de recherche postdoctorale accordée par la Myocarditis Foundation, NJ.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore at 4 ° ; C
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Magasin au 4 ° ; Extrait de C
MTB H37RvDifco Laboratories, Detroit, MI231141Store au 4 ° ; C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Magasin au 4 ° ; C
1x PBSCorning, Manassas, VA21-040-CVMagasin au 4 ° ; C
IsofluranePiramal Healthcare, Mumbai, IndeNDC66794-013-25
Souris femelles A/JJackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Luer-lok stérile 1 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309628
Luer-lok stérile 3 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309657
Aiguille stérile, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ
Aiguille stérile, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
robinet d’arrêt à 3 voiesSmiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Kerlix rouleaux de bandage de gazeCovidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Protouch StockinetteMedline Industries, Mundelein, IL30-1001
Ciseaux chirurgicaux stériles et pincesINOX outil Corporation
Micro-fourGE Healthcare,  ;
Système de thérapie chaud et froid ThermiPAQ  ;Theramics Corporation, Springfield, IL
Lampe chauffante pour reptilesEnergy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA
3M Bandes TransporeTarget Corporation, MN
Up and Up Up and Up Polymyxin B sulfate / Bacitracine / Néomycine sulfate de néomycine Pommade antibiotiqueTarget Corporation, MN
North Safety DeciDamp-2Bouchons d’oreille en moussePVC North Safety Produits, Smithfield, RI
Applicateur à pointe de coton, 6' ’ tige en bois  ;Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO
Chambre d’induction d’anesthésie  ;Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Summit Anesthesia Système de soutien pour la régulation du débit de l’anesthésie  ;Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Porte-animaux spécialement conçuAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Bickford  ; Omnicon F/Air  ; unité de filtre à gaz d’anesthésie  ;A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY
Module d’oxymètre de pouls, système de surveillance et de contrôle des petits animaux compatible avec l’IRM.Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Bouteille d’oxygène  ;Matheson-Tri Gas, zone centre-nord, Lincoln, NE
Régulateur de gaz  ;Western Medica, West Lake, OH
Module de rupture de signal, système de surveillance et de contrôle des petits animaux compatible avec l’IRMSmall Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
9,4 T (400 MHz) 89 mm d’alésage vertical Scanner IRMAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Bobine RF de micro-imagerie mille-pattes de 4 cmAgilent Technologies, Santa Clara, CA
Moniteur PCSAM Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Logiciel d’analyse d’images médicales quantitativeshttp://segment.heiberg.se ;   ; Segment v1.8 R1430,  ; Medviso, région d’Oresunds, Suède
Logiciel MatlabThe Mathworks, Inc.  ; Natick, MA
d’exploitation Computer-Unix
305195Système

Références

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Mots-clés

Imagerie IRM cardiaqueMod le murin de myocarditeS quence cin echo de gradientpaisseur de la paroi ventriculaireVolume t l diastoliqueMesure de la fraction d jectionvaluation cardiaque non invasiveAnalyse via le logiciel Segment

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