Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie

13.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/51666

⸱

24 juin 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie de cellules vivantes utilisant des cardiomyocytes néonatals primaires de rat après transduction lentivirale et adénovirale à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif. Cela permet d’observer en détail les processus cellulaires dans les cardiomyocytes vivants.

Résumé

Primaires de rat cardiomyocytes néonataux sont utiles dans de base en recherche cardiovasculaire vitro, car ils peuvent être facilement isolés en grand nombre en une seule procédure. Grâce aux progrès de la technologie de microscope, il est relativement facile de capturer des images de cellules vivantes dans le but d'enquêter sur les événements cellulaires en temps réel avec peu préoccupants concernant la phototoxicité aux cellules. Ce protocole décrit comment prendre des images en direct de timelapse de cellules de rat primaire cardiomyocytes néonataux l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif qui suit la transduction lentiviral et adénoviral de moduler les propriétés de la cellule. L'application de deux types de virus différents, il est plus facile d'atteindre un taux de transduction et l'expression des niveaux appropriés pour deux gènes différents. Images de cellules vivantes ainsi porté peuvent être obtenus en utilisant le système de mise au point automatique du microscope, qui maintient l'accent stable pour de longues périodes. En appliquant ce procédé, les fonctions de l'ingénieur de manière exogèneprotéines ed exprimés dans les cellules primaires en culture peuvent être analysés. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier la fonction des gènes par l'utilisation de siRNA ainsi que des modulateurs chimiques.

Introduction

Cardiomyocytes de rats nouveau-nés primaires ont longtemps été utilisés pour étudier la fonction des cardiomyocytes in vitro 1. Ils sont faciles à isoler de ratons par plusieurs méthodes bien établies 2-4. La méthode la plus courante utilise la collagénase ou la trypsine pour digérer le tissu conjonctif du coeur avant l'isolement des cellules. Les chercheurs ont également mis au point des méthodes d'isolement des cardiomyocytes de rongeurs adultes 5-8 ainsi que des souris néonatales 9,10.

Ce protocole décrit un procédé pour l'isolement des cardiomyocytes à partir de jeunes rats nouveau-nés, en employant une procédure digestion enzymatique en deux étapes. La trypsine est utilisée en premier O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée à 37 ° C. L'incubation du tissu cardiaque avec de la trypsine O / N à 4 ° C permet de réduire les mesures nécessaires pour la récolte des cellules par rapport aux méthodes utilisant des incubations séquentielles dans une solution chaude d'enzyme 2. En outre, en utilisant des co purifiéellagenase plutôt que enzymes brutes, la variabilité de lot à lot peut être éliminé, offrant ainsi une reproductibilité accrue.

Des études fonctionnelles d'une protéine particulière emploient souvent un système d'expression de protéine en utilisant un adenovirus 11 à 13 et / ou un lentivirus 14-16. [MISE EN GARDE] La production et la manipulation virale doivent être effectués selon les directives du NIH.

L'adénovirus ne s'intègre pas dans le génome de l'hôte. Il a une efficacité de transduction très élevée dans la plupart des types cellulaires, y compris les cellules se divisant et les cellules ne se divisant pas, ainsi que des cellules primaires et des lignées cellulaires établies. Cela rend l'adénovirus, un vecteur fiable pour l'expression génique. Des niveaux élevés de la protéine codée par le vecteur d'adénovirus se développent dans les 48 heures suivant la transduction, et ils peuvent durer plusieurs semaines 17. Cependant, un inconvénient de l'utilisation d'un adénovirus pour l'expression des protéines est que le développement d'un recombinant adenovirus est à la fois compliqué et prend du temps. Cet inconvénient explique en partie pourquoi de nombreux chercheurs se sont tournés vers des lentivirus pour l'expression du gène recombinant. Contrairement constructions adénoviraux, générant une construction lentiviral est rapide et facile. Bien que les lentivirus ont généralement des efficacités inférieures de transduction que les adénovirus, les cellules se divisant en deux et ne se divisant pas, ils ne s'intégrer dans le génome de l'hôte. Par conséquent, l'expression du gène transduit est plus stable que pour les lentivirus des adénovirus.

Grâce aux progrès technologiques dans le domaine de la microscopie, il est beaucoup plus facile de capturer des images de cellules vivantes des cellules exprimant des protéines recombinantes. Cela est vrai même à des vitesses de taux de la vidéo de l'acquisition. Ceci permet au chercheur de déterminer comment des modifications particulières à la protéine d'intérêt fonctionnellement impact sur la cellule en temps réel. Le microscope confocal à disque rotatif présente plusieurs caractéristiques qui en font une technique optimale pour live imagerie cellulaire 18,19. Le disque tournant Yokogawa permet beaucoup plus rapide acquisition d'image, tandis que dans le même temps en utilisant beaucoup moins de puissance du laser de balayage du point microscopes confocaux. Ces deux particularités sont dues au disque en rotation, qui contient de nombreux trous confocale par laquelle le laser passe simultanément aux échantillons. Lors de l'acquisition, le disque lui-même tourne rapidement et en continu 18-20. En utilisant le système de mise au point automatique du microscope, l'accent est maintenue stable sur de longues périodes de temps. Cela permet aux chercheurs de prendre des images de cellules vivantes bien ciblés. Les images acquises sont lues comme un fichier vidéo. Les images sont analysées en utilisant un logiciel d'analyse d'image tel que ImageJ 21,22, FIJI 23, ou un autre logiciel disponible dans le commerce.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Une. Isolement des cardiomyocytes de rats nouveau-nés

  1. Utilisation Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) et le milieu essentiel minimum (MEM) additionné de sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline / streptomycine (P / S) en tant que milieu de culture. Ajouter bromodéoxyuridine (BrdU) au milieu pour empêcher la croissance des fibroblastes pour les 2 premiers jours après l'isolement.
Base de support d' FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
sélection DMEM 10% 0 20
Le premier jour, DMEM 10% 0,1 10
Le jour suivant, DMEM / MEM 5% 0,1 10
En outre la culture DMEM / MEM 5% 0 10

Tableau 1:. Moyen pour rat cardiomyocytes néonataux Utilisez ce média pour la culture de cardiomyocytes de rats nouveau-nés. DMEM / MEM est de 1:1 mélange de DMEM et de milieu MEM.

  1. isolement des cardiomyocytes, Jour 1 (temps nécessaire estimé à 1 h)
    NOTE: Pour les travaux de rongeurs nouveau-nés, se référer aux directives et règles des universités locales fixées par les programmes de protection des animaux, et d'adhérer à des protocoles d'animaux institutionnellement approuvés. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du Centre des ressources animales de Yale.
    1. Préparer des réactifs et des outils: solution saline équilibrée de calcium et de magnésium sans Hank (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, sur la glace; 1 mg de trypsine, reconstitué avec 2 ml de HBSS CMF, sur la glace; outils autoclave; 70% d'éthanol (EtOH) dans bécher de 250 ml; quatre stérilisé 10 vaisselle en plastique de trois cm, pour l'isolement des coeurs et un pour la trypsine.
    2. Classement 1 litter des ratons 1 à 2 jours d'âge (environ 10 chiots) avec leur mère d'un distributeur animal expérimental.
    3. Jour 1, Transfert chiots de petite cage et euthanasier barrage avec un cocktail de kétamine / xylazine (kétamine, 200ml/10g et xylazine 20ml/10g) surdosage.
    4. Prendre un chiot et stériliser l'ensemble de son corps avec EtOH à 70%. Décapiter chiot avec des ciseaux chirurgicaux pointus bien entretenus sur un plat de plastique de 10 cm stérilisé à un endroit isolé des autres chiots.
      NOTE: Afin de recueillir les échantillons aussi rapidement que possible, il est préférable d'utiliser la méthode la plus rapide et efficace pour mettre fin à la vie du rongeur. Décapitation lorsqu'il est correctement utilisé par des professionnels qualifiés avec un équipement bien entretenu peut entraîner une moins peur et l'anxiété de l'animal et d'être plus rapide et plus pratique que d'autres formes d'euthanasie. Il est compatible avec les recommandations des vétérinaires Lignes directrices American Medical Association pour l'euthanasie des animaux.
    5. Retirez-il battreart avec des outils stérilisés, et mettre le cœur dans 30 ml de glace réfrigéré HBSS CMF dans 50 ml tube conique. REMARQUE: Retirez les coeurs aussi rapidement que possible et de les mettre sur la glace immédiatement. Après avoir enlevé le cœur de corps, toutes les procédures doivent être effectuées sur la glace.
    6. Collecter 5 coeurs dans 30 ml de glace réfrigéré HBSS CMF et les 5 coeurs restants dans 30 autres ml de glace réfrigéré HBSS CMF. Agiter le tube à rincer les cœurs. NOTE: Après cette étape, effectuer toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire.
    7. Jeter le surnageant et transférer les coeurs à une nouvelle stérilisé plat en plastique de 10 cm sur la glace. REMARQUE: Veillez à ne pas aspirer coeurs avec l'aspirateur.
    8. Retirer les grands navires et / ou de tissus indésirables. Ajouter 10 ml de glace réfrigéré HBSS CMF à l'antenne pour rincer les cœurs.
    9. Transférer tous les cœurs à une nouvelle stérilisé plat en plastique de 10 cm sur la glace. Émincer les coeurs avec des ciseaux à moins de 1 mm 3 sur la glace.
    10. Ajouter 9 ml de HBSS CMF réfrigérés. Ajouter 1 ml de trypsine réfrigérés reconstitutiontituée avec HBSS CMF (finale 50 ug / ml).
    11. Sceller le plat avec du parafilm et le couvrir de papier d'aluminium, puis placez-le dans une chambre froide (4 ˚ C) pendant la nuit.
  2. isolement des cardiomyocytes, Jour 2 (temps nécessaire estimé, environ 4 heures)
    1. Préparer des réactifs et des outils: 50 ml tube conique x 2; 2 mg inhibiteur de la trypsine, reconstitué avec 1 ml de HBSS CMF, sur la glace; 1500 unités de collagénase, reconstitué avec 5 ml de Leibovitz L-15, à la température ambiante (RT); Leibovitz L-15, reconstitué avec 1 litre d'eau stérilisée et filtrer à travers un filtre de 0,22 micron, 8 ml à la température ambiante; 10 mg / ml (32,6 mM) de BrdU dans l'eau; P / S; DMEM + 10% de FBS; MEM; deux boîtes de culture cellulaire de 10 cm en matière plastique; Plats de fond 3,5 cm de verre.
    2. Jour 2, la préparation de plats de gélatine enduit. Ajouter 1 ml de solution de gélatine à 0,1% pour revêtir un fond plat de 3,5 cm en verre pour une expérience d'imagerie. Incuber plats à 37 ˚ C pendant plusieurs heures, puis aspirer et jeter la solution de gélatine avant de l'utiliser.
      NOTE: Un plat de fond de 3,5 cm en verre est conçu pour une expérience d'imagerie utilisant un microscope à fluorescence. Pour l'extraction de protéines à partir de cardiomyocytes primaires pour détecter l'expression de protéine par transfert de Western (WB), des boîtes de culture cellulaire de 0,1% de gélatine revêtues de plastique peuvent être utilisés.
    3. Transférer tout le tissu cardiaque digéré par la trypsine pendant une nuit avec un tampon à un tube conique de 50 ml sur de la glace dans la hotte stérile. Ajouter 1 ml d'inhibiteur de trypsine dans du HBSS (CMF finale 182 ug / ml). Fermer le couvercle de 50 ml tube conique étroitement pour éviter la contamination.
    4. Incuber le tube pendant environ 30 min dans un incubateur à 37 ˚ C pour réchauffer le tissu et le tampon à 30-37 ˚ C. Ajouter 5 ml de collagénase dans Leibovitz L-15 (finale 94 unités / ml). Incuber à 37 ˚ C pendant 45 min en agitant doucement (170-200 rpm shaker à 37 ˚ C incubateur).
      REMARQUE: Cette étape peut être effectuée à l'extérieur de la hotte à flux laminaire. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées à température ambiante.
    5. Désinfecter l'extérieur d'un tube conique de 50 ml avec de l'EtOH à 70% et de mettredans la hotte stérile.
    6. tissus de triturer utilisant pipette automatique avec pipetage à 3 ml / sec de vitesse de 20 fois. Laisser les résidus de tissu se contenter de 3 min et filtrer le surnageant avec une um tamis cellulaire 70.
      REMARQUE: Une taille régulière pipette de 10 ml peut être utilisé pour la trituration.
    7. Ajouter 5 ml de la Leibovitz L-15 des touffes et triturer des tissus restants et filtrer à nouveau le surnageant. Laver tamis cellulaire avec 2 ml de la Leibovitz L-15.
    8. Placez solution cellulaire filtré dans une hotte de 20 à 60 minutes pour permettre la collagénase à digérer le collagène partiellement dégradée.
    9. cellules de sédiments à 100 x g pendant 5 min. Re-suspendre les cellules dans 20 ml de DMEM contenant 10% de FBS et de haute concentration P / S (20 U / ml).
    10. Cellules pré-plaque sur deux en plastique des boîtes de culture cellulaire de 10 cm pour 1 h de CO 2 incubateur à 37 ˚ C pour la sélection des cardiomyocytes. REMARQUE: Les fibroblastes se fixent plus facilement sur le fond de la cuvette de cardiomyocytes.
    11. While attente, la préparation du milieu DMEM contenant du FBS à 10%, P / S (10 U / ml) et 0,1 mM de BrdU. Ajouter 1 ml de 10 mg / ml de BrdU à 325 ml de DMEM contenant 10% de FBS et P / S.
    12. Agiter doucement plats et recueillir le surnageant contenant des cardiomyocytes à partir de deux boîtes de 10 cm.
      REMARQUE: La plupart des cardiomyocytes seront toujours flottantes dans le surnageant après 1 heure d'incubation. Pour éviter de contaminer avec des fibroblastes qui sont attachés à la légère le plat, ne pas recueillir le surnageant par pipetage.
    13. Option> Compter les cellules dans le surnageant avec et sans 0,2% de bleu trypan pour vérifier la viabilité cellulaire.
    14. cellules de sédiments à 100 x g pendant 5 min. Re-suspendre les cellules dans du DMEM contenant du FBS à 10%, P / S (10 U / ml) et 0,1 mM de BrdU. Cellules de la plaque à 2 x 10 5 cellules / boîte de 3.5 cm verre plats fond enrobés de gélatine pour l'observation à l'aide du microscope. NOTE: Ne pas déranger cellules après étalement pendant au moins 24 heures à l'incubateur à CO2 à 37 ˚ C.
    15. Jour 3, Change moyenne 24 heures après l'étalement de DMEM / MEM contenant du FBS à 5%, P / S et 0,1 mM de BrdU.
    16. Jour 4, changement de milieu 48 heures après l'étalement de DMEM / MEM contenant 5% de FBS et P / S.
      NOTE: Changer le milieu tous les 2-3 jours avec du DMEM / MEM contenant 5% de FBS et P / S.

2. Transduction lentiviraux

  1. Conditionnement des plasmides lentiviraux
    NOTE: S'il vous plaît se référer à d'autres sources pour obtenir des informations détaillées à ce sujet 24-26. Il faudra environ trois jours pour préparer la solution de lentivirus. Il est préférable d'utiliser une solution de lentiviral frais pour atteindre une plus grande efficacité de transduction. Lancer l'emballage de plasmides lentiviraux et l'isolement des cardiomyocytes néonataux de rat en parallèle. Au lieu d'utiliser la polyéthylèneimine (PEI) 27 pour l'emballage de plasmides lentiviraux, un réactif de transfection disponibles dans le commerce peut être utilisé. Suivez les instructions du fabricant.
    1. Préparer les réactifs et les outils; HEKcellules 293T, 10 cm en plastique des boîtes de culture cellulaire, des solutions de plasmide lentiviraux (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, vecteur de transfert lentiviral, 1,0 mg / ml chacun), un milieu sans sérum 1 g / l PEI, 20 mM chloroquine dans l'eau, 10% l'eau de Javel, 1% SDS à 70% EtOH
    2. Jour 0, Plaque de 2-2,5 x 10 6 cellules HEK 293T par boîte de 10 cm le jour avant la transfection.
      NOTE: 30-60% de confluence à la transfection est optimal.
    3. Jour 1, Préparation solution de transfection de l'Î. Ajouter 30 ul de 1 g / l à 960 PEI milieu sans sérum-ul dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 4 plasmides dans la solution de transfection PEI dans le tube de 1,5 ml, et mélanger avec le taraudage.
    Nom de plasmide Remarque Taille (kb) volume ajouté (ml) Montant final en boîte de 10 cm (mg) La concentration finale en boîte de 10 cm (PM)
    Vecteur de transfert lentiviral gène qui code pour emballer 9-13 3.6 à 5.2 3.6 à 5.2 60
    pMDLg / pRRE exprime le VIH-1 gag / pol 8.8 1,76 1,76 30
    pRSV-Rev exprime le VIH-1 REV 4.1 0,82 0,82 30
    pMD2.G exprime G de VSV 5.8 1.16 1.16 30

    Tableau 2:. La quantité de plasmides pour l'emballage de lentivirus Utilisez ces montants plasmide pour la transfection de cellules HEK293 en boîtes de 10 cm. Montant final de vecteur de transfert lentiviral par boîte peut varier en fonction de sa taille, maintenir la concentration finale par plat à 60 pM. Poids moléculaire moyen d'une paire de l'ADN double brin de base est de 660 daltons.

    1. Jeter le vieux médiumde 10 cm plat de cellules HEK 293T, et doucement ajouter 9 ml de nouveau milieu (DMEM + 10% de FBS, sans P / S).
    2. Ajouter le mélange PEI-ADN doucement goutte à goutte sur la plaque et agiter doucement pour mélanger avec le milieu. Ajouter 10 ul de 20 mM chloroquine (finale 20 uM) à 10 ml de milieu. REMARQUE: La chloroquine est pensé pour réduire la dégradation des complexes de transfection contenant le plasmide par neutralisation partielle du pH à l'intérieur des compartiments 28 lysosomales.
    3. Incuber de CO 2 incubateur à 37 ˚ C pendant 6 heures. Ensuite, éliminer le milieu contenant le mélange PEI-ADN et ajouter 10 ml de nouveau milieu (DMEM + 10% FBS + 20 4 mm - acide (2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), pH 7,4 + P / S) . REMARQUE: Après l'incubation, le virus sera produit dans le milieu. Pipettes et / ou des conseils aspiration Pasteur doivent être décontaminés par Javel à 10%. Toujours décontaminer la surface du coffret de sécurité biologique et de l'équipement potentiellement contaminé avec 70% EtOH indépendamment du fait que le surnageant a été renverséou non. Si déversement a eu lieu, la décontamination approfondie avec 1% de SDS dans EtOH à 70% est nécessaire.
    4. Jour 2-3, incuber de CO 2 incubateur à 37 ˚ C pendant 48-72 heures. Jour 4, recueillir solution lentivirus (passez à la Section 2.2).
      REMARQUE: Medium peut être modifié à 48 heures après la transfection. Collecte surnageant de virus 48 heures et 72 heures deux fois peut atteindre pour obtenir des solutions de virus de titre élevé.
  2. Collection de solution de transduction lentivirale et
    1. Préparer le réactif et outils: 15 ml tubes coniques, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 um filtré)
    2. Jour 4, ramasser le surnageant contenant des particules de lentivirus (solution lentivirus) avec 10 ml stérilisés Luer-Lok seringue, puis filtrer le surnageant de 0,45 um filtrer dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 1/100 volume de 1 M de HEPES, pH 7,4 à lentiviral solution filtrée (finale 10 mM).
      REMARQUE: Pour le filtrage, utilisez uniquement cellulose astate ou polyéthersulfone (PES) (faible liaison aux protéines) filtres. Ne pas utiliser des filtres de nitrocellulose. Nitrocellulose lie des protéines de surface sur l'enveloppe lentivirale et détruit le virus.
    3. Retirer moyen de 3,5 cm plats de rat cardiomyocytes néonataux, obtenus lors de la dernière étape de la section 1.2, ajouter 1 ml de solution lentiviral filtré à 3,5 cm plat.
    4. Ajouter bromure de hexadiméthrine (concentration finale 4-6 ug / ml).
      NOTE: le bromure de hexadiméthrine peut améliorer l'efficacité de transduction lentiviral. La concentration de bromure d'hexadiméthrine doit être optimisée.
    5. Incuber plat pour 6 heures de CO 2 incubateur à 37 ˚ C pour lentiviral transduction, puis changer à nouveau milieu DMEM / MEM contenant 5% de FBS et P / S. Incuber plat de CO 2 incubateur à 37 ˚ C pendant 3 jours.
      NOTE: L'intégration du gène exogène dans le génome de l'hôte par lentivirus est considérée comme terminée par 72 heures.
    7. Jour 7, utiliser des cellules de l'étape 2.2.5 pour la prochaine étape. NOTE: Protein expression lentiviral à partir du plasmide peut être confirmée par immunocytochimie ou WB (ICH) après 48 à 72 heures de transduction afin de déterminer le niveau d'expression relatif (Figure 1a et 1b).
  3. Concentration de la solution lentiviral
    NOTE: Il est préférable d'utiliser une solution de lentiviral frais afin de réaliser les meilleures performances de transduction, au cas où la solution lentiviral titre n'est pas assez élevé, la solution lentiviral peut être concentré par du polyéthylène glycol (PEG) 29.
    1. Préparation de la solution 4x PEG (32% PEG6000, du chlorure de sodium 400 mM (NaCl), 40 mM d'HEPES, pH 7,4)
      1. Pour 125 ml de solution 4x PEG, peser 40 g de PEG6000, puis le dissoudre dans 60 ml d'eau.
        NB: NB: (. Ie poids moléculaire moyen de PEG6000 est 6000) Le nombre après PEG est le poids moléculaire moyen
        REMARQUE: 2.3.1.2) Ajouter lentement 10 mlde 5 M de NaCl. Lentement, ajouter 5 ml de 1 M HEPES pH 7,4. Ajuster le pH à 7,4 au moyen d'hydroxyde de sodium à 2 M.
        REMARQUE: 2.3.1.3) Ajouter de l'eau à 125 ml. Stériliser solution 4x PEG par filtration sur membrane avec un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ˚ C.
    2. Concentration lentivirus
      1. Filtre lentiviral transduction surnageant dans un nouveau tube de 50 ml en utilisant un filtre de 0,45 um.
        REMARQUE: 2.3.2.2) Ajouter solution 4x PEG ratio 1:3 (solution PEG: surnageant = 1:3). Stocker à 4 ˚ C pour 16-48 heures.
        REMARQUE: 2.3.2.3) Centrifuger à 2600 x g à 4 ˚ C pendant 30 min. Rejeter le surnageant et centrifuger à 2600 x g à 4 ˚ C pendant 5 min.
        REMARQUE: 2.3.2.4) Jeter attentivement surnageant pour éviter de perturber le culot. Remettre en suspension le culot dans du milieu sans sérum en utilisant moitié-1/25 du volume du volume de surnageant initial.
        REMARQUE: 2.3.2.5) Utilisez directement ou geler l'aide d'azote liquide puis stocker à -80 ˚ C

3. Transduction adénovirale

NOTE: S'il vous plaît se référer à d'autres sources pour les méthodes pour la construction et la propagation des constructions adénoviraux 13. Pipettes et / ou des conseils aspiration Pasteur doivent être décontaminés par Javel à 10%. Toujours décontaminer la surface du coffret de sécurité biologique et de l'équipement potentiellement contaminé avec 70% EtOH indépendamment du fait que le surnageant a été renversé. Si déversement a eu lieu, la décontamination approfondie avec 1% de SDS dans EtOH à 70% est nécessaire.

  1. Adénoviral par titrage de la dose infectieuse de culture de tissu à 50% (TCID50)
    NOTE: Avant de transduction, il est nécessaire de doser la solution de adénoviral. DICT 50 est l'une des meilleures méthodes pour titrer la solution virale. Parce que la méthode évalue un titre par un pouvoir infectieux pour les cellules HEK 293T, calculé DICT 50 reflète infectabilité réelle de l'adénovirus actions. Le PFU (uni formant des plaquests) est proportionnelle à la TCID 50 par un facteur de l'ordre de 0,56 30.
    1. Préparer les cellules et les outils: les cellules HEK 293T, 10 cm plats de culture cellulaire, 96 puits de plaque de culture cellulaire à fond plat, pipette à 8 canaux multiples
    2. Préparer 70 à 90% de confluence des cellules 293T HEK dans un plat de 10 cm.
    3. Effectuer une pré-dilution de 1/10 4 du stock de virus. Ajouter 50 ul de DMEM + 10% de FBS à chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 96 puits à fond plat. Ajouter 25 ul du stock de virus pré-dilué dans la première rangée, de A à H.
    4. Bien mélanger et transférer 25 ul de la première rangée de puits à la deuxième rangée avec une pipette à 8 canaux multiples. Répétez le tiers dilution de la solution virale à chaque rangée de puits jusqu'à et y compris le 11 rangée et jeter dernier 25 ul.
    5. Triturer HEK 293T cellules dans 10 ml de DMEM + FBS à 10%. Ajouter 50 ul de solution de cellules dans chaque puits de lignes 1 à 12.
    6. Incuber les cellules à 37 ˚ C en incubateur à CO2 pour 11-13 jours. Ajouter 50 ul de DMEM + 10% de FBS et après 4-5 jours 7-8 jours de placage.
    7. Mesurer les effets cytopathologiques dans chaque puits à 11-13 jours après l'infection.
    voie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    La ligne A ré ré ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne B ré ré ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne C ré ré ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne D ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne E ré ré ré ré ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne F ré ré ré ré ré ré ré
    Ligne G ré ré ré ré ré ré ré ré
    Rangée H ré ré ré ré ré ré ré ré ré ré ré
    le nombre de puits positifs par ligne 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    le rapport de puits positifs par ligne 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0,63 0,25 0,25 0
    ré Affichant plus de 50% des effets cytopathiques
    Affichez moins de 50% ou pas d'effets cytopathiques

    Lane 1, une dilution 3 x10 4; piste 2, la dilution 2 3 4 x 10; ...; piste 11, une dilution de 2 x 10 3 11; voie 12, contrôle.
    S = la somme des rapports de puits positifs par ligne
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8,875
    DICT 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875 à 0,5) = 2,97 x 10 8
    DICT 50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tableau 3: Exemple d'un infecté 96 plaques à puits après 10 jours d'incubation Mesurer les effets cytopathologiques dans chaque puits et la somme des ratios de puits positifs par ligne..

    1. Calculer le titre en fonction de la formule de Kaerber 31.
    2. DICT 50 = (dilution de la première voie) x (dilution) (S-0.5)
    3. S = la somme des rapports de puits positifs par ligne
      NOTE: Pour ce protocole, DICT 50 = (30 000) x (3) (S-0.5). Parce que 50 ul de solution virale est utilisé dans ce protocole, diviser DICT 50 par 0,05 pour calculer DICT 50 / ml.
  2. Transduction adénovirale
    1. Calcul de la quantité requise de solution adénoviral de son titre (PFU / ml, particule virale / ml ou DICT 50 / ml). Utilisez la formule pour calculer MOI (multiplicité d'infection).
    2. em> [Lieu Tableau 4 ici]
    3. Ajouter la quantité calculée de solution de virus à un milieu sans sérum (voir tableau 5). Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante.
    4. em> [Lieu Tableau 5 ici]
    5. Jour 7, Prenez plat obtenu lors de la dernière étape de la section 2.2, et remplacer moyenne avec 750 ul de DMEM / MEM contenant 5% de FBS et P / S.
      REMARQUE: Réduction du volume moyenà transduction à environ 50% du volume d'origine est critique pour une haute efficacité de transduction.
    6. Ajouter la solution de virus dilué à plat. Incuber plat pour 4-8 heures de CO 2 incubateur à 37 ˚ C. Ensuite, remplacez par du milieu frais.
    7. Incuber plat pendant 24-48 heures en CO 2 incubateur à 37 ˚ C. Au jour 8-9, Utiliser des cellules pour l'expérience d'imagerie des cellules vivantes. NOTE: Protein expression à partir du plasmide adénoviral peut être confirmée par WB ou ICH après 24-48 h de transduction afin de déterminer le niveau d'expression de protéine relative (Figure 1c et 1d).

4. L'imagerie cellulaire en direct

  1. acquisition de l'image en utilisant un microscope confocal à disque rotatif avec une chambre à température contrôlée et un système environnemental CO 2 (facultatif)
    1. Mettre le système de commande de température sur au moins 1 heure avant l'acquisition, de telle sorte que tous les dispositifs s'équilibrer à 37 ˚ C avant le début de l'acquisition. Mettez confocal tourner le disque système de microscope (PC pour l'opération, microscope, la filature unité de disque, caméra CCD, lasers, source de lumière fluorescente, source de lumière normale, platine motorisée et volets automatiques).
      NOTE: Plus de 1 heure est nécessaire pour atteindre l'équilibre de température complète de tous les appareils.
    2. Changer le milieu dans 3,5 cm de plats à fond de verre à moyen souhaité pour l'acquisition, le cas échéant. Placer le plat sur la scène du microscope confocal à disque rotatif dans une chambre à température contrôlée.
      NOTE: En raison de l'aberration sphérique pour une observation optimale par l'utilisation de la microscopie d'un plat de fond de 3,5 cm en verre avec n ° 1,5 couvercle en verre (environ 0,16 au 0,19 mm d'épaisseur) est idéal. Si l'objectif utilisé comporte une bague de correction, les images obtenues avec des lunettes de couverture plus épaisse que 0,17 mm peuvent être corrigées. En outre, le rouge de phénol a une légère fluorescence. Parfois, il est préférable d'utiliser un milieu dépourvu de rouge de phénol, tel que le milieu DMEM sans rouge de phénol. S'il n'ya pas de dispositif pour contrôler CO 2 concentration sur la platine du microscope, il est préférable d'utiliser un CO 2 indépendante du support ou milieu tamponné par HEPES pour l'imagerie temps de déchéance à long terme.
    3. Sélectionnez le trajet de la lumière pour les oculaires.
    4. Tourner le volet de la source de lumière à champ lumineux sur. Ajustez la mise au point des cellules sous le microscope à travers les oculaires. Tournez le déclencheur pour le champ lumineux source d'éclairage.
    5. Tournez le déclencheur pour la source de lumière fluorescente. Trouver des cellules exprimant des protéines fluorescentes au microscope dans les oculaires. Tournez le déclencheur pour la lumière fluorescente source hors service.
    6. Option> Appuyez sur le bouton d'activation du système de mise au point parfaite devant le microscope pour activer le système de mise au point parfaite afin de pouvoir garder le focus stable lors de l'acquisition time-lapse.
    7. Changer la trajectoire de la lumière du microscope confocal à disque rotatif. Réglez les paramètres d'acquisition en utilisant de manière appropriée le logiciel d'exploitation, le contrôle des images déplaYED sur l'écran. (Par exemple, mise au point, la puissance du laser, la durée d'exposition, et le gain de la caméra CCD off-set)
    8. Définir les paramètres de l'acquisition d'image fluorescente utilisant le logiciel d'exploitation. Exemple: Sélectionnez «Changer les canaux en utilisant des chemins de lumière" et "Channel 1: EGFP" d'acquérir signal fluorescent de l'EGFP pour un canal.
    9. Réglez la fréquence entre les points de temps en configurant les paramètres time-lapse afin de prendre des images en accéléré à l'aide du logiciel d'exploitation. Exemple: Pour acquérir un point dans le temps toutes les 5 minutes, sélectionnez "procès-verbal par point de temps" dans le menu déroulant, et entrez 5 dans le champ de texte.
      REMARQUE: Sélectionner "Vitesse maximale" pour faire un film à la vitesse réelle. Si l'expression de la protéine fluorescente est faible, la fluorescence peut blanchir rapidement lors de l'acquisition time-lapse. Dans ce cas, il est préférable de réduire le nombre de points de temps d'acquisition.
    10. Lancer l'acquisition time-lapse en cliquant sur le "stabouton rt "pour acquérir une séquence d'images.
      NOTE: Il est préférable de ne pas utiliser la fonction d'acquisition de plusieurs points. Il peut entraîner une perte de concentration ou de mouvement du champ de l'imagerie lors de l'imagerie time-lapse.
  2. L'analyse des images acquises
    NOTE: Acquis images peuvent être lues comme un fichier vidéo et analysées en utilisant le logiciel d'analyse.
    1. Sélectionnez les images acquises à inclure dans un film. Si nécessaire, les régions de cultures d'intérêt à partir d'images et sélectionnez temps-points intéressants pour réduire la taille du fichier de la vidéo à l'aide du logiciel d'exploitation.
    2. Exporter des images dans un fichier vidéo au format AVI ou MOV. Sélectionnez un format de film dans le menu "Format" déroulante et le calendrier requis pour le film fini, puis cliquez sur "Exporter". REMARQUE: Les images de Time-Lapse acquises à un point dans le temps toutes les 5 minutes peuvent être lus comme un film à 10 images par seconde, ce qui est 3000 fois plus rapide que sa vitesse réelle.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Pour illustrer cette technique, un EGFP lentivirus codant (enhanced green fluorescent protein)-tagged Cx43 (Connexin43) ou un Cx43 mutée 32 a été utilisé pour exprimer des protéines EGFP-marqué dans les cellules, et un codage de l'adénovirus FGFR1DN (récepteur du facteur de croissance des fibroblastes 1 dominant négatif ) a été utilisé pour arrêter la signalisation FGF dans la cellule 33-35. Trois jours après l'isolement des cardiomyocytes, les cardiomyocytes isolés ont été transduites avec...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Cardiomyocytes primaires isolés à partir de rats nouveau-nés ont longtemps été utilisées pour étudier les fonctions des cardiomyocytes in vitro. Ce protocole décrit un procédé pour l'isolement des cardiomyocytes néonataux de bébés rats en utilisant une digestion par enzyme de procédé en deux étapes, d'abord à digérer avec de la trypsine O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée. Un avantage de l'emploi de l'étape de la collagénase purifiée est que le même grade de l'enzyme est utilisée ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Alengo Nyamay’antu et le Dr Ilse Timmerman pour leurs conseils sur l’emballage lentiviral. Ce travail est soutenu par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 10SDG4170137.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 Ciseaux pour la décapitationWPI501749Autoclave avant utilisation
1 Ciseaux fins pour l’isolation du cœur et le hachageWPI14393Autoclave avant utilisation
2 Pinces fines (Dumont n° 5)SigmaF6521Autoclave avant utilisation
3 Plats en plastique stérilisés de 10 cmSigmaCLS430165Pour l’isolation du cœur
3,5 cm Fond en verre boîtes de cultureMatTekP35G-1.5-20-CPour le placage final des cardiomyocytes pour l’imagerie future de cellules vivantes. Les micro-plats d’ibidi sont une alternative acceptable.
Boîtes de culture à fond en verre de 3,5 cmMatTekP35G-0.17-14-CPour TIRF ou image haute résolution
Solution d’éthanol, 70 % (v/v) dans l’eauSigmaE7148
2 % GélatineSigmaG1393
1 Plat en plastique stérilisé de 10 cmSigmaCLS430165Pour trypsinisation
Feuille d’aluminiumToute marque
ParafilmSigmaP7543
Deux paraboles en plastique de 10 cmSigmaCLS430165Pour sélection
AutopipetteDrummond Scientific4-000-300Pour la trituration
Compteur de cellules Cellomètre
, compteur de cellules automatisénexcelomPour vérifier et compter les cellules
Microscope et hématocytomètreN’importe quelle marquePour vérifier et compter les cellules
Trypan blue solution, 0,4 %invitrogen15250-061
CO2 incubateurSanyoMCO-19AIC
Incubation agitateur orbitalSigmaZ673129Pour secouer le tissu cardiaque avec la collagénase à 37 ° ; C à 170-200 tr/min
10 mg/ml BrdU solutionBD Pharmingen550891
DMEM,invtrogèneàmilieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation
MEMinvitrogen31095029milieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation
sérum fœtalde bovin invitrogen26140079
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ml)  ;invitrogen15140-122
Section 2 Transduction lentivirale
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
Clontech632183
Opti-MEM (milieu sans sérum)invitrogen31985070
transfection
polyéthylèneimine" max", (MW 40 000) - PEI linéaire à haute puissance (équivalent à Mw 25 000 sous forme de base libre)  ;Polysciences24765-2Il peut être substitué par X-tremeGENE 9 de Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001substitut de PEI comme réactif de transfection
ChloroquineSigmaC6628Dissoudre dans l’eau et faire 100 mM de solution mère. L’inhibition de l’acidification endosomale peut être obtenue avec 10-100 &mu ; M Chloroquine.
HEPESSigmaH3375
Seringue Luer-Lok 10 ml, BD 3096040,45
&mu ; m filtersSigmaF8677Utilisez uniquement des filtres en acétate de cellulose ou en polyéthersulfone (PES) (faible liaison protéique). N’utilisez pas de filtres en nitrocellulose. La nitrocellulose lie les protéines de surface sur l’enveloppe lentivirale et détruit le virus.
Bromure d’hexadiméthrineSigmaH9268Dissoudre dans l’eau et préparer une solution mère de 8 mg/ml, puis filtrer pour la stériliser.
Polyéthylène glycol 6 000Sigma81260
Chlorurede sodium SigmaS9888
Hydroxyde de sodiumSigmaS5881
Section 3 Transduction
HEK 293Cellules TATCCCRL-11268
Quelques boîtes de culture cellulaire de 10 cmSigmaCLS430165
Microplaque à 96 puits avec couvercle, à fond plat, culture tissulaire, stérileBD Falcon353072Pour titrage Pipette
multicanaux, 10-100 &mu ; l, 8 canauxeppendorf3122 000.035
Section 4 Imagerie de
Disque rotatif microspopy confocalPerkinElmerL7267000
Une chambre à température contrôléeN’importe quelle marquePour maintenir la température à 37 ° ; C
Un système environnemental CO2 N’importequelle marqueFacultatif pour maintenir la concentration optimale de CO2 concentration optimale
CO2 Milieu indépendant, sans invitrogène de glutamine18045-054  ;   ;Pour l’imagerie time-lapse de longue durée
DMEM, glycémie élevée, HEPES, sans rouge de phénolinvitrogen21063-029Pour l’imagerie time-lapse à long terme
haute teneur en glucose 41965039 3 Plasmides d’emballage Le vecteur de transfert lentiviral, pLVX-IRES-Puro réactif deadénoviralecellules vivantes de

Références

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Transduction adénoviraleimagerie en accéléréprotocole d'isolement cellulaireprotéine marquée à l'EGFPFGFR dominant négatifboîtes à fond en verresystème d'autofocus
Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.