Évaluation de l'activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Résumé

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Résumé

Le poumon est une interface où les cellules hôtes sont fréquemment exposés à des microbes et des produits microbiens. Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des champignons et d'autres microbes inhalés. Macrophages et d'autres cellules immunitaires reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance et d'initier des réactions inflammatoires en aval. L'oxydase phagocyte NADPH génère des intermédiaires réactifs de l'oxygène (ROI) et est essentiel pour la défense de l'hôte. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l'hôte médiée par les neutrophiles ^{1 - 3,} l'importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n'est pas bien définie. Le but de cette étude était de définir le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l'hôte contre A. fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores ^4. Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer la capacité des souris unmacrophages lveolar (AMS) pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytés (conidies). Les macrophages alvéolaires sont colorées in vivo et dix jours plus tard isolées à partir de souris par lavage broncho-alvéolaire (BAL). Les macrophages sont étalées sur des lamelles de verre, puis ensemencées avec la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant A. spores fumigatus. À des moments précis, les cellules sont fixées et le nombre de macrophages avec des spores intactes phagocytées est évaluée par microscopie confocale.

Introduction

Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des microbes inhalés. Macrophages reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance, ingèrent et limitent la croissance des spores inhalées (conidies), et d'initier des réactions inflammatoires. La NADPH oxydase phagocytaire convertit l'oxygène moléculaire en anion superoxyde et des intermédiaires réactifs de l'oxygène en aval (ROI). Granulomatose chronique (CGD) est un trouble héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections bactériennes et fongiques graves et par des réactions inflammatoires excessives.

Protocole

Toutes les procédures effectuées sur les animaux dans cette étude ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité à Roswell Park Cancer Institute et respectées tout état, fédéral, et les Instituts nationaux de la réglementation de la santé.

1. In vivo des macrophages étiquetage

Remarque: PHK26 est un colorant lipophile qui sera absorbé par les cellules phagocytaires à la fois dans la circulation et dans les tissus lorsqu'ils sont administrés par voie intraveineuse (iv). PKH26 a été utilisé pour le marquage in vivo pour réduire au minimum la quantité de manipulation pos....

Résultats

Collecte des macrophages alvéolaires par BAL de souris non stimulés se traduira par une population pure à> 95% sur la base de la cytologie. Le 3 et 7 h (Figure 2) points de temps précèdent le stade des hyphes de la croissance fongique et permettent une comparaison de l'efficacité de phagocytose des conidies chez les génotypes. Le point de temps de 14 h est l'endroit où les génotypes peuvent être comparées en ce qui concerne l'aptitude à inhiber la transition de conidies phagocyté à .......

Discussion

En utilisant cette approche ex vivo pour l'analyse de l'activité antifongique des macrophages avec challenge in vivo fongique, nous avons précédemment montré que la NADPH oxydase dans les macrophages jouent un rôle important dans la défense contre A. fumigatus ^4. L'utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous permet de mettre l'accent sur ​​leur activité antifongique en l'absence d'autres cellules du système immunitaire (par exemple, les neutro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescent rouge pour le marquage général de la membrane cellulaire	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Utilisé pour fabriquer AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Utilisé pour fabriquer AvertinAnesthetic
Dulbecco' ; s Solution saline tamponnée au phosphate (sans calcium ni magnésium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK
KHCO3	Sigma	P91444	Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK
EDTA	Sigma	E6758	Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK
22 G x 1,00 pouce i.v. cathéter	BD	381523	Insyte Autoguard
Seringues
de 6 ml Seringues robinet
d’arrêt à 4 voies	Fisher Scientific	50-700-077
Fil
50 ml Tubes
éponges de gaze (4 pouces carrés)
RPMI 1640 avec L-glutamine	Corning	10-040-CV
Sérum de veau fœtal	Hyclone	SH30396.03	inactivé par la chaleur
Hema 3 Stain	Set Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar avec chloramphénicol et gentamicine	obliques BD	297252
em>Aspergillus fumigatous exprimant une protéine			fournie par le Dr Margo Moore, Université Simon Fraser, Burnaby, BC, Canada
100 &mu ; m Croires à cellules	BD Falcon	64753-00
Ciseaux
Armoire de sécurité biologique Classe II
Sorval ST40 Centrifugeuse avec rotor
Leica DM1000 Microscope
Hémocytomètre
Cytospin 2 centrifugeuse	Thermo Scientific
Incubateur			37 ° ; C, 5 %  ; CO2
22 x 22 mm verre de protection micro	VWR	48366-227	lamelles de recouvrement 6
puits Plaques de culture cellulaire	Corning	3506
10 % Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Support de montage Vectashield avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Système Leica TCS SP2 avec scanner de points laser			Monté sur microscope à fluorescence DMIRE2

d’insuline ailées de sutureà centrifuger coniques souche < fluorescente verte Pinceà godets pivotantsoptique de culture cellulaire