Microdissection a été largement utilisé pour l'examen de l'ADN, de l'ARN et de la protéine dans le tissu. microscopie de capture laser (LCM) est la méthode la plus couramment utilisée, mais une nouvelle technique de fraisage, mesodissection, est disponible depuis peu. Nous démontrons extraction d'ARN à partir mesodissected formol paraffine fixe des lames de tissus intégrés de granulomes de Mycobacterium tuberculosis.
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Article de méthode
Une nouvelle approche microdissection de la récupération
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Résumé
Résumé
Microdissection a été utilisé pour l'examen des tissus à l'ADN, de l'ARN, et les taux de protéines plus d'une décennie. microscopie de capture laser (LCM) est une technique de microdissection le plus couramment utilisé aujourd'hui. Dans cette technique, on utilise un laser pour faire fondre focalement une membrane thermoplastique qui recouvre une coupe de tissu déshydratée 1. La coupe de tissu composite est alors soulevé et séparé de la membrane. Bien que cette technique peut être utilisée avec succès pour l'examen des tissus, il est long et coûteux. De plus, la réussite des procédures utilisant cette technique nécessite l'utilisation d'un laser, ce qui limite son utilisation. Une nouvelle approche de microdissection plus abordable et pratique appelée mesodissection est une solution possible pour les pièges de la LCM. Cette technique utilise le système à moulin MESO-1/MeSectr le tissu désiré à partir d'un échantillon de tissu monté coulissant tandis que simultanément la distribution et l'aspiration de fluide pour récupérer l'échantillon de tissu désiré enun peu de moulin consommable. Avant le début du processus de dissection, l'utilisateur aligne la formol paraffine fixe intégré (FFPE) glisser avec un hématoxyline et l'éosine souillé (H & E) lame de référence. Par la suite, l'opérateur annote la zone de dissection souhaitée et procède à disséquer le segment approprié. Le programme génère une image archivée de la dissection. Le principal avantage de mesodissection est la courte durée nécessaire pour disséquer une diapositive, en prenant une moyenne de dix minutes de mise en place pour déguster génération dans cette expérience. En outre, le système est considérablement plus économique et facile à utiliser. Un léger inconvénient est qu'il n'est pas aussi précise que la microscopie à capture laser. Dans cet article, nous montrons comment mesodissection peut être utilisé pour extraire l'ARN à partir de diapositives de granulomes FFPE causées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Les échantillons ont été traditionnellement microdissection soit manuellement à partir d'un tissu ou lames à l'aide d'une aiguille et l'ensemble scalpel. Cela nécessite une séparation claire entre la section de tissu d'intérêt et les tissus environnants sections 2. Avec les progrès actuels de la technologie de profilage moléculaire, il a eu un besoin croissant d'évaluer les tissus au niveau cellulaire. En raison des limitations de microdissection manuel, y compris les techniques LCM ont été établis pour permettre une plus grande précision de l'isolement. Cette technique permet au chercheur d'isoler des populations de cellules spécifiques à partir de divers types de cellules et de diapositives, qui peuvent ensuite être utilisés pour des essais en aval comme profil d'expression génique. Bien que très efficace pour les essais en aval, LCM n'est pas sans limites. Tout d'abord, LCM est un processus long et coûteux. En outre, en raison de la nature instable de l'ARN, il est souvent difficile d'obtenir de l'ARN de haute qualité à partir de deux échantillons LCM. En raison de la disadvantages de LCM, de nouvelles avancées dans la technologie de microdissection sont encore nécessaires pour le rendre plus accessible à un plus grand nombre de chercheurs d'une manière sensible abordable et le temps.
Une telle avancée dans la technologie de microdissection maintenant disponible est une technique connue sous le nom mesodissection. Dans cette technique, on utilise une machine à l'usine de la section de tissu annotée d'intérêt et l'aspire dans un peu de moulin consommable 3. Ensuite, cet échantillon peut être aspiré dans un tube de collecte et utilisée pour des applications en aval. Les avantages de ce système est qu'il est beaucoup moins coûteuse en temps et sensible. Dans notre expérience, le système permet la dissection d'une section de tissu de granulome pulmonaire dans dix minutes. D'autre part, LCM traditionnel nécessiterait probablement heures pour terminer le processus. Le système permet à l'opérateur de charger une lame de référence à utiliser à titre de comparaison ainsi que l'outil pour l'annotation. En outre, un rapport est généré ème décrivantzone de e de la lame qui a été disséqué. Il existe deux principaux inconvénients de mesodissection. Bien qu'efficace à extraire des cellules multiples, il est difficile d'isoler une seule cellule. En outre, la précision de l'image générée n'est pas aussi clair que si vous utilisez d'autres microscopes d'imagerie.
La tuberculose (TB) est une cause majeure de décès des maladies infectieuses de l'humanité dans le monde entier et les résultats de l'infection par Mtb. Dans la majorité des personnes exposées à des aérosols de Vtt, l'infection est latente limitée. Dans au moins 10 millions de personnes par an, il en résulte la tuberculose active 4. Lors de l'infection latente, Vtt est contenu dans les lésions pulmonaires pathologiques appelés granulomes. Par conséquent, il a été avancé que le résultat de l'infection Vtt est décidé au niveau du granulome 5.
Ici, nous montrons comment mesodissection peut être utilisé pour microdissect granulomes provoqués par Mtb. Les diapositives utiliséessont des tissus pulmonaires FFPE de macaques rhésus infectés. Pour les besoins de cette démonstration, nous allons disséquer granulomes dans leur intégralité. Nous démontrons aussi que l'ARN peut être extrait à partir du tissu récupéré. Cette technique peut être appliquée à des échantillons de tissus à partir d'autres échantillons et ensuite utilisé pour une variété de dosages en aval.
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Protocole
1. Calibrer Mesodissection Instrument avec 2id logiciel d'imagerie
Le logiciel d'imagerie 2id sera appelé soit le logiciel ou le programme pour le reste de cet article. Cette étape est nécessaire pour suivre correctement l'image ainsi que aligner plusieurs cadres de diapositives.
- Allumez l'instrument et l'ordinateur.
- Ouvrez le logiciel et sélectionnez "instrument d'étalonnage".
- Calibrer Voyage en scène à l'aide de la manette. Déplacez étape à la position supérieure gauche. Appuyez sur "ensemble" à l'étape 1 dans le programme.
- Déplacez étape pour abaisser la position droite. Appuyez sur "ensemble" à l'étape 2 dans le programme.
- Calibrer aspiration en appuyant d'abord "Z-touche" pour augmenter l'ensemble de tête. Appuyez sur la touche "d'impulsion d'aspiration" et bouton "dissection" sur la manette jusqu'à ce que la tige de commande de piston atteint la position supérieure. Appuyez sur "ensemble" à l'étape 3 de programme.
- Appuyez sur "aspirer réinitialisation et# 8221; bouton. Une fois que le piston s'arrête à la position de fond sur «ensemble» à l'étape 4.
- Cliquez sur l'onglet "échelle".
- Placez calibrage règle sur le côté vierge.
- Concentrez microscope si nécessaire.
- Tracer une ligne entre les deux barres d'échelle en utilisant la souris.
- Saisissez la distance dans la case de l'étape 2 Appuyez sur le bouton. "Compute" marqué.
- Cliquez sur l'onglet "en forme de croix". Tourner la vitesse du moteur à une.
- Insérez xScisor dans l'assemblage de la tête. Assemblage de la tête plus basse dans l'axe z position d'attente par le bouton "axe z" en appuyant sur. NOTE: L'ensemble de tête est la grande structure sur le dessus de l'instrument de dissection. Le xScisor sera considéré comme un peu de l'usine de consommables pour le reste de cet article.
- Cliquez sur "dissection s'engager" sur joystick. NOTE: Ce bouton est situé sur le dessus de la manette.
- Définir centre de rotation visuellement. Pour ce faire, déplacez centre de réticule sur le centre de rotation à l'aide de définird paramètre à l'étape 1 du programme. Utilisez le flèches haut et bas dans le "x" et "barres axe y» pour régler les pixels d'aligner croix. Cliquez sur l'onglet "done".
- Cliquez sur l'icône «maison». NOTE: Ceci est représenté par une image de la maison située dans le coin supérieur droit.
2. Créez Image de référence
- Placez H & E diaporama sur scène. Placer le couvercle opaque sur le dessus de la lame. Conduisez l'instrument en déplaçant le joystick vers la zone souhaitée de la diapositive H & E. Enregistrer l'image générée. REMARQUE: Soit l'onglet "référence capture" ou l'onglet "disséquer" peuvent être utilisés pour compléter cette étape.
3. Alignez tissus pour dissection
- Cliquez sur l'option "disséquer les tissus" sur l'écran d'accueil.
- Remplissez la «opérateur», «nombre de dissection de l'adhésion", "numéro de référence de l'adhésion», «xScisor nombre de codes à barres," & #8220; dissection numéro de lot fluide "," taille de xScisor "et" description "dans l'onglet" Configuration ".
- Cliquez sur l'onglet "trouver des tissus".
- Importer image de référence précédemment enregistré.
- Placez une lame de FFPE tache de 5 microns d'épaisseur sur la scène. Déplacer étape à la même zone que celle présentée dans l'image de référence. Cliquez sur l'onglet "Insérer une image".
- Cliquez sur l'onglet "align". Utilisez la souris et les flèches associées à aligner l'image de référence à l'image sans tache.
4. Annoter diaporama
- Cliquez sur l'onglet "annoter".
- Utilisez la souris pour dessiner un cercle autour de la zone désirée de la diapositive qui sera microdisséquées.
5. Chargez Mill consommable Bit
- Remplissez peu de moulin consommable avec le tampon souhaité, ici tampon de PKD, en tirant le piston de haut en bas dans un mouvement fluide à plusieurs reprises. Assurez-vous d'exclure l'airbulles.
- Soulevez l'axe Z en appuyant sur bouton "axe Z".
- Chargez peu de moulin consommable dans la machine. Pour ce faire, en faisant glisser le peu de moulin consommable dans le haut de la machine de sorte que la ligne blanche sur les lignes de l'instrument avec la ligne noire sur le peu de moulin consommable. Appuyez sur le bouton "reset d'aspiration» pour permettre à piston à être descendu dans la position correcte. REMARQUE: Il devrait être facile de faire glisser le peu de moulin consommable. Si ce n'est pas, assurez-vous que les encoches sont correctement alignés.
- L'axe Z-Bas par le bouton "axe Z" appuyant de nouveau.
6. Disséquer les tissus (Figure 4)
- Ouvrez l'onglet "disséquer".
- Tournez vitesses de moteur et d'aspiration à 1.
- Cochez la case "Afficher la poursuite». Remarque: Ceci permet à l'utilisateur de visualiser la zone disséquée pendant le processus de dissection.
- Une fois prêt à disséquer, continuer à tenir le bouton "s'engager" ainsi que "aspirer & #8221; bouton tout en déplaçant le joystick dans le sens antihoraire à disséquer les tissus.
- Continuer à disséquer dans le sens antihoraire jusqu'à ce que la ponction est onglet "complet" devient rouge.
7. Vide et supprimer Mill consommable Bit
- Placer un tube de microcentrifugation de 0,5 pi sous la pointe de la mèche de broyeur consommable.
- Appuyez sur tige "aspiration" de commande rapidement pour éjecter échantillon dans le tube de centrifugeuse.
- Appuyez avec une force accrue pour éjecter peu utilisé moulin consommable.
- Rincer fragment de tissu en tirant le piston arrière. Pousser le piston pour exprimer échantillon restant dans peu de moulin consommable. Le fragment de tissu est maintenant contenu dans le tube de centrifugeuse.
8. Exemple de Lyse avec la protéinase K digestion Suivi par traitement thermique
- Ajouter 70 ul de TE pH 8,5, contenant 5 ug de la protéinase K pour un échantillon de tissu récupéré.
- Placer l'échantillon dans programmable chauffe-shaker.
- La digestion complète à l'aide programmable chauffe-shaker avec le réglage suivant: 60 ˚ C pendant 30 min à 1500 tours par minute; 82 ˚ C pendant 15 min à 1500 tours par minute; et 25 ˚ C pendant 1 min à 450 rpm. L'échantillon est maintenant prêt pour les applications en aval.
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Résultats
Le protocole ci-dessus montre comment utiliser une nouvelle technique de mesodissection pour extraire l'ARN à partir de lames de tissu FFPE. L'efficacité de ce protocole est montré à travers des diapositives FFPE de granulomes pulmonaires du PSN infectées par Mtb à divers stades infectieux. Figures 1-3 sont des images de l'instrument. Figure 4 illustre la façon dont le processus de dissection se produit et l'image résultante générée par le logiciel. Tabl...
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Discussion
Mesodissection est une technique qui peut être appliquée à l'extraction d'ARN à partir de lames de lésions pathologiques provoquées par une grande variété de pathogènes. C'est une nécessité que l'utilisateur suit l'image et aligne l'image correctement. Pour ce faire, l'instrument doit être étalonné suivant les instructions sur le logiciel d'imagerie. Lors de la dissection, si la lame et de la zone d'intérêt étant disséqué ne correspondent pas, l'utilisateur doit étalonner l'in...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs décrivent qu'il n'y a pas des intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les NIH prix / sous-subventions suivantes pour le soutien de cette recherche: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, et P51OD011104.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Autres tailles disponibles | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE kit d’extraction ; | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq Système FFPE ; | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit ; | Qiagen | 28104 |
Références
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
