Éléments techniques fondamentales de cryofracture / Gel-gravure dans biologique Electron Microscopy

Résumé

Techniques et d'améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanotechnologie.

Résumé

Cryo-fracture / gel de mordançage décrit un processus par lequel des spécimens, généralement biologique ou nanomatériaux dans la nature, sont gelés, fracturée, et reproduit pour générer un rapport carbone / platine "jeter" destiné à l'examen par microscopie électronique à transmission. Les échantillons sont soumis à des vitesses de congélation ultra-rapides, souvent en présence d'agents cryoprotecteurs pour limiter la formation de cristaux de glace, à la suite de la fracture de l'échantillon à la température de l'azote liquide refroidi sous vide poussé. La surface résultante est répliqué fracturé et stabilisé par l'évaporation de carbone et le platine à partir d'un angle qui confère une surface tridimensionnelle détaillée de la distribution. Cette technique s'est avérée particulièrement éclairante pour l'étude des membranes cellulaires et de leurs spécialisations et a considérablement contribué à la compréhension de la forme cellulaire de la fonction des cellules liées. Dans ce rapport, nous passons en revue les exigences de l'instrument et le protocole technique pour effectuergel-fracture, la nomenclature et les caractéristiques des plans de fracture associée, variations de la procédure conventionnelle, et les critères d'interprétation des images de fracture par congélation. Cette technique a été largement utilisée pour l'enquête ultrastructurale dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et est très prometteur comme une technique d'imagerie moléculaire pour émergents, nanotechnologies, matériaux et études scientifiques.

Introduction

Le concept et l'application pratique de la transformation cryofracture des échantillons biologiques a été introduit par Steere ¹ plus de la moitié il ya un siècle. L'appareil approprié début composants disparates en une unité autonome de travail ^1. L'appareil initial a été modifié et affiné dans des instruments disponibles dans le commerce afin de répondre au besoin critique pour la manipulation à distance, le maintien de vide poussé, et l'évaporation du carbone et des métaux pour produire une réplique appropriée pour l'examen par microscopie électronique à transmission (figure 1 et figure 2).

Protocole

1 Préparation des spécimens biologiques pour Cryo-fracture / Gel-gravure

1. Utilisation d'une formulation de fixateur EM classique tel que glutaraldéhyde à 2% + 2% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate 0,1 M pendant 1 heure. à effectuer la fixation primaire de tissus biologiques. REMARQUE: Bien qu'il soit souhaitable de geler certains types de spécimens sans fixation préalable, universels pathogènes à diffusion hématogène précautions prescrivent fixation appropriée lorsque l'échantillon est constitué de tissus humains.
2. Après la fixation primaire, rincer l'échantillon dans le même tampon additionné de 0,2 M de saccharose de pas....

Résultats

Le principe clé de cryofracture l'interprétation des images est que des plans de fracture traversent la bicouche lipidique des membranes donnant deux faces de rupture, appelé par convention, le PF-face (plasma fracture-face) et EF-face (extracellulaire fracture-face) (Figure 3). Le PF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacente au cytoplasme de la cellule et l'EF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacent au milieu extracellulaire. La technique de congélatio.......

Discussion

Dans les années suivantes de son introduction et la disponibilité commerciale, la lyophilisation fracture / procédures de gravure ont été largement utilisés pour les enquêtes de structure de la membrane biologique. En effet, les meilleurs points de vue de certains des spécialisations structurales de membranes ont été obtenus dans des préparations cryofracture / gravure. Ces études ont contribué non seulement à la compréhension de l'organisation structurale des membranes, mais aussi fourni des indications sur la faço.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Balzers Usine de congélation-fracture/congélation-gravure	Balzers	BAF400T
Tampons standard	divers fournisseurs
Fixateurs d’aldéhyde standard	divers fournisseurs
Dichromate de sodium	divers fournisseurs
Acide sulfurique	divers fournisseurs
Fournitures jetables pour l’évaporation du platine/carbone	Technotrade International
Azote liquide	divers fournisseurs
Propane	divers fournisseurs
Fournitures jetables pour la microscopie	électronique Microscopie électronique Sciences
Microscope électronique	à transmission Carl Zeiss Inc.