Expression de recombinant cellulase Cel5A de Trichoderma reesei Dans les usines de tabac

Summary

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Abstract

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l'utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d'expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d'enzymes et d'autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l'expression transitoire d'une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l'activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d'évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d'expression constitutifs ou inductibles.

Introduction

La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l'établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose ^1. systèmes d'expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d'enzymes à l'échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l'ont été pendant des milliers d'années. La....

Protocol

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes

1. Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d'humidité relative de l'air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle lumière / obscurité (par exemple Philips IP65 400 lampes de W; 180 pmol · s ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) et de l'eau tous les ....

Results

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d'expression transitoire (figures 1A et 1B). L'examen du profil d'expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l'expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D).

Extraction des protéines solubles totales a été effectué sur des plants de tabac q.......

Discussion

L'expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants ^1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l'utilisation de différentes localisations .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-méthylumbellifèreryl &bêta ;-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acide acétique	ROTH	3738
Acétosyringon (concentré)	ROTH	6003
Antibiotique - kanamycine	ROTH	T832
Antibiotique - rifampicine	ROTH	4163
Antibiotique - carbénicilline	ROTH	6344
Anticorps anti-His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorps anti chèvre AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxyméthylcellulose	MEGAZYME	S-ACMC
&beta ;-cyclodextrine	SIGMA-ALDRICH	C4805
Chlorure de calcium dihydraté	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxyméthylcellulose	ROTH	3333.1
Cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Rouge Congo	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie bleu brillant G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
Éthanol	ROTH	K928
Papier filtre - Papier buvard Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES tampon	ROTH	4256
Méthanol	ROTH	8388
Citrate de sodium	ROTH	3580
Dodécylsulfate de sodium	SERVA	20765
Hydroxyde de sodium	ROTH	6771
Sol, Einheitserde classic  ;	Spectromètre PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  ;	SIGMA-ALDRICH	H9882
Saline tamponnée	au phosphate ROTH	1058
Source de lumière UV - BLAK RAY	UVP
- VT1000S	Leica