Expression de recombinant cellulase Cel5A de Trichoderma reesei Dans les usines de tabac

Résumé

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Résumé

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l'utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d'expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d'enzymes et d'autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l'expression transitoire d'une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l'activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d'évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d'expression constitutifs ou inductibles.

Introduction

La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l'établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose ^1. systèmes d'expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d'enzymes à l'échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l'ont été pendant des milliers d'années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d'auto-hydrolyse ^2, et la possibilité d'optimiser l'utilisation des taux d'enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales ^1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant ^3.

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Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d'expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d'accumulation croissance et la biomasse ^4. L'expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps ^5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l'analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d'expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d'expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l'hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose ^7.

La technique d'expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l'expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed ^8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l'extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans'asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l'exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique ^9.

Pour analyser l'activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d'activité de cellulase peut être exécuté. Après l'extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d'incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d'un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l'activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité ^10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l'activité d'endoglucanase comprend l'analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) ^11. En outre, l'activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l'utilisation d'un test d'analyse de sucre, tel que l'hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage ^12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l'activité de la cellulase d'intérêt exprimée.

Protocole

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes

1. Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d'humidité relative de l'air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle lumière / obscurité (par exemple Philips IP65 400 lampes de W; 180 pmol · s ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) et de l'eau tous les jours.

2. Expression transitoire de TrCel5A et TrCel5A-mCherry protéines

1. Dans des conditions stériles, prélever des colonies simples d'Agrobacterium Agarobacterium (de GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) contenant soit pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry et transfert dans un erlenmeyer contenant 10 ml d'extrait de levurebouillon (YEB, préparé selon les spécifications du fabricant) à moyen et à la kanamycine (50 mg / ml), de rifampicine (50 mg / ml) et de la carbénicilline (100 mg / ml) pour la sélection. Incuber pendant 36-40 heures à 26 ° C et 180 rpm. Remarque: La conception de constructions appropriées pour l'expression de la protéine est en dehors du champ d'application de cet article, mais à titre indicatif, les méthodes de Maclean et al ¹³ et Munro et Pellham ¹⁴ peut être suivie pour la conception de construction..
2. Prendre 200 pi de chaque culture pour inoculer 20 ml de YEB avec les concentrations en antibiotiques mentionnés ci-dessus et incuber dans les mêmes conditions que précédemment.
3. Après 36 à 40 h, les cultures preinduce en ajoutant 2 ul acetosyringon (200 pM concentration finale), 100 ul de 40% (p / v) de solution de glucose et de 200 pi de tampon de 1 M de MES pH 5,6. Incuber pendant la nuit.
4. Préparer 100 ml d'un tampon d'infiltration 2x (sels basaux 100 g / L de saccharose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige et Skoog, Ajuster le pH à 5,6 avec de l'hydroxyde de potassium).
5. Mesurer la DO ₆₀₀ des cultures avec des dilutions 1:05 jusqu'à atteindre une DO ₆₀₀ de 5-6. Calculer le volume de culture nécessaire pour 30 ml de milieu d'infiltration à DO _600. Ajouter 15 ml de tampon d'infiltration 2x, puis ajouter H ₂ O déminéralisée pour rendre le tampon jusqu'à 30 ml.
6. Prendre des plantes de serre et utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxial de la 3 ^e à 5 ^e feuille du haut pour faciliter l'infiltration.
7. Utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxiale des feuilles pour faciliter l'infiltration.
8. Remplir une seringue avec du milieu de l'infiltration et de le mettre (sans aiguille) sur l'une des entailles faites précédemment. Supporte seringue avec un doigt sur le côté ventral de la feuille. Appuyez sur le support avec soin dans le tissu des zones de la feuille interveinales. Note: Après infiltration, de cultiver les plantes dans une serre, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. En outre, maintenir une proportion égale de untreated, plantes non-expression transitoire (NTEPs) que les contrôles, dans les mêmes conditions que les plantes infiltrés.

3. Évaluation de TrCel5A-mCherry expression dans les feuilles des plantes

1. Après 4-6 jours, prendre des plantes infiltrées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry de l'effet de serre et les placer dans une pièce sombre pour l'analyse de fluorescence.
2. Pour visualiser la fluorescence dans des sections de feuilles exprimant TrCel5A-mCherry, plantes d'éclairage utilisant une source de lumière portable émettant de la lumière verte à 515 nm avec un filtre rouge (620-750 nm). Remarque: Dans une caractérisation approfondie de l'expression des protéines dans les feuilles des plantes peut être réalisé en feuilles minces sectionnement avec un vibratome et examen à la lumière et microscopie de fluorescence. Pour cette suivez les étapes ci-dessous:
   1. Couper de petites sections d'environ 5 x 5 mm de taille d'une feuille infiltré et les incorporer dans 4% d'agarose dissous dans 50 mM de tampon phosphate (pH 5,7).
   2. Cutsection de 80 à 90 um de taille à partir de feuilles en utilisant un vibratome embarqués. Placez-les sur une lame de microscope, couvrir avec un tampon ou une lamelle et examiner les en utilisant un microscope à un grossissement de 10X avec un détecteur de fluorescence, en utilisant la même longueur d'onde et de filtrage ci-dessus.

4. TrCel5A extraction à partir de feuilles de tabac

1. Couper des morceaux de feuilles de tabac pour un poids approximatif de 1 g de plantes infectées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A et placer dans un mortier préalablement refroidi à l'azote liquide. Ajouter une quantité appropriée de l'azote liquide pour les échantillons. Grind laisse à poudre à l'aide d'un pilon préalablement refroidi.
2. Ajouter 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM à la matière de la feuille de sol et mélanger jusqu'à ce que la majorité de la matière de la feuille se trouve en suspension. Extrait du Centrifuger à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et à prendre surnageant contenant des protéines.
3. Centrifuge l'extrait à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et de prendre surnageant contenant des protéines en faisant attention de ne pas perturber le culot. Éliminer le culot.
4. Purifier partiellement TrCel5A par incubation du surnageant contenant des protéines à 55 ° C pendant 10 min. Laisser reposer à température ambiante pendant encore 10 min, puis centrifuger à 15 000 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées d'obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
5. Répéter le procédé de purification partielle pour les plantes non infiltrées d'obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.

5. SDS-PAGE, transfert de Western, et Azo-CMC Zymographie de TrCel5A-mCherry

1. Achat ou préparer 12% (p / v) des gels de SDS-PAGE que par des méthodes établies ^15.
2. Dissoudre la CMC dans l'eau pour obtenir un (m / v) solution à 1,5%. Pour faire des gels de CMC-SDS-PAGE, substituer 1 ml de 1,5% de CMC à 1 ml d'eau dans une solution de 10 ml de gel de SDS-PAGE mélange, résultant en un 0,1% (p / v) de CMC + 12% (p / v ) gel SDS-PAGE mélange. Verser gel normalement. Remarque: S'assurer que la CMC dans la solution initiale est complètement dissous par une combinaison d'agitation et chauffage à 40 ° C (répéter directement avant la préparation de la solution de gel).
3. Dénaturer les échantillons par ébullition en présence de SDS, selon des méthodes établies ^12. Comme témoin positif, en utilisant une dilution 1:500 d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei, tel que T. reesei ATCC 26921. Comme témoin négatif utiliser une solution de protéines de même préparé à partir de feuilles non infiltrées (NTEPs).
4. Effectuer le électrophorèse selon les protocoles normaux ^15,par exemple, l'utilisation de 200 V pendant environ 50 min avec la électrophorèse interrompu une fois que le front de colorant atteint le bas du gel.
5. Une tache gel de SDS-PAGE en utilisant 0,1% (p / v) de bleu brillant de Coomassie et destain en utilisant un mélange méthanol / acide acétique glacial. Remarque: coloration rapide et décoloration peuvent être effectuées en chauffant légèrement la coloration et décoloration des solutions, c'est à dire en utilisant un micro-ondes pendant environ 15 secondes pour se réchauffer (mais pas bouillir) d'abord la coloration et les solutions de décoloration, de changer la solution de décoloration après 10 min , ou lorsqu'il est refroidi, et répéter avec la nouvelle solution de décoloration.
6. Effectuer un Western blot d'une gel SDS-PAGE en utilisant des protocoles établis ^16,17. Utiliser les anticorps suivants: un anticorps polyclonal de lapin contre un anticorps anti-lapin de région Fc His-tag (primaire) et une chèvre polyclonal qui a été conjugué à une phosphatase alcaline (secondaire). Remarque: Anticorps secondaires doivent être choisis pour permettre la visualisation en utilisant nitrobleu tétrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sel de p-toluidine (NBT / BCIP), comme décrit ^18.
7. Effectuer protéine dans le gel de repliement sur le 0,15% (p / v) de gel de CMC SDS-PAGE par incubation du gel dans 1,5% (p / v) β-cyclodextrine, le phosphate-citrate buffer 20 mM, pH 6,5, à température ambiante, avec agitation douce pendant 15 min ^19.
8. Jeter la solution de β-cyclodextrine et laver rapidement le gel avec H ₂ O. Incuber à température ambiante dans 50 mM de tampon d'acétate de sodium (pH 4,8) pendant encore 15 min. Effectuer zymographie en utilisant la CMC à 0,15% CMC gel SDS-PAGE repliée en faisant incuber le gel dans 30 mM de tampon acétate de sodium pH 4,8 pendant 20 min à 50 ° C.
9. Effectuer zymographie en utilisant la CMC repliée 0,15% (p / v) de CMC gel SDS-PAGE, le gel par incubation dans 30 mM de tampon acétate de sodium (pH 4,8) pendant 20 min à 50 ° C.
10. Colorer le gel pendant 10 min en utilisant un 0,1% p / v de solution de rouge Congo et destain pendant 30 min ou jusqu'à ce que les bandes claires sont observées en utilisant 1 M de NaCl. Laver le gel avec 0,3% (v / v) d'acide acétique pour une imagerie plus claire.

6. 4 MUC Dosage de l'activité de TrCel5A

1. Préparer une solution stock de 10 mM 4 MUC dans 50% (v / v) méthanol, et de le stocker dans l'obscurité à la température ambiante
2. Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de travail 4-MUC 2x, composé de 1 mM de 4-MUC et 60 mM d'acétate de sodium, pH 4,8.
3. Effectuer ce test sur ​​des échantillons contenant 100 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible), 100 ul d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. 1:1000 reesei, et pur H ₂ O, respectivement. Tester chaque échantillon en triple exemplaire.
4. Ajouter 100 ul de la solution de travail 4-MUC dans des puits séparés d'une plaque de 96 puits, puis ajouter 100 ul de chaque échantillon.
5. Déterminer 0 min timepoint de 4-MU fluorescence à travers la spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 360 ​​nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.
6. Incuber les plaques à 20min à 50 ° C, recouvertes avec des couvercles d'adhésif pour empêcher l'évaporation. Arrêter la réaction par le gel (ou en combinant 100 pi 0,15 M de glycine, pH 10,0, et 100 ul d'échantillon dans une plaque séparée).
7. Déterminer le point de terminaison de 4-MU fluorescence par spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 360 ​​nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm. Soustraire 0 min de point de terminaison (20 min) timepoint pour obtenir le changement de valeurs de fluorescence.

7. Azo-carboxyméthyl cellulose Dosage de l'activité de TrCel5A

1. Préparer un stock de 1,5% (p / v) Azo-CMC qui est stocké à la température ambiante, et une solution de précipitation contenant de l'acétate 18 mM de zinc, 0,5 M d'acétate de sodium, pH 5 et 80% d'éthanol (v / v), entreposer à manger température.
2. Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de CMC Azo-2x travail, composé de 1% (p / v) Azo-CMC (dans H ₂ O) et de 60 mM d'acétate de sodium, pH 4,8.
3. Moissonneuse 50 ul d'échantillon et 50 ul de travailsolution durable en tubes de 1,5 ml.
4. Les échantillons d'essai contenant 50 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimé de manière transitoire); 100 pl d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei dilué 1:1000; et pur H ₂ O. Échantillons et des normes en triple.
5. Incuber les échantillons pendant 20 min à 50 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 250 ul de solution de précipitation. Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 10 secondes pour assurer des solutions ont été complètement combinés.
6. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min, puis à nouveau vortex. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min. Prélever 200 ul de chaque échantillon surnageant à une plaque de 96 puits, en prenant soin de ne pas perturber le culot.
7. Dosage par spectroscopie d'absorbance à une longueur d'onde de 590 nm.

8. PAHBAH Dosage de TrCel5A

1. Utilisez un poinçon à découper un cercle (~ de 5,5 mm de diamètre) de papier filtre. Ajouter 100 ul de 60 mM NaAc, pH 4,8, et 100 pi d'échantillons, soit contenant des protéines de feuille (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible) ou un T. commerciale mélange de cellulases reesei, dilué 1:1000, et incuber avec des cercles de papier filtre pendant 20 heures à 50 ° C avec 300 tours en secouant. Pour chaque échantillon incubé avec du papier filtre, incuber également une solution double sans papier filtre comme échantillon-commandes individuelles.
2. Préparer un 330 mM p-hydroxy hydrazide de l'acide benzoïque (PAHBAH) solution A en dissolvant PAHBAH en H ₂ O avec l'ajout de 5 ml de HCl concentré pour un total de 100 ml de solution, et conserver à la température ambiante. Nota: Les meilleurs résultats sont obtenus en ajoutant le HCl à un plus petit volume de PAHBAH suspension, c'est à dire 30 ml, que l'on agite à une température d'aider la dissolution avant d'effectuer le volume à 100 ml avec de l'H ₂ O.
3. Préparer PAHBAH solution B, contenant du citrate de sodium 50 mM, 10 mM de chlorure de calcium, et du NaOH 500 mM et stocker à température ambiante.
4. Immediately avant le dosage, préparer une solution de travail de 1,5 x 1 ml de réactif PAHBAH à 9 ml de solution tampon, stocker sur de la glace jusqu'à utilisation (pour être utilisé dans les 4 heures).
5. Préparer les échantillons en thermostables 0,2 ou 0,5 ml tubes. Moissonneuse 5 pi de chaque solution incubée avec un papier filtre (étape 8.1), 45 ul de H ₂ O et 100 ul de solution de travail PAHBAH. contrôles d'échantillons (échantillons incubés sans papier filtre) doivent être exécutés dans les mêmes concentrations (5 échantillons de pi, 45 pi H ₂ O, solution de travail de 100 pi de PAHBAH). Tester également des normes 5 (5 ul) contenant entre 0 et 0,2 g / L de glucose pur et H ₂ O. Échantillons et des normes en triple.
6. Incuber les échantillons pour exactement 10 min à 100 ° C, puis refroidir à température ambiante pendant exactement 10 min. solutions de pipette dans une plaque de 96 puits et le dosage par spectroscopie à une longueur d'onde de 410 nm. Soustraire échantillons-contrôles individuels (incubées sans papier filtre) à partir d'échantillons d'obtenir finalevaleurs.

Résultats

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d'expression transitoire (figures 1A et 1B). L'examen du profil d'expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l'expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D).

Extraction des protéines solubles totales a été effectué sur des plants de tabac q...

Discussion

L'expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants ^1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l'utilisation de différentes localisations ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-méthylumbellifèreryl &bêta ;-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acide acétique	ROTH	3738
Acétosyringon (concentré)	ROTH	6003
Antibiotique - kanamycine	ROTH	T832
Antibiotique - rifampicine	ROTH	4163
Antibiotique - carbénicilline	ROTH	6344
Anticorps anti-His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Anticorps anti chèvre AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxyméthylcellulose	MEGAZYME	S-ACMC
&beta ;-cyclodextrine	SIGMA-ALDRICH	C4805
Chlorure de calcium dihydraté	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxyméthylcellulose	ROTH	3333.1
Cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Rouge Congo	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie bleu brillant G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
Éthanol	ROTH	K928
Papier filtre - Papier buvard Rotilabo	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES tampon	ROTH	4256
Méthanol	ROTH	8388
Citrate de sodium	ROTH	3580
Dodécylsulfate de sodium	SERVA	20765
Hydroxyde de sodium	ROTH	6771
Sol, Einheitserde classic  ;	Spectromètre PATZER GMBH
- Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  ;	SIGMA-ALDRICH	H9882
Saline tamponnée	au phosphate ROTH	1058
Source de lumière UV - BLAK RAY	UVP
- VT1000S	Leica