Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

Summary

Cet article se concentrera sur le développement de surfaces recouvertes de polymères pour la culture stable à long terme d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches.

Abstract

Actuellement, l’une des principales limitations de la biologie cellulaire est le maintien d’un phénotype cellulaire différencié. Les matrices biologiques sont couramment utilisées pour la culture et le maintien d’hépatocytes primaires et pluripotents dérivés de cellules souches. Bien que les matrices biologiques soient utiles, elles permettent une culture à court terme d’hépatocytes, limitant ainsi leur application à grande échelle. Nous avons tenté de surmonter les limites en utilisant un revêtement polymère synthétique. Les polymères représentent l’une des plus grandes classes de biomatériaux et possèdent un large éventail de propriétés mécaniques, physiques et chimiques, qui peuvent être ajustées en fonction de leurs besoins. Il est important de noter que ces matériaux peuvent être mis à l’échelle selon des normes de qualité garanties et afficher une cohérence d’un lot à l’autre. Ceci est essentiel si les cellules doivent être expansées pour le criblage à haut débit dans l’industrie des tests pharmaceutiques ou pour la thérapie cellulaire. Les polyuréthanes (PU) sont un groupe de matériaux qui se sont révélés prometteurs dans la culture cellulaire. Nos progrès récents dans l’optimisation d’une surface recouverte de polyuréthane, pour la culture à long terme d’hépatocytes humains présentant un phénotype stable, sont présentés et discutés.

Introduction

Les matières biologiques ont été largement utilisés dans l'entretien et la différenciation des cellules souches pluripotentes ^1. Tout en permettant, ces substrats biologiques contiennent souvent une multitude de composants définis. Matrigel est un substrat communément utilisé pour la culture de cellules souches et de la différenciation. Malheureusement, sa composition variable influe sur la fonction des cellules et le phénotype. Bien qu'une grande variété de matrices biologiques alternatives, mieux définis ont été utilisés ^2-7, leur origine animale ou pauvres évolutivité en fait des candidats inappropriés pour la production industrielle. Par conséquent, l'identification des alternatives synthétiques, à composition définie et des performances fiables, sont des objectifs clés de la recherche sur les cellules souches.

Dans une tentative pour surmonter les limitations des indéfinis substrats de culture de cellules, des collaborations interdisciplinaires entre la chimie et de la biologie ont identifié des matériaux synthétiques ayant la capacité de supporter le phénotype cellulaire. Synthsubstrats étiques sont évolutives, rentables, et peuvent être fabriqués dans des structures 3D complexes, imitant l'environnement in vivo. En raison de ces propriétés des substrats synthétiques ont été largement utilisés pour supporter et entraîner la différenciation de nombreux types de cellules ^8-10.

Essais de débit de pointe et haute ont facilité la sélection rapide de matériaux synthétiques, de grandes bibliothèques, et livré de nouveaux matériaux aux propriétés flexibles avec de larges applications dans la recherche et le développement ^11-13 biomédicale. Utilisant à haut débit, la technologie de dépistage micro-réseau polymère, nous avons identifié rapidement d'une simple polyuréthane (PU134), adapté pour l'entretien des hépatocytes dérivés de cellules souches humaines. Ce polymère a été jugée supérieure à des substrats provenant des animaux en ce qui concerne la différenciation et la fonction des hépatocytes ^14-16. Nous avons par la suite optimisé le processus conditions de revêtement, de la topographie et de stérilisation pour accéder à effetssur le rendement en polymère stabilisant fonction des hépatocytes et la durée de vie. Ceci a des implications importantes en ce qui concerne la compréhension des fondamentaux de la biologie des hépatocytes pour la modélisation à base de cellules et des applications en médecine régénérative.

La technologie décrite ici est un exemple de la façon dont la surface d'un polymère synthétique peut être optimisée pour conserver le phénotype cellulaire. Nous croyons que la combinaison de cette technologie avec un hépatocyte libre protocole de différenciation de sérum efficace a le potentiel de fournir une production évolutive des hépatocytes pour l'utilisation de la modélisation in vitro et la médecine régénérative.

Protocol

1. Synthèse de PHNGAD (poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), de l'acide adipique--ALt] diol)

Schéma 1: Synthèse de PHNAGD représentation schématique de la synthèse de PHNAGD.. PHNAGD a été préparé par la réaction de 1,6-Hexanodiol, le diéthylène glycol, neoppentyl glycol et d'acide adipique. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), l'acide adipique--ALt] diol.

1. Appliquer un traitement thermique à des monomères de 1,6-hexanediol, le di (éthylène glycol) et du néopentylglycol à 40 ° C pendant 48 heures dans une étuve à vide pour éliminer l'eau résiduelle. Laisser froid jusqu'à température ambiante sous vide.
2. Ajouter 22 mmol de chaque monomère et d'acide adipique (55 mmol) dans un ballon à fond rond à deux cols équipé d'un barreau agité et raccordé à un appareil de Dean-Stark.
3. Placez tout l'ensemble sous vide et chauffer doucement la glassware à 40 ° C pendant 6 heures, afin d'éviter toute absorption d'humidité au cours de l'addition de la substance chimique dans le ballon.
4. Ajouter à la seringue, goutte à goutte, 0,0055 mole de titane de catalyseur (IV) de butoxyde.
5. On agite le mélange réactionnel à 180 ° C, sous une atmosphère _{de N2} pendant 24 heures, et recueillir l'eau résiduelle dans le piège de Dean-Stark. Laissez le produit refroidir à température ambiante.

Synthèse de 2 PU134

Schéma 2: Synthèse de PU134 représentation schématique de la synthèse de polyuréthanne PU134 134 a été préparé par la réaction de 1,0 équivalent d'un PHNGAD avec 2,0 équivalents d'un 4,4 '-méthylène bis (isocyanate de phényle), suivi par l'addition de 1,0. équivalents d'un agent d'allongement de chaîne 1,4-butanediol.

1. Mélanger un équivalent de la PHNGAD polyol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) avec deux équivalents de 4»4-méthylène-bis (isocyanate de phényle) (6,4 mmol) dans anhydre N, N-diméthylformamide (12 ml).
2. On agite le mélange réactionnel à 70 ° C, sous une atmosphère _{de N2.}
3. Ajouter à la seringue, goutte à goutte le titane de catalyseur (IV) butoxyde (0,8% en poids).
4. Après 1 heure, ajouter un équivalent de l'allongeur de chaîne 1,4-butanediol (3,2 mmole). Augmenter la température à 90 ° C et agiter pendant 24 heures sous une atmosphère _de N _2.
5. Après la réaction, collecter le polyuréthanne par précipitation par addition d'éther diéthylique (hexane ou de l'eau peut aussi être utilisé) goutte à goutte dans la solution de réaction jusqu'à ce que la précipitation se produit.
6. Centrifuger la solution à 5300 g pendant 5 min.
7. Décanter le surnageant et sécher à 40 ° C dans une étuve à vide jusqu'à ce que le solvant s'évapore.
   Remarque: Afin de garantir que le produit final de la réaction possède les bons paramètres en ce qui concerne la distribution de la masse moléculaire, le grou fonctionnelps du polymère, et les températures de fusion et de transition vitreuse, diverses techniques analytiques et les méthodes peuvent être utilisées, telles que la Chromatographie de permeation sur gel ou par spectroscopie FITR.

3 Préparation des solutions de PU134

1. Peser 200 mg de PU134 dans une bouteille en verre.
2. Diluer PU134 à une concentration finale de 2% dans un certain nombre de solvants: chloroforme, un mélange de chloroforme et de toluène à 1: 1, le tétrahydrofuranne, et la combinaison de tétrahydrofurane et de dichlorométhane dans le rapport 1: 1.
   Remarque: L'élection du droit solvant varie en fonction du polymère à utiliser. Différents solvants possèdent des points d'ébullition différents qui peuvent influer sur la solubilisation du polymère.
3. Agiter la solution vigoureusement pendant 20 min à température ambiante en utilisant un agitateur à une vitesse de 200 MOT / min, jusqu'à ce que la solution devienne homogène et aucun précipité n'est observé.

4. revêtement de lames de verre avec PU134

1. Placez un roue 15 mm ² lamelle sur la tournette.
2. Appliquer 50 ul de la solution de chaque PU134 à l'aide d'une pipette. Ajuster le volume de la solution de PU134 en conséquence de la taille de la lamelle couvre-objet en maintenant le volume nécessaire à la surface rapport proportionnel.
3. Faites tourner chaque lamelle pendant 7 secondes à 23 x g.
4. Lamelle air sec à température ambiante pendant au moins 24 heures avant la stérilisation.

5. irradiation de Coverslip

1. Gamma-irradier polymère lamelle revêtue par application d'une dose de 10 Grays l'aide d'un irradiateur de laboratoire pendant 12 min.
2. UV irradier revêtu de polymère en utilisant une lamelle 30 W, lampe UV pour 16 min de chaque côté.
3. Placer la lamelle revêtue de polymère dans une plaque de culture de tissu approprié en fonction de la taille de la diapositive.

6. microscopie électronique à balayage

1. Or polymère manteau lamelle par pulvérisation pour 200 secondes dans une atmosphère de 5 x 10 ^-1 millibars de pression.
2. Capturez le micrographies de la lamelle couvre-objet revêtu de polymère en utilisant un microscope électronique à balayage à une tension d'accélération de 20 kV en mode de formation d'image d'électrons secondaires.

7. microscopie à force atomique Observations

1. Balayer une zone de 20 x 20 um de la surface du polymère.
2. Mettre en place une vitesse de balayage de 1,32 Hz à 1,60 Hz.
3. Mettre en place une résolution de 512 x 512 pixels dans la région balayée.
4. Calculer la moyenne quadratique (RMS ou Rq) du revêtement à l'aide de la moyenne des écarts de hauteur à partir de prises au plan moyen de données d'image exprimée en tant que:
   
   Où Zi est la valeur courante de Z, et N est le nombre de points à l'intérieur de la zone donnée.
5. 7.5 Calculer l'écart ou rugosité de surface moyenne (Ra) de l'image en utilisant,
   
   Où Z (x) est la fonction qui décrit til analyse le profil de surface en termes de hauteur (Z) et la position (x) de l'échantillon sur la longueur d'évaluation de "L". Ra représente la valeur moyenne de la surface par rapport au plan médian.

8. culture cellulaire et de la différenciation

1. Culture et différencier la lignée humaine de cellules souches embryonnaires (CSEh) H9 comme décrit dans Hay ^17.
2. Détacher les cellules en utilisant un réactif de dissociation et les Réensemencement sur ​​des lames revêtues PU134 à 9 jours du processus de différenciation, en présence d'un milieu sans sérum comme décrit dans Szkolnicka ^18,19.
   Remarque: L'utilisation d'une dissociation enzymatique des cellules est préférable de détachement de cellule physique.

9. cytochrome P450 de dosage fonctionnel

1. Mesurer l'activité du CYP3A suivant les instructions du fabricant.
2. Incuber CSEh hépatocytes dérivés au jour 13 ou 19 jours, et les médias sans cellules - comme contrôle négatif, avec le substr appropriémangé pendant 5 heures à 37 ° C.
3. Recueillir les surnageants de cellules et les médias, effectuer l'essai selon les instructions du fabricant.
4. Mesurer le niveau de l'activité de CYP et normalisée par rapport à la zone de surface (cm ^2).

10 Immunocoloration

1. Laver CSEh hépatocytes dérivé avec du PBS, pendant 1 min, répéter deux fois.
2. Ajouter glacée 100% de méthanol pour fixer les cellules, dans -20 ° C pendant 10 min.
3. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter deux fois.
4. Incuber les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA pendant 1 heure à température ambiante.
5. Aspirer la solution de PBST et ajouter l'anticorps primaire approprié dilué dans PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1%, incubation à 4 ° C avec agitation douce O / N.
6. Laver les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1% pendant 5 minutes et répéter trois fois.
7. Diluer l'anticorps approprié dans du PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, ajouter aux cellules et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h sous agitation douce.
8. Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter trois fois.
9. Ajouter MOWIOL 488 (contenant DAPI 1: 1,000) à chaque puits, ajouter une lamelle doucement pour réduire le nombre de bulles d'air. Magasin cellules fixé à 4 ° C dans l'obscurité. Observer la coloration à l'aide d'un microscope avec filtre approprié et d'une lampe fluorescente. Les anticorps primaires et secondaires optimisés sont répertoriés dans le tableau 1.

Results

Le solvant polymère influence la topographie de la surface revêtue de polymère

Le polyuréthane 134 a été solubilisé sous forme de chloroforme, seul ou en association avec du toluène, du tétrahydrofurane ou du dichlorométhane et les lames de verre ont été recouvertes d’un revêtement par centrifugation avec les différentes formulations. La microscopie électronique à balayage (MEB) et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisées pour caractériser les propriétés physiqu...

Discussion

De nombreuses méthodes actuelles utilisées pour générer des hépatocytes à partir de cellules souches reposent sur des matrices indéfinies d’origine animale. Ces substrats peuvent être coûteux et très variables, affectant la fonction et la stabilité des cellules, ce qui représente un obstacle important à l’application. Par conséquent, nous avons effectué un criblage de matériaux synthétiques qui soutiennent la culture d’hépatocytes dérivés de cellules souches. Nous avons identifié un polyuréthane simple (PU134), formé par...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthèse, préparation, enrobage et caractérisation de lamelles enrobées de polymère PU134
	Shaker Edmun Bü ; hler	KS-15
Irradiateur	CIS Biointernational	IBL 637  ;
Spin coater	Système de revêtement spécialisé	P-6708
Microscope électronique à balayage  ;		XL30CPSEM
Microscope à force atomique	Nanoscope DimensionV, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Ampoule UV Promega	V8902
Logiciel d’analyse
Microscope à fluorescence	Olympus	TH45200	Utiliser le logiciel Volocity 4
Plaques de culture tissulaire	Corning, Royaume-Uni  ;	3527
lames de verre	Fournitures de laboratoire scientifique	MIC3308
Diéthylène glycol	Sigma&ndash ; Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma&ndash ; Aldrich	240117
Néopentyl glycol	Sigma&ndash ; Aldrich	408255
Acide adipique	Sigma&ndash ; Aldrich	9582
anhydre N,N-Dimethylformamide	Sigma&ndash ; Aldrich	227056
Éther diéthylique	Sigma&ndash ; Aldrich	676845
butoxyde de titane (IV)  ;	Sigma&ndash ; Aldrich	244112
1,4-butanediol  ;	Sigma&ndash ; Aldrich	493732
Four à vide	Thermoscientific
4,4'-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma&ndash ; Aldrich	101688
Tétrahydrofurane	Sigma&ndash ; Aldrich	401757
Coucheuse par pulvérisation cathodique	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate tampon salin (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Conserver à température ambiante
PBST, PBS composé de 0,1 % TWEEN 20  ;	; Fournitures de laboratoire scientifique Ltd	EC607  ;
Méthanol	; Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Composé de Tris HCl et de glycérol selon les instructions
Culture cellulaire et Dosage fonctionnel
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013