Transplantation de queue peau d'étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

Résumé

La greffe de peau de queue est un modèle puissant pour étudier le rejet dépendant des lymphocytes T et l’induction de la tolérance au cours des réponses immunitaires allogéniques chez la souris. Les avantages de ce protocole sont la chirurgie invasive mineure et la facilité de surveillance sans qu’il soit nécessaire de sacrifier la souris receveuse.

Résumé

L’étude des réponses des lymphocytes T et de leurs conséquences lors de la reconnaissance d’allo-antigènes nécessite un modèle qui permette de distinguer les lymphocytes T donneurs et hôtes, de suivre facilement le greffon et d’adapter le système afin de répondre à différentes questions immunologiques. Medawar et ses collègues ont établi la greffe allogénique de peau de queue chez la souris en 1955. Depuis, le modèle de greffe de peau n’a cessé d’être modifié et adapté pour répondre à des questions spécifiques. L’utilisation de la peau de la queue rend ce modèle facile à marquer pour le rejet du greffon, ne nécessite ni préparation approfondie ni anesthésie profonde, est applicable aux animaux de tous les antécédents génétiques, décourage la nécrose ischémique et permet une intervention chimique et biologique.

En général, les lymphocytes T allogéniques CD4⁺ et CD8⁺ sont responsables du rejet des allogreffes car ils reconnaissent les antigènes majeurs d’histocompatibilité non appariés de différentes souches de souris. Plusieurs modèles ont été décrits pour activer les lymphocytes T allogéniques chez des souris transplantées de peau. L’identification de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I et II dans différentes souches de souris, y compris les souris C57BL/6, a été une étape importante vers la compréhension et l’étude des alloréponses médiées par les lymphocytes T. Dans le modèle de transplantation de peau de queue décrit ici, une mutation en trois points (I-A^bm12) dans le sillon de présentation de l’antigène de la molécule du CMH de classe II (I-A^B) est suffisante pour induire une forte activation allogénique des lymphocytes T CD4⁺ chez les souris C57BL/6. Les greffes de peau de souris I-A^bm12 sur des souris C57BL/6 sont rejetées dans un délai de 12 à 15 jours, tandis que les greffes syngéniques sont acceptées jusqu’à 100 jours. L’absence de lymphocytes T (souris CD3^-/- et Rag2^-/-) permet l’acceptation de la greffe de peau jusqu’à 100 jours, ce qui peut être surmonté par le transfert de 2 x 10⁴ lymphocytes T de type sauvage ou transgéniques. Les lymphocytes T transférés par adoption prolifèrent et produisent de l’IFN-γ chez les souris Rag2^-/- transplantées I-A^bm12.

Introduction

La transplantation d'organes solides tels que la peau, le cœur et les reins est maintenant une procédure standard dans la pratique médicale dans le monde entier ^1. Organes transplantés avec succès peuvent être rejetés par l'activation du système immunitaire receveur, qui reconnaît les antigènes majeurs d'histocompatibilité du donneur. Patients transplantés donc besoin d'un traitement avec des médicaments immunosuppresseurs ^2. Allogreffe de peau chez la souris a été créé par Medawar et ses collègues en 1955 et a été utile pour identifier les molécules ciblées plus tard décrit comme complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II. Depuis lors, le modèle de greffe de peau a été continuellement modifié et adapté pour étudier le rôle des sous-ensembles de lymphocytes T et de la pertinence de l'intervention chimique et biologique dans la suppression du rejet de greffe ^2-4. La peau de l'oreille et du tronc sont plus difficiles à préparer et sont plus sensibles à l'hypoxie et la nécrose de la peau queue ^5; cependant,la procédure de transplantation est similaire. En outre, le suivi des greffes de peau de la queue est facile en raison de la texture des cheveux caractéristique de la peau.

Cet article prévoit une procédure détaillée pour le CMH de classe II inadéquation transplantation queue peau qui permet l'étude des différents aspects de CD4 ⁺ T à médiation cellulaire rejet d'allogreffe et de tolérance chez les souris. La mutation à trois points naturel dans la molécule du CMH de classe II ^I-Ab (appelé IA ^{BM12) 6-9} est suffisante pour induire le rejet des allogreffes de la peau chez des souris C57BL / 6 souris ^8. La molécule ^d'BM12 IA active les cellules T CD4 ⁺ avec divers récepteurs cellulaires αβ-T (TCR) des chaînes à partir de souris C57BL / 6, dont les lymphocytes T Vα2Vβ8-TCR spécifiques ont été identifiées, afin de générer une souris TCR transgéniques ^10. Le transfert adoptif de lymphocytes T Vα2Vβ8-TcR-spécifiques a été utilisée pour établir un modèle de rejet dans C57B immunodéficientesL / 6 Rag2 ^{- / -} souris transplantées avec la peau IA ^BM12.

Les différences génétiques entre donneur et receveur impact sur le résultat de l'acceptation de la greffe et le rejet. Il existe différents types de greffes: autogreffes sont des greffes du destinataire individuel lui-même; syngrafts et allogreffes sont des greffes de personnes génétiquement identiques et sans lien génétique respectivement. Acceptation de différentes greffes d'organes allogéniques a été démontrée par intervention chimique et biologique chez les patients et les modèles de souris ^11,3,4. Dans une approche de base, anticorps anti-CD3-traité souris C57BL / 6 a montré une survie prolongée des IA ^BM12 queue-peau (données non publiées). L'épuisement des CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ avant la transplantation dans des souris receveuses abouti à l'acceptation de CMH de classe I et II greffes incompatibles (Rev. en ^12). Fait intéressant, le rejet des greffes de peau dépend de la présence de cellules CD4 ⁺ Cellules T (Rev. en ^12). Dans ce modèle, le ciblage des interactions spécifiques entre les différentes cellules du système immunitaire en bloquant les molécules de co-stimulation avec des anticorps ou avec suppression des cellules T régulatrices pourrait induire une tolérance (données non publiées). En effet, le blocage à la fois CD40 et CD28 conduit à long terme allogreffe de tolérance cutanée ^13,14.

Transplantation queue-peau est facile à réaliser et facile à contrôler par rapport à la transplantation d'autres organes. En outre, les greffes de peau de la queue sont faciles à préparer et sont moins sensibles à l'ischémie que les autres tissus de la peau. Contrairement aux anesthésiques injectés, l'utilisation de gaz anesthésique (de isofluorane) lors de la transplantation réduit à la fois la procédure et le temps de récupération de destinataire. Curling de la greffe de peau de la queue, ce qui peut conduire à une cicatrisation incomplète, le rejet de greffe, est empêchée par l'application de colle pour tissus. En outre, le modèle de transplantation queue peau IA ^BM12 active exclusivement CD4 ^{+ Cellules T dans les deux immunocompétents et des souris immunodéficientes (de la même origine génétique) de faciliter l'interprétation des résultats.}

Ce protocole décrit un modèle de souris fiables, reproductibles et facilement contrôlé qui permet une intervention chimique et biologique. Le modèle est conçu pour enquêter sur le rejet et l'induction de tolérance des greffes de peau queue.

Protocole

Dans cette publication de la vidéo et du protocole, toutes les procédures d'animaux ont été effectuées conformément au protocole de l'animal approuvé par l'autorité cantonale de Bâle-Ville, Suisse. Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles là où c'est possible.

1. Préparation de chirurgie

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux et gaze avant de l'utiliser.
2. Chauffer le coussin chaud et organiser instruments chirurgicaux sur la table (Table des Matières / Méthodes).
3. Ouvrez les bandages bande de doigt. Appliquez de la vaseline sur le pavé de la plaie avec un coton-tige (assurez-vous que la gaze est entièrement recouvert).
4. Peser les souris et administrer l'analgésie buprénorphine 0,05 mg / kg de poids corporel. Remarque: ce sera une analgésie immédiatement après la transplantation.

2. Préparation de la Queue-peau pour la transplantation

1. Euthanasier souris donneuses (par exemple, IA ^BM12) par asphyxie au _CO2 et disinfect les queues avec une solution de désinfection avant l'excision.
2. Placez la queue avec la bande noire sur un tableau en plastique propre et couper longitudinalement tout au long de la ligne médiane, une incision superficielle impliquant que la couche de la peau.
3. Retirez la peau de la queue en utilisant une pince de préhension.
4. Mettez la queue-peau dans une boîte de culture de 10 cm de cellule remplie avec 10 ml de HBSS.

3. Procédure chirurgicale

1. Anesthésier les souris receveuses (par exemple, des souris C57BL / 6) par l'inhalation d'une solution d'isofluorane à 3% dans une boîte à induction transparent. Remarque: Il faut 3-5 minutes pour la souris pour atteindre plan chirurgical anesthésie. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
2. Placez la souris sur le tapis tiède et appliquer 1,5% isofluorane par un masque et des ânes bouche chaque réflexe animal par orteil pincement.
3. Raser le site dorsale des souris receveuses (par exemple, C57BL / 6) et enlever les poils de contamination en utilisant un sw de gaze secab.
4. Désinfecter rasé le site de transplantation avec une solution aseptique.
5. Pincer la peau avec des pinces dans le site milieu / droite du dos et utiliser des ciseaux courbes à faire une incision ronde d'environ 1 x 0,6 cm.
6. En cas de saignement, puis nettoyer la plaie avec un coton-tige stérile.
7. Évaluer la taille de l'incision et couper une greffe de la taille estimée de la queue-peau à l'aide du scalpel.
8. Coupez les coins pour contourner la transplantation.
9. Chargez la greffe sur le scalpel, l'excès de HBSS sec sur un coton-tige stérile et le placer dans le lit de la greffe de la souris receveuse.
10. Éviter le chevauchement des donateurs et de la peau de l'hôte et appliquer l'adhésif de tissu sur la zone de contact exclusivement.
11. Appliquer un enduit sans plis autour de la taille de la souris.
12. Appliquer un bandage non élastique adhésif pour fixer le plâtre à la souris (3 mm décalé).
13. Inciser avec les ciseaux environ 3 mm dans le site ventrale supérieure du bandage. Note: Ceci est pour éviter trapping des dents de la souris lors de la phase de récupération.
14. Retirer l'anesthésie-bouche-masque et garder les souris transplantées sur le coussin chauffant jusqu'à éveillé.
15. Retour souris transplantées dans leurs cages quand il est complètement rétabli et évaluer leur mobilité afin de s'assurer que le bandage n'est pas trop serré.
16. Stériliser l'ensemble des instruments chirurgicaux avec l'éthanol 70% avant de procéder à une intervention chirurgicale suivante.

4. Soins post-opératoires

1. Ajouter le sirop contenant du paracétamol à l'eau de boisson (4 mg / ml) et de l'administrer pendant 7 jours.
2. Souris Retour à la salle de l'animal une fois qu'il a récupéré.
3. Suivre de près les souris des signes cliniques, y compris la dépression ou d'autres changements de comportement (alimentaires ou immobilité), apparence anormale (manque de toilettage) ou la posture (horripilation ou posture recroquevillée) pour le moment le pansement est en place (1 semaine).

5. Bandage Removal (6-7 jours post-transplantation)

1. Anesthetize les souris par inhalation d'une solution isofluorane à 3% dans un caisson d'aspiration transparente (voir ci-dessus).
2. Couper bandage en plâtre avec des ciseaux de l'artère et retirez les. Remarque: éviter l'étirement du site de transplantation.
3. Surveillance de la souris transplantées des signes cliniques (voir 4.3) et le score de rejet des greffes de peau (tableau 1). Remarque: Le système de pointage de greffe prend avantage des différentes textures de cheveux sur la queue-peau par rapport à la dorsale peau. L'aspect de la greffe et le rejet est catégorisée en trois niveaux. Peau allogénique (CMH II correspondent pas, par exemple, IA ^BM12) greffes de souris C57BL / 6 immunocompétents sont généralement rejetés dans 12-15 jours post-greffe (propres données et ^15-20).

Résultats

Dans une première approche C57BL / 6 ont été transplantés avec IA ^{allogreffes BM12} et IA ^b syngrafts. Après élimination de bandage, greffes signes manifestes de la cicatrisation sans fermeture de la zone de contact en souris C57BL / 6 (Figure 1A). Après élimination de bandage, CD4 ⁺ T inflammation à médiation cellulaire a conduit à l'apparition de zones nécrotiques (taches rouges) et le rejet des IA ^{allogreffes BM12} dans souris C57BL / 6 dans les 13 jours ...

Discussion

la transplantation de la peau est une méthode largement utilisée pour l'étude de rejet et de la tolérance des lymphocytes T dépendant. Comme le modèle de transplantation de la peau a été établi, plusieurs adaptations et modifications ont été appliquées. Dans la procédure décrite, IA ^BM12 transplantation queue peau est réalisée en utilisant des gaz anesthésiques (de isofluorane). L'utilisation de l'anesthésie au gaz diminue le temps d'exécution et la récupération des souris, ce qui diminue le s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bétadine solution étalon	Mundipharma
Coton-tige	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA
Hansaplast Finger strips	Beierdorf AG	REF.76861
Adhésif tissulaire histoacryle	Braun	REF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x 10 m	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4	Invitrogen	10010015	GIBCO
Gaze stérile, 5 x 5 cm, 8 plis	MaiMed GmbH	21010
Pince à motif étroit	FST	11003-12
Ciseaux à iris fins courbé	FST	14095-11
Ciseaux à iris fins	FST	14094-11
Ciseaux Mayo	FST	14010-15
Ciseaux artériels pointe sphérique 11,5 cm	FST	14080-11
Pince à tissus	FST	11021-14
Lame chirurgicale n° 20	Swann-Morton LTD	3006	Acier au carbone
Poignées de lame chirurgicale	Swann-Morton LTD
Seringue, 1 ml	ARTSANA		Jetable
Temgesic, buprénorphine	ESSEX Chemie AG		0,3 mg/ml
Boîtes de culture tissulaire 10 cm, 60,1 cm2	TPP
Vaseline	Vifor SA
Warm pad	Solis		Type 223