Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.
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Article de méthode
In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le pancréas est un organe essentiel qui régule l’homéostasie du glucose et sécrète des enzymes digestives. La recherche sur l’embryogenèse du pancréas a conduit à la mise au point de protocoles pour produire des cellules pancréatiques à partir de cellules souches 1. L’ensemble de l’organe embryonnaire peut être cultivé à plusieurs stades de développement 2 à 4. Ces méthodes de culture ont été utiles pour tester des médicaments et pour imager les processus de développement. Cependant, l’expansion de l’organe est très limitée et la morphogenèse n’est pas fidèlement récapitulée puisque l’organe s’aplatit.
Nous proposons des conditions de culture tridimensionnelles (3D) qui permettent l’expansion efficace des progéniteurs pancréatiques embryonnaires de souris dissociés. En manipulant la composition du milieu de culture, il est possible de générer soit des sphères creuses, principalement composées de progéniteurs pancréatiques en expansion dans leur état initial, soit des organoïdes complexes qui évoluent vers des progéniteurs en expansion plus matures et se différencient en cellules endocrines, acineuses et canalaires et qui s’auto-organisent spontanément pour ressembler au pancréas embryonnaire.
Nous montrons ici que le processus in vitro récapitule de nombreux aspects du développement naturel du pancréas. Ce système de culture est adapté pour étudier comment les cellules coopèrent pour former un organe en réduisant sa complexité initiale à quelques progéniteurs. C’est un modèle qui reproduit l’architecture 3D du pancréas et qui est donc utile pour étudier la morphogenèse, y compris la polarisation des structures épithéliales et la ramification. Il convient également d’évaluer la réponse aux indices mécaniques de la niche tels que la rigidité et les effets sur la tenségrité de la cellule.
Introduction
culture d'organes constitue un modèle utile qui comble le fossé entre le complexe mais très pertinente dans les enquêtes in vivo et la simulation pratique mais approximative de modèles de lignées cellulaires. Dans le cas du pancréas, il n'y a pas de ligne parfaitement équivalente à progéniteurs pancréatiques bien qu'il existe des lignées cellulaires transformées simulant des cellules endocrines et exocrines cellule. L'adulte pancréas entier ne peut pas être cultivé; îlots endocrines isolées peuvent être maintenus pendant quelques semaines sans prolifération cellulaire et des tranches de tissu peuvent être conservées in vitro pendant 5 quelques heures. Culture de pancréas embryonnaire a été largement utilisé non seulement pour étudier son développement, mais aussi pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses 4,6,7, à l'image des processus 8 ou interférer chimiquement avec eux 9. Deux méthodes de culture d'organes sont principalement utilisés: la première consiste à cultiver des bourgeons pancréatiques sur la fibronectine plaques enduites de 2, ce qui est convenient à des fins d'imagerie; la deuxième option est la culture des organes sur les filtres à l'interface air-liquide qui préserve mieux 3,4 morphogenèse. Bien que très utiles, ces procédés conduisent à un certain degré d'aplatissement; l'expansion des progéniteurs est très limité par rapport au développement normal et à la population de départ est complexe comprenant tous les types de cellules pancréatiques et des cellules mésenchymateuses.
La capacité de la culture et de développer des cellules primaires dispersées est précieux pour étudier les relations de lignage et de découvrir les propriétés intrinsèques des types de cellules isolées 10. Sugiyama et al. 11 pourrait maintenir les progéniteurs du pancréas et des progéniteurs endocrines qui ont conservé certains caractères fonctionnels pour 3-5 jours de culture sur des couches nourricières. Pancreatospheres, semblables à neurosphères 12 et mammospheres 13, ont été élargies de îlots adultes et les cellules canalaires bien que la nature des progéniteurs / cellules souchesqui génèrent ces sphères n'est pas claire. De plus, en contraste avec le développement physiologique, les pancreatospheres contenaient certains neurones 14,15. Sphères ont été récemment produites à partir de progéniteurs pancréatiques embryonnaires 16,17 et régénération pancréas 18 avec une bonne extension des progéniteurs et la différenciation ultérieure, mais n'ont pas réussi à récapituler la morphogenèse.
Des modèles 3D à partir de cellules dispersées et souvent définis que l'auto-organisent dans les organes miniaturisés ont récemment fleuri et simuler le développement ou adulte chiffre d'affaires de plusieurs organes tels que l'intestin 19,20, l'estomac 21, le foie 22, la prostate 23 et la trachée 24. Dans certains cas, la morphogenèse et la différenciation de développement ont été récapitulé en 3D à partir de cellules ES, comme c'est le cas de coupes optiques 25, de l'intestin ou du cerveau 26 27.
Ici, nous avons desCribe un moyen d'étendre progéniteurs pancréatiques multipotentes dissociées dans un échafaudage 3D Matrigel où ils peuvent se différencier et s'auto-organiser.
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Protocole
Ce protocole a pour but de développer organites pancréatiques murines dérivées de E10.5 dissociées des cellules épithéliales pancréatiques.
Le protocole exige l'approbation éthique pour l'expérimentation animale.
1. Dissection de Dorsale pancréatique Bud de E10.5 embryons de souris
- Moyen essentiel sacrifier souris expiré enceintes à jour embryonnaire (E) 10.5, ouvrez l'abdomen avec une paire de ciseaux, enlever les deux cornes utérines et les placer dans une boîte de 10 cm de Pétri remplie avec du phosphate froid tampon salin (PBS) ou Dulbecco modifié (DMEM) conservé dans la glace. L'expérience totale du sacrifice à l'ensemencement des cellules est réalisé en 60 à 90 min pour prévenir les dommages cellulaires.
- Séparer l'utérus en segments d'embryons individuels à l'aide de petits ciseaux. Transférer un embryon dans une boîte de Petri de 35 mm avec du PBS froid et le visualiser sous un microscope à dissection avec l'illumination d'en haut. Avec des pinces à dissection enlever le muscle, caduque et jaune entourant sac et exposer l'embryon. Placez l'embryon de retour dans le milieu de DMEM froid. Les embryons peuvent être facilement transférées en utilisant un 3 ml transfert de plastique pipette / compte-gouttes. Isoler chaque embryon individuel d'une manière similaire avant de poursuivre.
- Placez un embryon dans une boîte de 35 mm propre Petri dans du PBS.
- Utilisez une pince fine (0,05 mm de largeur) pour enlever la patte antérieure. Insérer doucement la pince dans l'ouverture pour détacher le tube digestif, de la région de la moelle épinière (figure 1). OPTION: Pour voir plus facilement l'estomac, retirez la partie supérieure du corps de l'embryon, dans le vif et la région de la queue en dessous de la tige de jaune.
- Localiser l'estomac, le foie et l'intestin. Utilisation de la pince, d'isoler le tractus gastro-intestinal entre l'estomac et l'intestin et le placer dans du DMEM froid sur de la glace (figure 1). Le bourgeon pancréatique dorsal est attaché le dos, postérieur à l'estomac (Figure 1).
- Isoler tous les tractus gastro-intestinal individu dans une similar manière avant de poursuivre. Si les embryons doivent être génotypés, recueillir la queue au moment de la dissection et de garder tous les tractus gastro-intestinal individu dans une bien différente dans une plaque de 24 puits avec du DMEM froid sur la glace.
- Placez un tractus gastro-intestinal dans une boîte de 35 mm propre Petri dans du PBS froid. Maintenant, utilisez un éclairage par le dessous dans le champ lumineux de visualiser et de disséquer le bourgeon pancréatique dorsal sous le microscope de dissection. Ces conditions permettent d'optimiser la visualisation des volumes. En utilisant des aiguilles de tungstène affûtées par voie électrolytique ou 20 g des aiguilles de seringues, d'isoler le bourgeon pancréatique avec aussi peu que possible mésenchyme autour de l'épithélium (figure 1).
- Transférer l'œuf isolé dans une boîte de Pétri contenant une solution de dispase froid (1,25 mg / ml) pendant 2-3 min. De ce point, le transfert peut être effectué le plus commodément par des capillaires en verre 50 ul de flamme tiré attachés à un tube flexible bouche contrôlée. Alternativement, mais avec plus de risk de perdre l'œuf, utiliser une pipette 10 ul automatique (Pipetman) avec des pointes en plastique appropriées.
- Effectuer pancréatique aspiration des bourgeons et l'éjection sous contrôle microscopique. Mettez le bourgeon pancréatique retour dans PBS. Nettoyer en outre le bourgeon pancréatique isolé du mésenchyme avec les aiguilles et les aspiration douce à l'aide du capillaire en verre (Figure 1).
- Lorsque l'ensemble du mésenchyme est enlevée, rincer le bourgeon pancréatique dans du PBS froid; transférer chaque bourgeon de DMEM froid dans des puits individuels (60 et mini-plateaux remplis de 10 ul de DMEM froid). Il est important de ne pas enlever le mésenchyme dans dispase, ce qui rend le tissu très collant.
2. Placage et de la culture de cellules dispersées
- Transférer l'épithélium disséqué à partir de tous les embryons avec un capillaire de verre à la flamme tiré dans des puits coniques de 60 puits mini-plateaux remplis avec 10 ul de PBS pour le rinçage.
- Transférer l'œuf dans 10 ul de trypsine 0,05% unee laisser incuber à 37 ° C pendant 4 min. Inactiver la trypsine par le transfert de l'œuf dans un puits avec 10 ul de DMEM + 10% de sérum foetal de veau (FCS).
- Dissocier la suspension cellulaire par aspiration à travers un capillaire mince tiré avec un extracteur de pipette. Il est important d'éviter les bulles à ce stade tout en aspiration et refoulement de dissocier les cellules. organites du pancréas commencent optimale de petits groupes de 5-15 cellules et donc dissociation partielle est recommandé (Figure 1).
- Réunir les cellules provenant de plusieurs embryons dans un tube Eppendorf afin de minimiser les différences dues au traitement individuel. Diluer la suspension de cellules dans le Matrigel refroidi dans un rapport 1:3. Aliquote de ce mélange sur une plaque de 96 puits, 8 pl / puits ou dans une plaque optimisé pour l'imagerie (voir ci-dessous).
- Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min, ce qui permet d'épaissir le Matrigel. Remplir les puits avec 70 pi de milieu de choix (organoïde ou une sphère, voir Tables figures 1 et 2) et laisser dans un environnement humidifié contenant 5% de CO2 et 95% d'air à 37 ° C.
- Remplacez le support tous les 4 e jour. Surveiller les colonies du pancréas augmente chaque jour et documenter le processus par imagerie.
- Les petites molécules ou des protéines d'intérêt peuvent être ajoutés au milieu à ce stade, pour des expériences d'interférence, comme 28 indiqué précédemment.
Tableau 1: moyen Organoid.
| Nom de la matière | Stock Concentration | Concentration finale dans le milieu | Volume de stock |
| Pénicilline-streptomycine | 100% | 1% | 50 pl |
| Sérum remplacement KnockOut (supplément) | 100% | 10% | 500 pl |
| 2-mercaptoéthanol | 14,3 M | 0,1 mM | 1 pl |
| Phorbol myristate acétate (PMA) | 16 uM | 16 nM | 5 pl |
| Y-27632 (inhibiteur de ROCK) | 50 mM | 10 uM | 1 pl |
| EGF | 50 pg / ml | 25 ng / ml | 2,5 pl |
| Humaine recombinante R-1 Spondin | 250 pg / ml | 500 ng / ml | 10 pl |
| - Ou - | |||
| Recombinant de souris R-1 Spondin | 250 pg / ml | 500 ng / ml | 10 pl |
| Recombinant humain FGF1 (aFGF) | 100 pg / ml | 25 pg / ml | 1,25 pi |
| Héparine (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 pl |
| RecomFGF10 humaine recombinante | 100 pg / ml | 100 ng / ml | 5 pl |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 pi | ||
| Total | 5000 pi |
Tableau 2: moyen Sphère.
| Nom de la matière | Stock Concentration | Concentration finale dans le milieu | Volume de stock |
| Pénicilline-streptomycine | 100% | 1% | 50 pl |
| B27 x50 (supplément) | 100% | 10% | 100 pl |
| FGF2 recombinant humain (bFGF) | 100 pg / ml | 64 ng / ml | 3,2 pl |
| Y-27632 (inhibiteur de ROCK) | 50 mM | 10 uM | 1 pl |
| DMEM/F-12 | 4845,8 ul | ||
| Total | 5000 pi |
3. Imagerie de la progression du développement Organoid
- organoïdes Image soit quotidienne ou par faute de temps microscopie fluorescente utilisant un time-lapse microscope. Pour lapse imagerie en temps, utiliser un XY (Z) automatisé du microscope à fluorescence inversé.
- De dépôt de petites gouttelettes de 3 ul dans des plaques à 4 puits ou des plaques à fond de verre remplies de 2-5 ml de milieu. Image avec un objectif 10x longue distance. Remarque: Les souris transgéniques exprimant des traceurs fluorescents peuvent être utilisés. Film 1 montre par exemple l'expansion initiale de organoïdes de Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-NGFP + souris 4. La GFP nucléaire permet à l'utilisateur de suivre les cellules sous forme d'objets individuels, mais les mêmes principes peuvent être appliqués pour suivre les cellules présentant une fluorescence de membrane tellecomme mT / mG souris 29.
- Lancer imagerie time-lapse 3 heures après l'ensemencement des cellules pour éviter les dérives de discussion et configurer le logiciel d'automatisation de contrôle pour prendre une photo / h pendant 3 jours ou plus à des positions définies manuellement. Pour chaque position, l'acquisition d'une interférence de contraste de l'image différentielle (DIC) ainsi que le signal de la GFP, de rapports expression du marqueur fluorescent.
4. Recouvrement des organites pour histologie
- Placer la plaque de 96 puits sur la glace et retirez le support, le remplacer par PBS glacé. Cette dépolymérise partiellement Matrigel.
- Aspirer doucement chaque individu organoïde, retirer le Matrigel entourant l'aide d'une pointe de 1000 pi afin de ne pas perturber l'architecture globale. Transférer chaque organoïde à un bien avec le froid de la glace PBS. Conservez la plaque sur la glace. Fixation directe dans le Matrigel est également possible.
- Fixer le organoïde pendant 15 min dans du paraformaldéhyde 4% (PFA), la cryoconservation en saccharose et l'intégrer dans la gélatine. Traiter chaqueorganoïde pour cryosectioning et histologie comme décrit précédemment (Johansson et al., 2007) 4.
5. Recouvrement des organites pour la PCR et de biochimie
- Placer la plaque de 96 puits sur la glace et retirez le support. Ajouter 60 ul de RNAlater par puits afin de stabiliser et de protéger l'ARN cellulaire.
- Perturber le gel dans chaque puits mécaniquement par dépolymérisation partielle sur la glace. Soit récupérer organites individuels en utilisant une pointe de 1000 pi afin de ne pas perturber l'architecture globale ou de récupérer la totalité de bien (avec Matrigel) en perturbant le gel mécaniquement avec une pointe de 200 pi. Utilisez une pointe de 1000 pi de transférer le contenu de puits dans un libre-non-collant le tube Eppendorf RNAse conservé dans la glace.
- Laver les puits avec 60 pi RNAlater et ajouter le contenu restant dans le même tube Eppendorf.
- Faites tourner les tubes pendant 5 min à 500-1000 g à 4 ° C.
- Retirer le surnageant, ne laissant 20-30 pide RNAlater dans le tube en même temps que la pastille. Pour la biochimie, stocker les échantillons secs que possible.
- Ne pas congeler les échantillons dans RNAlater immédiatement; conserver à 4 ° CO / N (pour permettre KNAlater de pénétrer en profondeur le tissu). Le tissu peut être conservé à -20 ° C pour une conservation à long terme et peut ensuite être traité pour la rupture des tissus et de l'extraction de petites quantités d'ARN.
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Résultats
E10.5 dorsales progéniteurs pancréatiques dissociées et ensemencées en 3D Matrigel récapitulent le développement du pancréas. Progéniteurs peuvent être le plus facilement suivies avec les journalistes fluorescentes. Dans notre cas nous avons utilisé une souris transgénique qui exprime une protéine GFP nucléaire contrôlée par Pdx1 promoteur (Pdx1-Ngn3-ER TM-NGFP) (Film 1) en l'absence de tamoxifène et donc sans activation Neurog3 4 (figure 2).
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Discussion
La production à grande échelle de cellules bêta fonctionnelles in vitro est encore inefficace 1. Dans ce contexte difficile, les études de biologie du développement peuvent aider à déchiffrer les signaux exactes qui sont nécessaires à la différenciation des cellules bêta fonctionnelles. Ce protocole permet le maintien, l'expansion et la différenciation des progéniteurs pancréatiques embryonnaires in vitro. Cela comprend la formation des cellules bêta productrices d'insuline qui ne co...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par une séquence PRN Frontiers in Genetics attribution du pilote, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant et Grant 41-2009-775 12-126875 de Sygdom de Det Frie Forskningsråd / Sundhed. Les auteurs remercient le laboratoire Spagnoli pour accueillir le tournage vidéo.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15070-063 | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| KnockOut Remplacement du sérum (supplément) | Gibco | 10828-028 | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock maintenu à 4 ° ; C |
| Phorbol Myristate Acétate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| Y-27632 (inhibiteur de ROCK) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock maintenu à -20 ° ;C. Attention ! La stabilité/la source est une source fréquente de problèmes. |
| Stock EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | maintenu à -80 ° ; C |
| R-spondine humaine recombinante 1 | R& D | 4645-RS-025/CF | Stock maintenu à -80 ° ; C |
| Souris recombinante R-spondine 1 | R& D | 3474-RS-050 | Stock maintenu à -80 ° ; C |
| FGF1 humain recombinant (aFGF) | R& D | 232-FA-025 | Stock maintenu à -80 ° ; C - ne pas inclure pour augmenter la production de cellules bêta |
| Héparine (Liquémine) | Drossapharm | Stock maintenu à 4 ° ; C | |
| FGF10 humain recombinant | R& D | 345-FG-025 | Stock maintenu à -80 ° ; C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15070-063 | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| B27 x50 (supplément) | Gibco | 17504-044 | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| FGF2 humain recombinant (bFGF) | R& D | 233-FB-025 | Stock maintenu à -80 ° ; C |
| Matrigel | Corning | 356231 Stock maintenu à -20 ° ; C | |
| Trypsine 0.05 % | Gibco | 25300-054 | Stock maintenu à 4 ° ; C |
| RNAlater - Réactif stabilisateur d’ARN | Qiagen | 76104 | Magasin chez RT |
| Dispase ; | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Concentration de travail : 1,25 mg/ml. Stock maintenu à -20 ° ; C |
| BSA pour la reconstitution | Milipore | 81-068 | Pour la reconstitution des cytokines ; - stock maintenu à -20 ° ; C |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock maintenu à -20 ° ; C |
| Plateaux MicroWell 60 puits | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| Plaques 4 puits | Thermo Scientific | 176740 | |
| Plaques 95 puits F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas Bottom | Plaques Ibidi | 81158 | |
| Micropipettes en verre | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Station d’imagerie Cell® ; (support motorisé inversé Olympus IX81) équipée d’une caméra Hamamatsu ORCA ER B7W et du Ludin Cube et Box. Stand Leica DMI6000 B entouré d’un cube et d’une boîte Ludin, équipé d’une caméra Leica DFC365 FX et de l’interface de commande du logiciel AF6000 Expert/Matrix. | ||
| Objectif | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X longue distance ; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X longue distance |
Références
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Réimpressions et autorisations
