Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d'adhésion cellulaire putatif

Résumé

Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives intrinsèques des molécules d’adhésion cellulaire présumées. L’ectodomaine sécrété, marqué par un épitope, d’une molécule d’adhésion cellulaire est capturé à partir du milieu de culture sur de petites billes fonctionnalisées uniformes. Ces billes peuvent ensuite être utilisées immédiatement dans des tests simples d’agrégation de billes.

Résumé

L'adhérence cellule-cellule est essentielle à la vie multicellulaire et est médiée par une grande diversité de protéines de la surface cellulaire. Cependant, les interactions adhésives pour un grand nombre de ces protéines sont mal compris. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives des homophiles des molécules d'adhésion cellulaire putatifs. De culture des cellules HEK293 sont transfectées avec l'ADN plasmidique codant pour une sécrétion, un ectodomaine d'une étiquette d'épitope d'une protéine de surface cellulaire. Utilisation de billes fonctionnalisées spécifiques pour le marqueur d'epitope, le soluble, la protéine de fusion sécrétée est capturé à partir du milieu de culture. Les billes enrobées peuvent alors être utilisés directement dans des tests d'agrégation billes ou à bille fluorescente tri dosages pour tester l'adhérence homophile. Si on le souhaite, la mutagenèse peut être utilisée pour élucider les acides aminés ou domaines spécifiques nécessaires pour l'adhérence. Ce dosage ne nécessite que de petites quantités de protéine exprimée, ne nécessite pas la production de lignées cellulaires stables, et peut être accomplished à 4 jours.

Introduction

L'adhérence cellule-cellule est essentielle pour le développement et l'intégrité des organismes multicellulaires et est médiée par une grande diversité de molécules de la surface cellulaire. Beaucoup de ces molécules d'adhésion ont été identifiés et caractérisés, mais beaucoup restent à découvrir. Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier les propriétés des molécules d'adhésion cellulaire (CAM), y compris le tri cellulaires essais, des tests d'agrégation de cellules ^1-8 et méthodes biophysiques, comme la microscopie à force atomique et la surface spectroscopie de force ^9-12.

La complexité de la même simplifié dans des systèmes in vitro utilisant des lignées cellulaires, il est difficile de déterminer les propriétés adhésives d'une CAM putatif. Typiquement, une molécule est considérée comme une CAM si elle induit une agrégation cellulaire lorsqu'il est transfecté dans une lignée cellulaire non-adhésif. Toutefois, il est clair qu'il ne s'agit pas de preuve directe de l'activité de l'adhésif. Par exemple, faciliter la distribution de surface de la cellule ou de la stabilité d'unCAM se traduirait également par l'agrégation cellulaire accrue ^1,13. De plus, un vrai CAM peut échouer la médiation agrégation cellulaire si la lignée cellulaire n'a pas d'autres co-facteurs nécessaires pour la livraison de la surface cellulaire ou de stabilisation.

Pour éviter ces facteurs de risque, des tests plus directs peuvent être employées qui sont fondées sur l'idée que les interactions adhésives doivent être une propriété intrinsèque biochimique du domaine extracellulaire. Alors que les perles étaient initialement utilisés pour caractériser Ng-CAM ^2, ces essais ont été étendus afin d'enquêter sur la cadhérine-médiation adhérence ^12,14,15. Utilisation de fusion des fusions C-cadhérine ectodomaine-Fc, le laboratoire a montré que Gumbiner multiples répétitions de cadhérine contribuent à des interactions homophiles ^14. En utilisant des tests d'agrégation de perles comparables, la E-cadhérine et la N-cadhérine adhésion ont également été caractérisé ^12,15, comme l'ont fait un certain nombre de PROTOCADHERINES ^1,15-18 et isoformes DSCAM de Drosophila ^19. Nous décrivons ici un test relativement simple et rapide pour la caractérisation de l'activité adhésive de sécrétées, ectodomaines de marquage épitopique de cames de homophiles putatifs (figure 1). Nous avons utilisé ce test essentiellement de caractériser les membres de la superfamille des cadhérines.

Protocole

1 Préparation des cellules (J-2 à 0)

1. Fractionner les cellules HEK293 1: 5 en utilisant 0,05% de solution de trypsine-EDTA et incuber à la croissance des médias à 37 ° C avec 5% de CO ₂ jusqu'à 60 ans - 80% de confluence (2 - 3 jours). Pour chaque condition, les cellules en culture dans 2 x boîtes de 100 mm.

2. transfection des cellules (Jour 1)

1. Transfecter des cellules HEK293 avec le plasmide codant pour la Fc-fusion en utilisant un réactif de transfection, tels que la lipofectamine. D'autres méthodes qui conduisent à des efficacités de transfection comparables peuvent également être utilisés.
2. Retour cellules transfectées à l'incubateur pendant 24 heures.

3. cellulaire propagation (Jour 2)

1. Préchauffer milieux de croissance sans sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C.
2. Rincer la vaisselle 2x avec 10 ml de croissance médias FBS, et renvoient les plats à la 37 ° C incubateur pendant 1 heure.
3. Rincer la cultures des plats une fois de plus avec 10 ml de croissance médias FBS, pour un total de 3 lavages.
4. Incubate les cellules HEK 293 transfectées à 37 ° C pendant 48 heures sans autre FBS avant de recueillir médias.

4 perles d'agrégation (Jour 4)

1. Pour recueillir des médias de boîtes de culture, de transférer les médias de chaque paire de plats à 50 ml tubes coniques et rotation à 500 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires.
2. Les milieux filtrants de 50 ml tube conique dans un filtre centrifuge utilisant une seringue de 30 ml et de 0,45 um filtre de la seringue.
3. Spin filtres centrifuges à 4000 x g et 4 ° C jusqu'à ce que le volume de milieu de culture concentré est d'environ 500 pl (environ 15 min). Répétez jusqu'à ce que tous les supports de culture a été ajouté et concentré.
4. Ajouter 1,5 ul de billes magnétiques protéines G à 1 ml de glace froide Binding Buffer dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon, les placer sur un aimant et éliminer le tampon. Immédiatement ajouter au milieu de culture concentré de la protéine G des billes magnétiques.
5. Faire tourner les tubes à 4 ° C pendant 2 heures.
6. Pltubes ace sur un aimant et supprimer médias. Laver rapidement perles deux fois avec le froid de la glace 1 ml Binding Buffer, puis remettre en suspension des billes dans 300 pi Binding Buffer.
7. De Split remis en suspension dans 2 perles tubes, 150 pi dans chaque tube, puis ajouter 1,5 pi de mM CaCl ₂ ou 200 200 mM EDTA pour le "calcium" et les conditions "pas de calcium", respectivement.
8. Transfert 100 pi de chaque condition à une dépression bien glisser et de recueillir des micrographies au microscope lumière transmise (figure 2). Recueillir des images à partir de 5 champs de vision pour chaque expérience à chaque point de temps souhaité.

Analyse 5. données

1. ImageJ, ou logiciel d'analyse d'image comparable, ouvrez l'un des cinq ensembles de données d'image en utilisant le / séquence d'images Importer ... dans le menu déroulant Fichier. Ceux-ci seront ouverts comme une pile d'images.
2. Dans la boîte de dialogue ... image / Propriétés, modifiez la iunités de mage à pixels et mis Largeur Pixel et Hauteur de pixel à 1,0.
3. Convertir les images en binaire utilisant le / Seuil Ajustez ... de commande dans le menu déroulant Image. Régler le seuil pour inclure pixels qui contribuent à des billes ou des agrégats de perles, mais qui excluent fond et de petites particules. Appliquer à toutes les images de la pile.
4. Dans la boîte de dialogue de mesures Set, cochez les cases de la région et la pile de position.
5. Exécutez analyser des particules ... dans le menu déroulant Analyser. Cela va générer une liste de particules identifiées, notamment leur taille (région) et l'image dans laquelle ils ont été identifiés.
6. Répétez ce processus pour que l'expérience et l'état expérimental.

Résultats

Une expérience d'exemple est présenté sur la figure 2, qui représente l'agrégation des billes de calcium-dépendante par l'ectodomaine de la N-cadhérine fusionné à Fc (NcadEC-Fc). En l'absence de calcium, les perles présentent peu ou pas de tendance à l'agrégation et il n'y a pas d'augmentation de la taille des agrégats avec le temps (Figure 1A, C). En présence de calcium, des perles revêtues d'NcadEC-Fc montrent une agrégation solide, avec la taille des agrégats de plus en plus au cours...

Discussion

L'adhésion cellulaire est un élément essentiel de la vie multicellulaire et est médiée par une large gamme de protéines de la surface cellulaire. Parmi ceux-ci, les propriétés adhésives détaillées sont comprises que pour une part relativement faible. Ici, nous avons décrit un protocole simple et rapide pour enquêter sur la capacité adhésive homophile de ectodomaines sécrétées fusionnées à une étiquette d'épitope pratique. Cette approche a un certain nombre d'avantages importants. Premièrement, des lignées ce...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
plasmide pFc-N1	Addgene	À soumettre
HEK293 cells	American Type Culture Collection	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Fetal Bovin Serum (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0,05 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads &ndash ; Protein G	Life Technologies	10003D
Albumine	Sigma	A3294
Lames de dépression	Sciences de la microscopie électronique	71878-06
Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 avec membrane Ultracel-10	Millipore	UFC901024
0,45 mm	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Fiji (ImageJ) Logiciel d’analyse	d’imageshttp://fiji.sc/Fiji
Table des tampons/solutions
Médias de croissance	DMEM + 10 % FBS + Pen-Strep	Filtre stériliser et stocker à 4 ° ;C.
Médias de croissance &ndash ; FBS	DMEM + Pen-Strep	Filter stérilisent et stockent à 4 ° ;C.
Tampon de liaison	50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2 % BSA	Vortex jusqu’à dissolution, conserver sur de la glace.