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Article de méthode

Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches

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DOI :

10.3791/51764

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23 août 2014

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Dans cet article

Résumé

des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

Résumé

Une limitation majeure avec les protocoles de différenciation actuels cellules souches embryonnaires humaines (ESC) est la génération de populations cellulaires hétérogènes. Ces cultures contiennent les cellules d'intérêt, mais sont également contaminés avec les CES indifférenciées, les dérivés non-neural et d'autres sous-types de neurones. Ceci limite leur utilisation in vitro et in vivo dans des applications telles que la modélisation in vitro pour la découverte de médicaments ou la thérapie de remplacement cellulaire. Pour aider à surmonter cela, des lignées de cellules rapporteurs, qui offrent un moyen de visualiser, suivre et isoler les cellules d'intérêt, peuvent être conçus. Cependant, pour atteindre cet objectif dans des cellules souches embryonnaires humaines, par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace. Ce protocole décrit le ciblage de la homéobox pituitaire 3 (Pitx3) locus dans les cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des nucléases zinc des doigts conçus sur mesure, qui introduisent double-brin de cassures de l'ADN spécifique au site, avec unePitx3 - vecteur donneur d'ADN spécifique de EGFP. Suite à la génération de la lignée cellulaire rapporteur Pitx3, il peut alors être différencié en utilisant des protocoles publiés pour une utilisation dans des études in vitro telles que la modélisation de la maladie ou la thérapie de remplacement cellulaire dans la maladie de Parkinson.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires (ESC) de différenciation des protocoles actuels conduisent à des populations de cellules hétérogènes, en particulier en ce qui concerne la dérivation de phénotypes neuronaux spécifiques. Ainsi, bien que les cultures contiennent le phénotype cellulaire souhaité, d'autres neurones, les types de cellules non-neuronales et non différenciées sont souvent présents 1. Ces caractéristiques limitent l'application de l'ESC dérivée de sources cellulaires pour une utilisation dans la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie in vitro.

Des lignées cellulaires rapporteurs génétiques offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt, à la condition que l'expression de la protéine rapporteur (RP) reproduit expression endogène. L'utilisation de promoteurs immédiatement en amont d'une région codante du gène peut être utilisé pour dériver reporters génétiques brut mais ces constructions n'ont pas les éléments de régulation qui contrôlent précisément l'expression du gène endogène. En revanche, la recombinaison homologue proposepossibilité d'assurer l'expression de haute fidélité de la RP. Dans le passé, des vecteurs de ciblage conçus pour la recombinaison homologue au locus spécifique d'intérêt ont été utilisés pour cibler PR chez la souris (CES mESCs) par électroporation comme un moyen de délivrance d'ADN 1,2. Cependant, la génération de lignées cellulaires rapporteurs par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace pour CES humaines (CSEh), et par conséquent n'a été documentée dans un petit nombre de cas (revue dans 3). En utilisant une protéine chimérique conçu contenant une fusion d'une nucléase Fok I avec des motifs en doigt de zinc spécifiques au site, connus collectivement sous le doigt de zinc (ZFN nucléases), cassures de l'ADN double-brin peuvent être introduits à des loci génomiques pré-déterminé. Quand un vecteur d'ADN ayant une homologie avec les deux côtés de la cassure double brin d'ADN est ajouté, le site génomique peut être réparé par une recombinaison homologue, ce qui permet l'incorporation de la séquence d'ADN du donneur. Cette technique s'est avérée utile fou l'édition génomique dans les cellules humaines primaires 4,5 et 6,7 CSEh. Plus des travaux récents ont utilisés transcription activateur comme effecteurs nucléases (Talens), des facteurs de transcription utilisés par les agents phytopathogènes 8, pour aider à la conception des nucléases spécifiques au site 9.

Dans le protocole suivant, nous démontrons la génération d'une lignée de cellules hESC rapporteur par électroporation d'un vecteur contenant l'EGFP de ciblage homologue 6, conjointement avec la ZFN pour homéoboîte de l'hypophyse humaine 3 (Pitx3) locus. Après la sélection antibiotique pendant 2-3 semaines, CSEh avec l'ADN correctement intégré peuvent être récoltés manuellement, élargis et examinés d'abord par PCR, puis validés par transfert de Southern.

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Protocole

Toutes les procédures sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. Tous les milieux et solutions sont équilibrées à 37 ° C sauf indication contraire.

1 extension de CSP humaines (CSEh et hiPSCs, WA-09 utilisé dans ce protocole) pour la transfection

Remarque: Il n'est pas nécessaire d'étendre les CSEh sur Matrigel ou Geltrex. CSEh élargis sur les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) peuvent être utilisés pour l'électroporation ou nucléofection après une étape d'élimination MEF (voir section 2.8).

  1. Préparer une boîte de 100 mm x 1 et x 75cm2 ballon de DR4 MEF à 2,0 x 10 4 cellules par cm 2 dans un milieu MEF (voir le tableau 1) sur des boîtes pré-revêtu avec 0,1% p / v de gélatine.
    Remarque: CF1, BLK6 ou MF1 MEF peut être utilisé, cependant, il est recommandé que les lignes MEF résistantes aux antibiotiques sont utilisés, par exemple, DR410.
  2. Le lendemain, passage CSEh sur un plat de 100 mm pré-plaqué avec MEF préparés dans la section 1.1. Pour ce faire, aspitaux CSEh médias de cultures vaisselle, laver les CSEh avec la solution saline équilibrée de Ca2 + / Mg2 + exempt de Hanks (HBSS), ajouter Dispase (voir le tableau 2 pour des volumes appropriés) et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2. Après 3-5 minutes d'incubation, aspirer et laver délicatement Dispase 1 - 2 fois avec HBSS pour éliminer MEF. Ajouter des médias sur les CSEh (voir le tableau 3) et en utilisant un grattoir à cellules, ou pipette de 5 ml, gratter délicatement les colonies de la surface de la boîte de culture.
  3. Recueillir les fragments de colonies en suspension de la boîte de culture dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Boîte de culture rinçage avec les médias et le transfert dans le tube de 15 ml CSEh. Attention à ne pas casser les mottes en cellules individuelles ou de petits fragments.
  4. Centrifuger pendant 5 minutes à 160 x g pour sédimenter les fragments de colonies.
  5. Aspirer le surnageant. Appuyez sur le bas du tube de 15 ml avec le doigt pour desserrer colonie fragment culot. Fragments de colonies doucement remettre en suspension dans CSEh médias selon un rapport de division (de normallya divisée rapport compris entre 1: 4 et 1: 8 est approprié). Soyez extrêmement prudent de ne pas rendre touffes dans des cellules individuelles ou de petits fragments que cela affecte les plaquant efficacité.
  6. Avant les plaquant fragments de CSEh sur MEF laver 1x avec du HBSS. Lentement, ajouter une quantité appropriée (voir le tableau 2) de la suspension cellulaire contenant des fragments de CSEh dans les médias CSEh à des plats pré-plaqué MEF.
  7. Placez les plats de la culture sur la tablette dans l'incubateur et se déplacer lentement d'avant en arrière et de gauche à droite pour répartir des fragments de colonies.
  8. Remplacez le support CSEh quotidien.
  9. Pour préparer un milieu conditionné de MEF (MEF-CM) laver le flacon de 75 cm2 pré-plaqué avec MEF 1 x avec HBSS. Ajouter médias CSEh. Après 24 h, collecter des milieux conditionnés et les remplacer par les médias sur les CSEh frais. Répéter tous les jours pendant une durée maximale de 12 jours. Rangez MEF-CM à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.

2 Préparation des CES humaines pour la transfection

  1. Observer la croissance des CSEhtous les jours sous microscope. Lorsque les colonies deviennent 40-50% de confluence, plaque 3 x 100 mm avec des plats de 2,0 x 10 5 MEF par cm 2.
  2. Lorsque les colonies deviennent 60 à 70% de confluence, ils sont prêts à être transfectée. colonies "marié" en supprimant colonies différenciées ou des noyaux de colonie.
    Remarque: Comme nous croyons transfection supérieur et l'efficacité de ciblage se produisent lorsque les cellules sont en phase de croissance journal, il est suggéré que l'électroporation être effectuée avant CSEh atteindre ≥ 70% de confluence.
  3. Laver colonies de CSEh avec du HBSS et ajouter Accutase.
    Remarque: Il n'est pas nécessaire CSEh à pré-traiter avec un inhibiteur de ROCK Y-27632 inhibition suffisante aura lieu lors d'une incubation avec Y-27632 lors de l'étape 2.7
  4. Incuber pendant 10 - 20 min à 37 ° C / 5% de CO2 jusqu'à ce que des colonies de cellules uniques sont fournis comme on le voit sous un microscope. Broyez les cellules avec une pipette de 1 ml.
  5. Ajouter des médias de CSEh et filtre dans un tube conique de 15 ml en utilisant un straine 40 um cellulairer pour supprimer amas de cellules.
  6. Centrifuger à 160 g pendant 5 min. Remettre le culot cellulaire dans les médias de CSEh frais et répéter pour enlever toute solution de Accutase résiduelle.
  7. Resuspendre les cellules dans un milieu contenant 10 uM de hESC Y-27632 et transférer la suspension cellulaire total à une boîte de 100 mm pré-enduite avec de la gélatine.
  8. Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 30 min.
  9. Pendant ce temps MEF va adhérer à la boîte de gélatine appliquée. Recueillir CSEh non adhérentes à l'aide d'une pipette de 1 ml dans un tube de 15 ml frais de centrifugeuse et déterminer la densité de cellules en utilisant un hématimètre.

3. électroporation des CSEh

  1. Médias de CM-MEF filtres en utilisant un filtre de 0,22 um et ajouter 10 ng facteur de croissance ml / des fibroblastes-2 humaine recombinante (rhFGF2).
  2. Transférer 7,5 x 106 cellules hES de l'article 2.9 à un nouveau tube de 15 ml et centrifuger conique à 160 g pendant 5 min.
  3. Pendant ce temps, mettre en place le électroporateur: Sélectionner le programme pour ele exponentielctroporation et définir les paramètres suivants, Tension: 250 V, Capacité: 500 pF, et de la Résistance: ∞-.
  4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de cellules dans 0,8 ml de glace et filtré à froid de 0,22 um HBSS. Transférer la solution dans une cuvette d'électroporation de 0,4 cm stérile.
  5. Ajouter construction de ciblage TV-hPITX3-avant (30 ug d'ADN) et mélanger doucement avec une pipette 200 pi. Incuber sur de la glace pendant 5 min. Pendant ce temps, retirer une aliquote de Pitx3 ZFN ARNm et de dégivrage sur la glace. Lorsque décongelé transfert de 7,5 pi de ZFN ARNm de mélange d'ADN / cellule cuvette d'électroporation. Mélanger doucement avec une pipette 200 pi.
    Remarque: Le locus être la cible est le principal facteur qui contribue à l'efficacité du ciblage. encodage de Loci gènes silencieux, les gènes ne sont pas exprimés dans les CES, comme Pitx3 sont difficiles à cibler en utilisant la recombinaison homologue classique 6. Ainsi, ce protocole utilise des conçu sur mesure ZFN pour le locus Pitx3 humaine pour induire un ADN double brin break.
  6. Électroporation en suivant les instructions à l'écran sur la électroporateur.
  7. En utilisant une pipette de 200 ul transférer le contenu de la cuvette d'électroporation à un tube de 15 ml contenant 10 ml de milieu de hESC. Lavez la cuvette deux fois avec 200 pi de milieu de CSEh à chaque fois et de transfert à un tube de 15 ml. Il y aura "mucus-like" débris constitué de l'ADN et les protéines des cellules lysées qui auront un impact négatif survie cellulaire. Centrifuger à 160 g pendant 5 min à retirer les débris.
  8. Aspirer le surnageant et tapotez doucement culot cellulaire pour desserrer. Re-suspendre dans 30 ml complétées MEF-CM contenant 10 uM Y-27632 et Réensemencement sur 3 x 100 mm preplated plats avec MEF.
  9. Changer les médias tous les jours. Au jour 2, Y-27 632 peut être retiré et les cellules cultivées dans des milieux hESC seulement.
  10. Après 2-3 jours, les CSEh devraient être 50-70% de confluence. A ce stade, commencer le choix des antibiotiques (par exemple, 0,5 pg / ml de puromycine).
  11. Maintenir selréflexion en ajoutant médias CSEh / puromycine frais tous les jours. Après ~ 7 jours de petites colonies doivent être visibles. Si MEF résistantes aux antibiotiques ne sont pas utilisés, MEF peut être complété par l'ajout d'une des cellules supplémentaires 1.0 x 10 4 par cm 2.

4. Cueillette clones transgéniques CSEh

  1. Environ 14 à 21 jours après la sélection (lorsque les colonies ont atteint un diamètre ~ 1 mm) préparent plaques d'expansion et de dépistage. Commencer par décongélation d'une partie aliquote de Matrigel ou Geltrex à 4 ° C pendant un minimum de 5 heures. Diluer selon les instructions du fabricant et ajouter 75 ul dans chaque puits de plaques 3 x 96 puits. Préparer des plaques 3 x 48 puits par placage MEF à 2,0 x 10 4 cellules par cm 2. Incuber les plaques O / N à 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Le jour suivant disséquer colonies en morceaux de 16 à 25 en utilisant une aiguille 21 G, sur la pointe d'une pipette de 2 ml par découpe d'une grille.
  3. Aspirer Matrigel de plaques à 96 puits et la remplacer par supplémmédias ENTED CM-MEF. Laver MEF en plaques de 48 puits avec 1 x HBSS et ajouter les médias de CSEh.
  4. Avec une pipette 200 ul transférer délicatement un tiers de la colonie disséqué dans une plaque de 48 puits pour l'expansion. Transférer l'autre 2/3 de la colonie disséqué dans une plaque de 96 puits correspondant contenant complétées médias CM-MEF.
  5. Maintenir les deux plaques en changeant les médias tous les jours (complété médias CM-MEF pour matrigel revêtu plaques à 96 puits et CSEh médias pour des plaques de 48 puits contenant MEF; fois complété avec 0,5 pg / ml de puromycine).
  6. Développer jusqu'au plaques à 96 puits sont 100% de confluence et d'abord l'écran par PCR.

5. dépistage et l'expansion de clones positifs

  1. Pour préparer l'ADN génomique (méthode basée sur 11) supprimer tous les médias de plaques en inversant, puis épongez sur du papier absorbant.
  2. Rincer chaque puits deux fois avec RT PBS (100 pl / puits chaque lavage), inverti et blot comme pour l'étape 5.1. La place des plaques à -80 ° C fou 1 - 2 heures pour faciliter la lyse des cellules (plaques peuvent être stockées indéfiniment comme cela).
  3. Alors que les cellules sont à -80 ° C faire Sarcosyl tampon de lyse (voir tableau 4) (50 pl / puits). Pour lyser les cellules, les plaques chaudes pendant 5 min à température ambiante puis la pipette du tampon de lyse dans chaque puits. Sceller les bords de chaque plaque avec du ruban adhésif, placer dans un contenant hermétique contenant des serviettes de papier humides à créer de l'humidité, et incuber O / N à 60 ° C.
  4. Après incubation ajouter 150 ul de NaCl 5M à 10 ml de -20 ° C de l'éthanol absolu, bien mélanger et ajouter 100 ul à chaque puits (Note: l'éthanol sera couvert quand on ajoute du NaCl). Tapoter doucement les plaques à mélanger (ne pas pipette) et partent pour un minimum de 30 min à température ambiante. Pendant ce temps, la solution sera claire et l'ADN précipite.
  5. Retirer la solution comme à l'étape 5.1 puis ajouter 150 ul d'éthanol à 70% à chaque puits. Inversez plaque délicatement et épongez comme avant. Répétez cette étape une nouvelle 2x.
    Remarque: Parce que l'ADN précipité naturellement adhéres à la matière plastique de culture de tissu, il ne devient pas délogée au cours de ces étapes de lavage.)
  6. Après le lavage final, les plaques centrifuger brièvement à la vitesse supérieure pour concentrer l'ADN au fond de chaque puits, puis séché à l'air à la température ambiante (ou 37 ° C) pendant au moins 30 min.
  7. Ajouter 40 - 50 pi T0.1E (pH 8,0) (voir tableau 5) ou TE (pH 8,0) à chaque puits et place des plaques à 65 ° C pendant 1 h ou à 4 ° CO / N avant de l'utiliser pour la PCR. Remettre en suspension l'ADN en tapotant délicatement les côtés de la plaque. Utilisez 1-2 pi de réaction PCR re-suspendu ADN / 10 pi.
  8. Utilisation du système de PCR Expand Long Template avec bras hPITX3 L gen. F et L hPITX3 amorces bras GFP R effectuent le dépistage initial des clones à 58 ° C recuit, 45 extension sec, 35 cycles.
  9. Électrophorèse des échantillons avec 1kb Hyperladder dans un gel d'agarose à 1% contenant GelRed à 100 V pendant 45 min et la détection des clones positifs par illumination UV.
  10. Valider clones positifs de PCR par digestion de l'ADN génomique à partir de expaDEMVSO clones (voir ci-dessous) avec HindIII et hybridation des sondes 5 'et 3' des bras vecteur d'homologie à un transfert de Southern (comme décrit précédemment en 1). Les sondes sont générées par PCR en utilisant des paires d'amorces hPITX3 5 'sonde F et R, et hPITX3 3' sonde F et R, digéré par EcoRI et ligaturé dans un vecteur de clonage général.
  11. Selon le nombre de clones positifs, préparer deux puits d'une plaque à 6 puits en pré-placage avec MEF (2,0 x 10 4 cellules par cm 2).
  12. Le lendemain, prétraiter les clones positifs dans la plaque à 48 puits avec 10 pM de Y-27 632 pendant au moins 1 heure.
  13. Laver clones positifs avec du HBSS et ajouter 300 ul de Accutase.
  14. Lorsque les colonies sont rendus cellules individuelles, ajouter 1 ml de milieu de CSEh et de recueillir dans un tube de 15 ml.
  15. Changer les médias tous les jours. Le jour 2, Y-27632 peut être retiré et les cellules cultivées dans CSEh médias.
  16. Lorsque les colonies sont de 70 - 80% de confluence, sous-culture et de geler le reste de la colofragments de New York.

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Résultats

Après co-électroporation de la Pitx3 paire zinc-finger conçu sur mesure avec le Pitx3 - EGFP vecteur donneur d'ADN spécifique de, et la sélection à la puromycine ultérieure, les clones de CSEh positifs ont d'abord été détectés par dépistage génomique par PCR (figure 1). L'hybridation par Southern blot de ces clones positifs de PCR avec 5 'et 3' des sondes spécifiques confirmé ciblage correct à l'exon 1 du locus Pitx3 (figure 2), avec un rendement de 1...

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Discussion

La génération de lignées cellulaires rapporteurs offre un moyen puissant pour suivre, visualiser et d'isoler les cellules d'intérêt à partir d'une population hétérogène provenant de CSEh. Cependant, le ciblage génique par recombinaison homologue classique s'est avérée être extrêmement inefficace pour CES de l'homme 3. Dans ce protocole, nous décrivons une technique relativement simple pour introduire un RP dans l'exon l'un des locus Pitx3, dans CSEh en utilisant un vecteur...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Travaux décrits dans ce protocole a été rendue possible grâce au financement du gouvernement de Victoria dans le cadre d'une alliance de collaboration avec l'Institut californien pour la médecine régénérative (CIRM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fibroblastes embryonnaires de souris (DR4)GlobalStemGSC-6004G
GelatinSigmaG1393-100ML
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol (HBSS)Life Technologies14175-095
DispaseStemCell Technologies7923
Grattoir cellulaireCorning3008
AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Y27632Axon MedchemAxon 1683
Crépine cellulaire - 40 &mu ; mBD Biosciences352340
33 mm - 0,22 &mu ; m filterMilliporeSLGP033RS
rhFGF2R& D Systems233-FB-025/CF
ÉlectroporateurBioRad165-2661
Cuvette d’électroporation 0,4 cmBioRad165-2088
Humain TV-hPITX3-construction de ciblage avantAddgene31942
ZFN Kit ; Humain PITX3Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
PuromycinInvivoGenant-pr-1
MatrigelBD Biosciences354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies10566-016
Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, origine américaine (FBS)Life Technologies16140-071
Pen/StrepLife Technologies15070-063
Mélange de milieu et de nutriments modifié Dulbecco’s Eagle F-12 (DMEM/F12)Life Technologies11320-033
Remplacement de sérum KnockOut (KSR)Life Technologies10828-028
Acides aminés non essentiels MEM  ; (NEAA)Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ß ;-mercaptoéthanolLife Technologies21985-023
N-Lauroylsarcosine solution de sel sodique (Sarcosyl) (30 %)Sigma-Aldrich61747
EDTASigma-AldrichE9884
Trizma HydrochlorideSigma-AldrichT3253
Proteinase K solution (20 mg/ml)Bioline AustraliaBIO-37084
Expand Long Template PCR SystemRoche Australia11681834001
hPITX3 L arm gen. F (amorce) : 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'GeneWorks, Australie
hPITX3 L bras GFP R (amorce) : 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'GeneWorks, Australie
HyperLadder 1 kb  ;Bioline AustralieBIO-33025
GelRedJomar Bioscience, Australie41003

Références

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  12. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
  13. Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
  14. Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).

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