des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une limitation majeure avec les protocoles de différenciation actuels cellules souches embryonnaires humaines (ESC) est la génération de populations cellulaires hétérogènes. Ces cultures contiennent les cellules d'intérêt, mais sont également contaminés avec les CES indifférenciées, les dérivés non-neural et d'autres sous-types de neurones. Ceci limite leur utilisation in vitro et in vivo dans des applications telles que la modélisation in vitro pour la découverte de médicaments ou la thérapie de remplacement cellulaire. Pour aider à surmonter cela, des lignées de cellules rapporteurs, qui offrent un moyen de visualiser, suivre et isoler les cellules d'intérêt, peuvent être conçus. Cependant, pour atteindre cet objectif dans des cellules souches embryonnaires humaines, par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace. Ce protocole décrit le ciblage de la homéobox pituitaire 3 (Pitx3) locus dans les cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des nucléases zinc des doigts conçus sur mesure, qui introduisent double-brin de cassures de l'ADN spécifique au site, avec unePitx3 - vecteur donneur d'ADN spécifique de EGFP. Suite à la génération de la lignée cellulaire rapporteur Pitx3, il peut alors être différencié en utilisant des protocoles publiés pour une utilisation dans des études in vitro telles que la modélisation de la maladie ou la thérapie de remplacement cellulaire dans la maladie de Parkinson.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires (ESC) de différenciation des protocoles actuels conduisent à des populations de cellules hétérogènes, en particulier en ce qui concerne la dérivation de phénotypes neuronaux spécifiques. Ainsi, bien que les cultures contiennent le phénotype cellulaire souhaité, d'autres neurones, les types de cellules non-neuronales et non différenciées sont souvent présents 1. Ces caractéristiques limitent l'application de l'ESC dérivée de sources cellulaires pour une utilisation dans la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie in vitro.
Des lignées ce....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. Tous les milieux et solutions sont équilibrées à 37 ° C sauf indication contraire.
1 extension de CSP humaines (CSEh et hiPSCs, WA-09 utilisé dans ce protocole) pour la transfection
Remarque: Il n'est pas nécessaire d'étendre les CSEh sur Matrigel ou Geltrex. CSEh élargis sur les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) peuvent être utilisés pour l'électroporation ou nucléofection après une étape d'élimination MEF (voir section 2.8).
- Préparer une boîte de 100 mm x 1 et x 75cm2 ballon de DR4 MEF à 2,0 x 1....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Après co-électroporation de la Pitx3 paire zinc-finger conçu sur mesure avec le Pitx3 - EGFP vecteur donneur d'ADN spécifique de, et la sélection à la puromycine ultérieure, les clones de CSEh positifs ont d'abord été détectés par dépistage génomique par PCR (figure 1). L'hybridation par Southern blot de ces clones positifs de PCR avec 5 'et 3' des sondes spécifiques confirmé ciblage correct à l'exon 1 du locus Pitx3 (figure 2), avec un rendement de 1.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La génération de lignées cellulaires rapporteurs offre un moyen puissant pour suivre, visualiser et d'isoler les cellules d'intérêt à partir d'une population hétérogène provenant de CSEh. Cependant, le ciblage génique par recombinaison homologue classique s'est avérée être extrêmement inefficace pour CES de l'homme 3. Dans ce protocole, nous décrivons une technique relativement simple pour introduire un RP dans l'exon l'un des locus Pitx3, dans CSEh en utilisant un vecteur.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Travaux décrits dans ce protocole a été rendue possible grâce au financement du gouvernement de Victoria dans le cadre d'une alliance de collaboration avec l'Institut californien pour la médecine régénérative (CIRM).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fibroblastes embryonnaires de souris (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Grattoir cellulaire | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Crépine cellulaire - 40 &mu ; m | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0,22 &mu ; m filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R& D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Électroporateur | BioRad | 165-2661 | |
| Cuvette d’électroporation 0,4 cm | BioRad | 165-2088 | |
| Humain TV-hPITX3-construction de ciblage avant | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit ; Humain PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, origine américaine (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Mélange de milieu et de nutriments modifié Dulbecco’s Eagle F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| Remplacement de sérum KnockOut (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| Acides aminés non essentiels MEM ; (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß ;-mercaptoéthanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine solution de sel sodique (Sarcosyl) (30 %) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (amorce) : 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3' | GeneWorks, Australie | ||
| hPITX3 L bras GFP R (amorce) : 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3' | GeneWorks, Australie | ||
| HyperLadder 1 kb ; | Bioline Australie | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australie | 41003 |
Références
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
