Isolement de l'ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Résumé

Nous rapportons une procédure permettant d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris riche en ribonucléases.

Résumé

L’isolement d’ARN de haute qualité à partir de tissus riches en ribonucléases tels que le pancréas de souris présente un défi. Comme l’une des fonctions principales du pancréas est d’aider à la digestion, le pancréas de souris peut contenir jusqu’à 75 mg de ribonucléase. Nous rapportons des modifications des protocoles standard de réactifs de lyse du thiocyanate de phénol/guanidine pour isoler l’ARN du pancréas de souris. Le thiocyanate de guanidine est un puissant dénaturant protéique et perturbera efficacement l’activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. Cependant, des modifications critiques des protocoles standard sont nécessaires pour isoler avec succès l’ARN des tissus riches en ribonucléases. Les étapes clés comprennent un rapport réactif/tissu de lyse élevé, l’élimination des tissus non digérés avant la séparation de phase et l’inclusion d’un inhibiteur de ribonucléase dans la solution d’ARN. À l’aide de ces modifications et d’autres, nous isolons régulièrement les ARN dont l’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7. L’ARN isolé est de qualité appropriée pour l’analyse de routine de l’expression génique. L’adaptation de ce protocole pour isoler l’ARN des tissus riches en ribonucléases en plus du pancréas devrait être facilement réalisable.

Introduction

Isolement de l'ARN avec une haute intégrité est nécessaire pour des expériences de biologie moléculaire de routine telles que le nord-blot ^9, qRT-PCR ¹ ou profils d'expression génique ^5. La plupart des méthodes contemporaines de l'isolement de l'ARN sont fondées sur des modifications des protocoles de thiocyanate de guanidine ^{2, 3.} Guanidine thiocyanate est un dénaturant de protéines forte et efficace de perturber l'activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. La méthode populaire de Chomczynski et Sacchi ³ phénol combiné à la solution de thiocyanate de guanidine de lyse, ce qui....

Protocole

1. Préparation

Les pratiques suivantes adhèrent aux politiques établies par soin et l'utilisation des animaux Comité de l'institution (IACUC).

1. Il est recommandé d'isoler pas plus de 6 pancréas de souris en un jour donné. Vous avez tous les instruments chirurgicaux propres et autoclave, un jeu par animal.
2. Étiqueter tous les microtubes. Quatre tubes de 2 ml par animal.
3. Placer 8 ml de réactif de lyse dans 50 ml tubes de centrifugation sur la glace. Remarque: Bien que le kit de purification est livré avec un réactif au phénol de thiocyanate de guanidine qui est approprié pour l'isolement du pancr....

Résultats

Le rendement total de l'ARN à partir de 1 ml d'homogénat de lyse est de 20 à 40 ug. DO 260/280 ratios sont généralement autour de 2,0 et le RIN sont constamment supérieur à 7,0. Si le RIN est ≤ 6, l'isolement devra être répétée. De temps en temps, un RIN qui est supérieure à 8,0 est atteint.

Les deux méthodes les plus couramment utilisées pour euthanasier les souris avant le retrait du pancréas sont le CO ₂ asphyxie ou par inhalation d'isoflurane. Les deux techniques sont suivies .......

Discussion

Isolement de l'ARN à partir de tissus qui sont ribonucléase riche représente un grand défi pour les expériences de biologie moléculaire. Différents réactifs et des kits sont disponibles dans le commerce qui sont principalement basées sur la méthode phénol thiocyanate de guanidine de l'extraction de l'ARN. Le thiocyanate de guanidine dénature les protéines et réduit l'activité de la ribonucléase ainsi. Toutefois, l'ampleur de la ribonucléase dans le pancréas nécessite des modifications supplémentaires.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Puissance Gen 500  ;	Fisher Scientific	14-261-03  ;	Homogénéisateur
5424R	Eppendorf		Microcentifuge réfrigéré
Réactif de trizol	Invitrogen	15596018	Réactif de lyse
Student Vannas ciseaux à ressort	Fisher	91500-09  ;	Utiliser pour couper le pancréas des tissus attachés
Ciseaux chirurgicaux, 6 pouces	Fisher	08-951-20	À utiliser pour couper l’épilation de la souris
Pince à extrémité arrondie	Fisher	1381239	Utiliser pour tenir le pancréas pendant la dissection
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthésique
Rnase sortie (40 U/µ ; l)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivateur
d’eau de qualité HPLC	Fisher	W5-4	Pour le lavage des lames d’homogénéisateur
Eau de qualité biologie moléculaire	Hyclone	SH30538.03	Élution de l’ARN
miRNeasy Mini kit	purification
de 217004 QiagenTubes à centrifuger de 2 ml, certifiés sans Rnase Dnase	USA Scientific Plastics	1620-2700
Tubes à centrifuger de 15 ml	Falcon	352099
70 % éthanol	Fisher
100 % éthanol	Fisher
200 µ ; l pointes de pipette	Rainin	GPL200F	Pour le nettoyage des lames d’homogénéisateur
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotomètre
Bioanalyseur	Agilent		Analyseur d’électrophorèse capillaire pour mesurer l’intégrité de l’ARN
ARNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent  ;
RNeasy  ; colonnes de rotation  ;	Qiagen		Spins colonnes  ; dans le cadre du kit miRNeasy Mini Mice
	Chales	River Strain C57BL/6	Leur âge variait de 4 à 12 mois.   ;
Souris  ;	Jackson Lab	souche 129	Leur âge variait de 4 à 12 mois.   ;

Kit de