Isolement de l'ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Résumé

Nous rapportons une procédure permettant d’isoler l’ARN avec une grande intégrité du pancréas de souris riche en ribonucléases.

Résumé

L’isolement d’ARN de haute qualité à partir de tissus riches en ribonucléases tels que le pancréas de souris présente un défi. Comme l’une des fonctions principales du pancréas est d’aider à la digestion, le pancréas de souris peut contenir jusqu’à 75 mg de ribonucléase. Nous rapportons des modifications des protocoles standard de réactifs de lyse du thiocyanate de phénol/guanidine pour isoler l’ARN du pancréas de souris. Le thiocyanate de guanidine est un puissant dénaturant protéique et perturbera efficacement l’activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. Cependant, des modifications critiques des protocoles standard sont nécessaires pour isoler avec succès l’ARN des tissus riches en ribonucléases. Les étapes clés comprennent un rapport réactif/tissu de lyse élevé, l’élimination des tissus non digérés avant la séparation de phase et l’inclusion d’un inhibiteur de ribonucléase dans la solution d’ARN. À l’aide de ces modifications et d’autres, nous isolons régulièrement les ARN dont l’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) est supérieur à 7. L’ARN isolé est de qualité appropriée pour l’analyse de routine de l’expression génique. L’adaptation de ce protocole pour isoler l’ARN des tissus riches en ribonucléases en plus du pancréas devrait être facilement réalisable.

Introduction

Isolement de l'ARN avec une haute intégrité est nécessaire pour des expériences de biologie moléculaire de routine telles que le nord-blot ^9, qRT-PCR ¹ ou profils d'expression génique ^5. La plupart des méthodes contemporaines de l'isolement de l'ARN sont fondées sur des modifications des protocoles de thiocyanate de guanidine ^{2, 3.} Guanidine thiocyanate est un dénaturant de protéines forte et efficace de perturber l'activité de la ribonucléase dans la plupart des conditions. La méthode populaire de Chomczynski et Sacchi ³ phénol combiné à la solution de thiocyanate de guanidine de lyse, ce qui réduit le temps d'isolement à environ 4 heures. Disponibles dans le commerce de nombreux réactifs d'extraction d'ARN sont basées sur la méthode de Chomczynski et Sacchi ^3.

Ribonucléase tissus riches comme humain ou de souris pancréas présente un défi supplémentaire pour isoler l'ARN. Pancréas de souris peut contenir jusqu'à 75 mg de ribonucléase ⁶ dont certains seront publiés During perturbation du tissu pancréatique résultant en l'autolyse des tissus. Des modifications des protocoles guanidine thiocyanate ont été utilisés avec succès pour isoler l'ARN à partir du pancréas avec une grande intégrité ^{de 2, 4, 7, 10.} Infusion d'ARN réactif de stabilisation dans le pancréas de souris isolement facilité de l'ARN avec une haute intégrité ^{4, 7, 10,} cependant infusion de solutions dans le pancréas nécessite une grande habileté, peuvent nécessiter des instruments spécialisés, tels que un microscope à dissection et une rupture de l'architecture des tissus au cours de la procédure peut se traduire par la lyse cellulaire. Tissu perfusion avec le réactif de stabilisation de l'ARN pourrait interférer avec d'autres applications, y compris l'isolement des protéines et coloration histologique. De plus, cette technique n'est pas adaptée pour isoler l'ARN à partir de pancréas humain. D'autres protocoles nécessitent la préparation de solutions spécifiques par l'enquêteur ^2.

Nous rapportons un protocole pour isoler l'ARN avec une haute intégrité du pancréas de souris. Thprotocole e utilise des éléments de méthodes déjà publiées et repose en grande partie sur les protocoles réactifs standards phénol / guanidine thiocyanate base-lyse. Il ne nécessite pas la préparation de solutions spécialisées et ne nécessite pas la perfusion de réactifs dans le pancréas. Les étapes critiques pour l'isolement de l'ARN avec succès comprennent un phénol / à base de guanidine réactif de lyse rapport élevé de tissu, des prélèvements de tissus non digérée avant la séparation de phase et l'inclusion d'un inhibiteur de ribonucléase à la solution d'ARN résultant. Utilisation de ceux-ci et d'autres modifications, on isole l'ARN avec RIN typiquement supérieur à 7 à utiliser en routine analyse de l'expression génique.

Protocole

1. Préparation

Les pratiques suivantes adhèrent aux politiques établies par soin et l'utilisation des animaux Comité de l'institution (IACUC).

1. Il est recommandé d'isoler pas plus de 6 pancréas de souris en un jour donné. Vous avez tous les instruments chirurgicaux propres et autoclave, un jeu par animal.
2. Étiqueter tous les microtubes. Quatre tubes de 2 ml par animal.
3. Placer 8 ml de réactif de lyse dans 50 ml tubes de centrifugation sur la glace. Remarque: Bien que le kit de purification est livré avec un réactif au phénol de thiocyanate de guanidine qui est approprié pour l'isolement du pancréas, le réactif de lyse est employé en raison de l'importance des volumes qui sont nécessaires pour l'isolation.
4. Distribuer environ 10 ml des solutions suivantes dans 15 ml tubes de centrifugation pour nettoyer les pales de l'homogénéisateur. L'éthanol, 70% (2 tubes), de l'eau de qualité HPLC (1 tube) et de l'eau de qualité HPLC contenant environ 200 pi de RNase extérieur ou ribonucléase inactivator équivalent.

2. Chirurgie, Pancréas Dissection et homogénéisation

1. Placez 1-2 ml d'isoflurane dans un bocal contenant gaze de coton ou du papier absorbant. Les souris sont placées sur une plate-forme qui les empêche d'atteindre la source de l'isoflurane. Ajouter isoflurane frais dans le pot avant d'anesthésier chaque souris.
2. Placez délicatement la souris dans le bocal contenant la isoflurane. Boucher le pot et surveiller les effets de l'anesthésie en tournant doucement le pot avant et en arrière. L'animal est anesthésié une fois qu'il est dans l'incapacité de se tenir dans sa 'propre.
3. Pour confirmation de l'anesthésie, enlever l'animal de la jarre et appliquer un pincement de l'orteil entreprise. Si la souris ne réagit pas au pincement de l'orteil, passez à l'étape 2.5.
4. Si la souris réagit au pincement de l'orteil, puis répétez les étapes 2.2 à 2.3.
5. Placez l'animal anesthésié sur la paillasse en position couchée. Disloquer le col de la souris en plaçant bien la main gauche sur le col de la souris. Noustion de la main droite saisir la queue de la souris et rapidement tirer vers le haut à un angle d'environ 45 ° à disloquer le col de l'utérus.
6. Fixer la carcasse à une surface (un morceau de mousse de polystyrène recouvert de niveau avec des serviettes en papier) en perçant chacun des quatre pattes de l'animal dans la surface plane en utilisant jauge 25 aiguilles hypodermiques.
7. Utilisation d'instruments chirurgicaux stériles, couper la partie centrale de la souris et retirez le pancréas de la souris rapidement. Utilisez la pince pour tenir le pancréas et le couper de la rate et l'intestin grêle avec des ciseaux à ressort. Veillez à ne pas étirer le pancréas lors de l'enlèvement de la souris. Perturbation des tissus pourrait libérer ribonucléase. Remarque: Le temps qu'il faut pour éliminer le pancréas de la souris est indispensable. Un homme du métier devrait être capable de disséquer le pancréas en environ 1 min ou moins.
8. Placer l'ensemble du pancréas dans un tube de 50 ml contenant 8 ml de glace froid réactif de lyse. Boucher le tube et agiter brièvement à plonger le tiuestion dans le réactif et passer à l'étape suivante sans retard. Le rapport de réactif de lyse de tissu est critique. Voir la section des résultats d'une comparaison de l'intégrité de l'ARN isolé en utilisant différents volumes de réactif de lyse.
9. Homogénéiser pendant 5 sec. Il est important de presser les lames d'homogénéisation au fond du tube de centrifugation pour permettre au tissu d'être tiré dans les pales d'homogénéisation efficace.

3. L'élimination des tissus non digérés

Note: Après l'homogénéisation, de petits morceaux de tissu restent dans le réactif de lyse. Il est plus important pour lyser rapidement le tissu en laissant un peu de tissu non digéré plutôt que sur l'homogénéisation et la dégradation des risques de l'ARN.

1. Transférer 2 ml de réactif de lyse contenant du pancréas lysées à un tube de microcentrifugation de 2 ml. Recueillir deux microtubes d'homogénat par l'isolement. Jeter le broyat ou magasin restant à -80 ° C pour de futures études.
2. Centrifuge à 4 ° C, 12 000 g pendant 5 min pour sédimenter les tissus non digérés. Il s'agit d'une étape essentielle dans le report des tissus non digérés dans les solutions suivantes de l'ARN sera probablement contaminer l'échantillon avec la ribonucléase (étape 5.13).
3. Transfert 1 ml du surnageant dans un tube de 2 ml à centrifuger. Procéder à l'isolement immédiatement et stocker le tube répliqué à -80 ° C pour une utilisation future. Placer tous les tubes contenant homogénat sur de la glace tout en procédant à l'étape suivante.
4. Éliminer le réactif de lyse restant dans un réceptacle de déchets chimique approprié.

4. Nettoyage des lames Homogénéisateur

1. Avant de passer à la prochaine isolement, nettoyer les pales du homogénéisation en les plaçant dans 10 ml d'éthanol à 70%. Activez l'homogénéisation pendant environ 20 secondes pour enlever les morceaux de tissu qui peut être pris dans les pales.
2. Utiliser un embout de pipette 200 ul à enlever tous les morceaux qui restent dans les lames de homogénéisation.
3. Répétez l'étape 4.1 dans l'eau, inactivator général RNase et 70% d'éthanol. Sécher l'arbre d'homogénéisation avec un chiffon propre Kim.
4. Répétez l'étape 2.1 pour l'isolement du pancréas des animaux restants, ARN garder isolés les uns séparés des animaux plutôt que la mise en commun de l'ARN.

5. RNA

La section suivante est identique au protocole de la trousse de purification. L'avantage du kit de purification, c'est qu'il va isoler l'ARN total, y compris les petits ARN.

1. Si vous utilisez une solution de broyât congelé, décongeler sur la glace humide et laisser reposer à température ambiante pendant 5 min.
2. Ajouter 200 ul de chloroforme, boucher le tube et agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 2-3 min.
3. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg, 4 ° C.
4. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger. Ajouter 1,5 volume d'isopropanol et mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
5. Transférer jusqu'à 700 ul de l'échantillon dans une colonne de centrifugation qui est placé dans un tube de collecte de 2 ml. Fermez le couvercle et centrifuger à 8000 g pendant 15 sec à température ambiante.
6. Jeter l'effluent à travers.
7. Répéter les étapes 5.5 à 5.6, en utilisant le reste de l'échantillon.
8. Ajouter 700 ul de tampon RTT à la colonne. Centrifuger pendant 15 s à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers.
9. Déposer 500 pi de tampon RPE dans la colonne. Centrifuger pendant 15 secondes à 8000 x g pour laver la colonne. Jeter l'effluent à travers.
10. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne. Centrifuger pendant 2 min à 8000 xg pour sécher la colonne.
11. Transférer la colonne de centrifugation dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Pipette 80 pi d'eau libre ribonucléase directement sur la membrane de la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 8000 x g pour éluer l'ARN.
12. Ajouter un inhibiteur de la RNase 1 ul de la solution d'ARN. Stocker à -80 ° C ou procéder à 5.13.
13. Pour valider l'intégrité de l'ARN, d'abord calculer la conce ARNntration et 260/280 taux à l'aide d'un spectrophotomètre.
14. Diluer une partie de la solution d'ARN à environ 500 ng / ul avec de l'eau de qualité biologie moléculaire.
15. Déterminer l'ARN intégrité (c'est-à-RIN) en utilisant une analyse par électrophorèse capillaire. Environ 5 ul de solution d'ARN est suffisante pour l'analyse.
16. Aliquoter la solution d'ARN (voir la figure 2) et conserver à -80 ° C.

Résultats

Le rendement total de l'ARN à partir de 1 ml d'homogénat de lyse est de 20 à 40 ug. DO 260/280 ratios sont généralement autour de 2,0 et le RIN sont constamment supérieur à 7,0. Si le RIN est ≤ 6, l'isolement devra être répétée. De temps en temps, un RIN qui est supérieure à 8,0 est atteint.

Les deux méthodes les plus couramment utilisées pour euthanasier les souris avant le retrait du pancréas sont le CO ₂ asphyxie ou par inhalation d'isoflurane. Les deux techniques sont suivies ...

Discussion

Isolement de l'ARN à partir de tissus qui sont ribonucléase riche représente un grand défi pour les expériences de biologie moléculaire. Différents réactifs et des kits sont disponibles dans le commerce qui sont principalement basées sur la méthode phénol thiocyanate de guanidine de l'extraction de l'ARN. Le thiocyanate de guanidine dénature les protéines et réduit l'activité de la ribonucléase ainsi. Toutefois, l'ampleur de la ribonucléase dans le pancréas nécessite des modifications supplémentaires...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Puissance Gen 500  ;	Fisher Scientific	14-261-03  ;	Homogénéisateur
5424R	Eppendorf		Microcentifuge réfrigéré
Réactif de trizol	Invitrogen	15596018	Réactif de lyse
Student Vannas ciseaux à ressort	Fisher	91500-09  ;	Utiliser pour couper le pancréas des tissus attachés
Ciseaux chirurgicaux, 6 pouces	Fisher	08-951-20	À utiliser pour couper l’épilation de la souris
Pince à extrémité arrondie	Fisher	1381239	Utiliser pour tenir le pancréas pendant la dissection
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthésique
Rnase sortie (40 U/µ ; l)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivateur
d’eau de qualité HPLC	Fisher	W5-4	Pour le lavage des lames d’homogénéisateur
Eau de qualité biologie moléculaire	Hyclone	SH30538.03	Élution de l’ARN
miRNeasy Mini kit	purification
de 217004 QiagenTubes à centrifuger de 2 ml, certifiés sans Rnase Dnase	USA Scientific Plastics	1620-2700
Tubes à centrifuger de 15 ml	Falcon	352099
70 % éthanol	Fisher
100 % éthanol	Fisher
200 µ ; l pointes de pipette	Rainin	GPL200F	Pour le nettoyage des lames d’homogénéisateur
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotomètre
Bioanalyseur	Agilent		Analyseur d’électrophorèse capillaire pour mesurer l’intégrité de l’ARN
ARNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent  ;
RNeasy  ; colonnes de rotation  ;	Qiagen		Spins colonnes  ; dans le cadre du kit miRNeasy Mini Mice
	Chales	River Strain C57BL/6	Leur âge variait de 4 à 12 mois.   ;
Souris  ;	Jackson Lab	souche 129	Leur âge variait de 4 à 12 mois.   ;

Kit de