Article de méthode

Haute résolution spatio-temporelle d'analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

DOI :

10.3791/51784

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25 juillet 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology and Bio-Imaging Center/Rudolf Virchow Center, DFG-Research Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg, Germany

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Résumé

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Microscopie de molécule unique est en train de devenir une approche puissante pour analyser le comportement de molécules de signalisation, en particulier concernant les aspects (par exemple., La cinétique, la coexistence de différents états et des populations, des interactions transitoires), qui sont généralement cachés dans des mesures d'ensemble, tels que celles obtenues avec des procédés biochimiques ou microscopie standard. Ainsi, les événements dynamiques, tels que les interactions récepteur-récepteur, peuvent être suivies en temps réel dans une cellule vivante avec une résolution spatio-temporelle élevée. Ce protocole décrit une méthode basée sur l'étiquetage de petites et lumineuses fluorophores organiques et totale de fluorescence à réflexion interne (FRBR) de microscopie pour visualiser directement les récepteurs simples sur la surface de cellules vivantes. Cette approche permet de localiser précisément des récepteurs, de mesurer la taille de complexes de récepteurs, et capturer les événements dynamiques tels que les interactions récepteur-récepteur transitoire. Le protocole fournit une description détaillée de la façon de perform une expérience unique molécule, y compris la préparation de l'échantillon, l'acquisition de l'image et l'analyse d'image. A titre d'exemple, l'application de cette méthode pour analyser deux G-récepteurs couplés aux protéines, c'est à dire., Β 2-adrénergiques et γ-aminobutyrique de type acide B (GABA B) récepteur, est rapporté. Le protocole peut être adapté à d'autres protéines de membrane et des modèles de cellules différentes, les méthodes de transfection et les stratégies de marquage.

Introduction

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Des récepteurs situés à la surface des cellules détectent l'environnement extracellulaire et de répondre à une variété de stimuli, tels que des agents odorants, des ions, des neurotransmetteurs petites et de grandes hormones protéiques. La nature du fluide des membranes cellulaires permet des mouvements de récepteurs et d'autres protéines membranaires. Ceci est essentiel pour la formation de complexes de protéines et la survenue d'interactions protéine-protéine transitoires, telles que celles utilisées par les récepteurs de s'assembler en des unités fonctionnelles et la transduction de signaux à l'intérieur de la cellule. Par exemple, G-récepteurs....

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Protocole

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1. Préparation de l'échantillon

  1. Nettoyage lamelle
    REMARQUE: Travailler sous une hotte.
    1. Utiliser des pinces propres à placer des lamelles de verre (diamètre 24 mm) dans un support de lamelle qui sépare les lamelles individuelles.
    2. Placer le support à lamelles dans un bécher, et ajouter le chloroforme jusqu'à ce que les lamelles sont couverts. Recouvrir de papier d'aluminium pour réduire l'évaporation et de traitement par ultrasons dans un bain sonique pendant 1 heure à température ambiante. Retirez le support de la lamelle sur le bécher et laisser les lamelles sec.
    3. Répétez l'étape 1.1.2 avec une solution de ....

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Résultats

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Le protocole décrit peut être appliqué à une variété de différentes protéines membranaires. A titre d'exemple, des résultats représentatifs obtenus avec β 2-adrénergiques et GABA B sont rapportés 10. Comme les signaux fluorescents à partir de molécules simples sont faibles, la minimisation de la fluorescence de fond est la première étape clé de bons résultats. Ainsi, il est important d'utiliser des lamelles couvre largement nettoyées (Figure 2A), ainsi que pour réduire a.......

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Discussion

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Le protocole décrit permet l'analyse de l'agencement spatial, la mobilité et la taille des complexes de récepteurs de surface cellulaire au niveau d'une seule molécule. Par rapport à l'utilisation de protéines fluorescentes, le marquage avec de petites fluorophores organiques, qui sont plus lumineux et plus photostable, a l'avantage de permettre une visualisation étendue de particules de récepteurs individuels. Etant donné que les niveaux d'expression obtenus sont extrêmement faibles (<0,45 pa.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Le développement de ce protocole a été soutenu par des subventions du Conseil européen de la recherche (Advanced Grant TOPAS à M.J.L.) et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subventions CA 1014/1-1 à D.C. et SFB487 à M.J.L.). T.S. a été soutenu par la Fondation Alexander von Humboldt.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ChloroformAppliChem GmbHA1585ATTENTION : substance toxique et irritante ainsi qu’un possible cancérogène
NaOHSigma-AldrichS8045ATTENTION : base forte et réactif hautement corrosif
Éthanol absoluSigma-Aldrich32205
Lamelle de protection en verre  ;Marienfeld-Superior11164024 mm de diamètre, 0,13-0,16 mm d’épaisseur
0,2 mm filtre stérileSarstedt83.1826.001
CellulesCHO ATCC, USAATCC CCL-61Lignée cellulaire ovarienne de hamster chinois Plaque
de culture cellulaire à 6 puitsNunc140675
DMEM/F-12 milieuGIBCO, Life Technologies11039-021Milieu sans rouge de phénol
Sérum fœtal bovin  ;BiochromS 0115
Pénicilline - streptomycine  ;Pan Biotech GmbHP06-07 100
Trypsine-EDTAPan Biotech GmbHP10-23100
Lipofectamine 2000Invitrogen, Life Technologies11668-019
Opti-MEM I Sérum Réduit MediumInvitrogen, Life Technologies31985-047
Benzylguanine conjuguée aux fluorophores  ;Nouvelle-Angleterre BioLabsS9136SSNAP-Surface Alexa Fluor 647. Préparez une solution mère de 1 mM dans du DMSO. Conserver à -20° ;C.
DMSOAppliChem GmbHA1584
Tampon d’imagerie :137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3, stérile-filtré
  ;   ;   ; NaClAppliChem GmbHA1371
  ;   ;   ; KClAppliChem GmbHA3582
  ;   ;   ; CaCl2AppliChem GmbHA2303
  ;   ;   ; MgCl2AppliChem GmbHA3618
  ;   ;   ; HEPESAppliChem GmbHA3724
Chambre d’imagerieSondes moléculaires, Life TechnologiesA-7816Chambre cellulaire attofluor, pour microscopie
TIRF-MLeicaModèle : DMI6000B
objectif TIRFLeica11 506 249  ;HCX PL Apo 100x/1.46 Huile CORR  ;
Caméra EM-CCD  ;Roper ScientificPhotometrics Cascade 512B
Régulateur de températurePeconTempcontrol 37-2 logiciel
numérique ImageJNIH, États-Unishttp://rsbweb.nih.gov/ij
logiciel u-trackLaboratoire de biologie cellulaire computationnelle, Département de biologie cellulaire, Harvard Medical School, États-Unishttp://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab softwareThe MathWorks, États-Unis

Références

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  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol To....

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Mots-clés

Single molecule FluorescenceTIRF MicroscopyReceptor DynamicsReceptor ComplexesTransient InteractionsParticle TrackingMixed Gaussian FittingDiffusion CoefficientsOrganic FluorophoresCover Slip Cleaning

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