Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

Résumé

Dans ce protocole vidéo, nous suivons - à grande vitesse et en trois dimensions - des lysosomes marqués par fluorescence dans des cellules vivantes, en utilisant la méthode de suivi orbital dans un microscope à deux photons modifié.

Résumé

L'objectif de ce protocole vidéo est de discuter de la façon d'effectuer et d'analyser une expérience fluorescente en trois dimensions suivi de particules orbital en utilisant un microscope à deux photons modifié ^1. Contrairement aux approches classiques (de balayage de trame ou à grand champ basé sur une pile de cadres), le suivi orbitale 3D permet de localiser et de suivre avec une grande spatiale (10 précision nm) et la résolution temporelle (réponse en fréquence de 50 Hz) le déplacement 3D de une particule fluorescente déplacer sur la longueur des échelles de centaines de microns ^2. La méthode est basée sur un algorithme de contre-réaction qui commande le matériel de deux photons microscope à balayage laser pour effectuer une orbite circulaire autour de l'objet à suivre: le mécanisme de rétroaction maintient l'objet fluorescent dans le centre de commande du déplacement de le faisceau de balayage ^5.3. Pour démontrer les avantages de cette technique, nous avons suivi un organite se déplaçant rapidement, le lysosome, dans alcellule iving ^6,7. Les cellules ont été étalées selon des protocoles standard, et colorées à l'aide d'un colorant dans le commerce lysosome. Nous discutons brièvement la configuration matérielle et plus en détail le logiciel de contrôle, à réaliser une expérience de suivi orbitale 3D à l'intérieur des cellules vivantes. On discute en détail les paramètres nécessaires afin de contrôler le microscope à balayage et permettre le mouvement de la poutre sur une orbite fermée autour de la particule. Nous concluons en démontrant comment cette méthode peut être utilisée efficacement pour suivre le mouvement rapide d'un lysosome marqué le long des microtubules en 3D dans une cellule vivante. Les lysosomes peuvent se déplacer à des vitesses de l'ordre de 0,4-0,5 um / s, en affichant un mouvement généralement dirigé le long du réseau de microtubules ^8.

Introduction

Un grand nombre d'approches ont été développées à ce jour pour suivre les particules fluorescentes dans trois dimensions à l'aide d'un microscope. La plupart des approches reposent sur l'utilisation de caméras rapides, parfaitement adapté pour suivre en deux dimensions, typiquement combinées avec les adaptations personnalisées de l'optique d'émission du microscope pour réaliser un suivi dans le sens axial. microscopes à balayage laser (soit confocale ou deux photons) conventionnelle peut suivre une particule fluorescente en effectuant une séquence temporelle de z-piles, même si ce processus est généralement beaucoup de temps, et donne la résolution de temps raisonnable (10 Hz) que si la particule étant suivi est conservé dans le centre d'une petite région de formation d'image tramée par un mécanisme de rétroaction actif ^2.

L'idée de l'immobilisation de la particule est la base de la méthode de suivi orbital. Au lieu d'une trame numériser une orbite circulaire est réalisée autour de la particule fluorescente. L'intensité de la fluorescence le long del'orbite localise précisément la position des particules ^4.

La position localisée de la particule peut ensuite être utilisé pour actionner les scanners de microscope et recentrer les orbites de la position de la particule. Les scanners galvanométriques du microscope sont entraînés par une tension analogique. La composante alternative de cette tension permet d'effectuer une orbite avec le faisceau laser focalisé, c'est à dire un sinus et une onde cosinus appliquée à des miroirs X et Y balayage permettant d'effectuer une orbite circulaire. Le décalage en courant continu du signal facilite le changement de la position du centre de l'orbite. Une fois la période de l'orbite est déterminée et la forme d'onde pour le signal en courant alternatif est configuré, le système de rétroaction a besoin pour mettre à jour uniquement la composante continue du signal.

Un logiciel capable de lire le signal fluorescent recueillies par les détecteurs est nécessaire pour contrôler les scanners et les détecteurs, de calculer la position de la particule et mettre à jour la DC horsdéfinir. Pour un retour réussi imagerie d'un choix judicieux des paramètres orbitaux (taille et de synchronisation) est nécessaire et ces paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques des particules fluorescentes, il est nécessaire de suivre.

Les fondements physiques et mathématiques de la technique ont été décrites dans le passé ^{de 4,5} pour les applications 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons brièvement les principaux composants matériels de l'installation, et plus en détail le choix des paramètres et la préparation de l'échantillon nécessaire pour une expérience typique qui nous a permis suite au déplacement d'un lysosome à une haute résolution temporelle dans une cellule vivante.

Protocole

Préparation de l'échantillon 1

1. Maintenir des cellules CHOK1 dans des flacons de culture de tissus à l'aide de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 100 UI / ml de pénicilline 50 pg / ml de streptomycine. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% _de CO2 à 37 ° C.
2. Récolte et ensuite sur l'assiette cellules CHOK1 un diamètre de micro-puits de 14 mm avec une épaisseur de 0,16 mm de surface. cellules de semences pour la densité optimale pour l'imagerie, environ 60-70% de confluence.
3. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% CO _2. Laver les cellules trois fois dans du HBSS (solution saline tamponnée de Hank), et incuber les cellules dans une solution contenant 50 nM de Lysotracker DND26 vert et 150 nM de la tubuline traqueur vert. Incuber les cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Etape facultative: Avant l'incubation, effectuer une tache supplémentaire avec un colorant matrice de coloration mitochondriale (25 nM).
4. Laver les cellules trois fois dans du HBSS pour éliminer tout colorant non lié. Ajouter milieu de croissance DMEM frais avant imagtion des cellules.

2. Configurations microscope

Le microscope pour le suivi des particules décrites dans le protocole vidéo est montée sur le châssis d'un microscope inversé disponible dans le commerce (Figure 4). Cependant modules commerciaux pour le suivi des particules orbitale 3D sont maintenant disponibles.

1. Utilisez un II cohérente Chameleon Ultra-Ti: source de lumière d'excitation laser femtoseconde Sa, avec une gamme accordable sortie d'onde comprise entre 690 nm-1040 nm.
2. Assurez-vous que le faisceau laser soit aligné sur l'orifice arrière du microscope en utilisant un miroir à revêtement IR. Le faisceau laser est atténué à l'aide d'une lame demi-onde tournante suivie d'un polariseur linéaire de calcite. Atténuer le faisceau de telle sorte que la puissance moyenne de l'échantillon est compris entre 0,5 et 2 mW.
   NOTE: Le faisceau laser est réfléchi par une paire de miroirs actionnés galvanomètre moteurs qui permettent le contrôle de la position et de la trajectoire du faisceau focalisé dans le plan de l'échantillon. Dans unconfiguration typique du faisceau laser collimaté sortant de miroirs de galvanomètre agrandi (10X) passant à travers un élargisseur de faisceau, avant d'entrer à l'arrière de l'objectif de microscope, après réflexion sur courte passe-miroir dichroïque.
3. Collecter la lumière de fluorescence provenant de l'échantillon en plaçant un objectif de l'eau à grande ouverture numérique (60X, NA 1,2) dans le trajet de la lumière. Choisir un cube de filtre de fluorescence en fonction de la longueur d'onde d'émission souhaitées dans une ou l'autre configuration d'un ou deux canaux. Utiliser des filtres passe-bande d'émission pour sélectionner en outre la gamme spectrale de la fluorescence émise.
4. Placer l'échantillon sur une platine motorisée, et ajuster l'amende mouvement de l'objectif de microscope à l'aide d'un piézo-contrôleur objectif.
5. Diriger la lumière à partir du cube de filtre dans des tubes photomultiplicateurs où le signal est discriminé et envoyé à une carte E / S d'acquisition de données numériques.
   REMARQUE: Ordinateur généré des formes d'onde sont la sortie analogique de la carte E / S et sont provided pour les scanners de contrôle électronique. L'entrée de comptage de photons à partir des photomultiplicateurs et le signal de sortie pour les scanners sont mesurés et contrôlés par l'intermédiaire de la carte d'E / S par le Laboratoire de logiciel de dynamique de fluorescence SimFCS.

3. Imaging

1. Placez les cellules sur la scène et de se concentrer en utilisant un éclairage lumière transmise.
2. Mettre à balayage de trame imagerie pour identifier les cellules qui ont incorporé le colorant et de visualiser les microtubules sous-jacents. Identifier la zone initiale où le mouvement des vésicules est présent.
3. Une fois une vésicule isolé est identifié, définissez les paramètres suivants pour le suivi orbital:
   1. Sélectionner le rayon de l'orbite de définir la taille du balayage circulaire en fonction de la taille de la particule est suivie. Pour un émetteur ponctuel, définir le rayon de l'orbite égale à la taille de la fonction de flou (PSF) du faisceau d'excitation pour maximiser la sensibilité et la réponse.
   2. Réglez le axialdistance pour définir la distance entre les deux orbites qui sont exécutées pour localiser la position de la particule suivant la direction axiale. Réglez la distance axiale à 1,5-3 fois la taille de la PSF.
   3. Définir la durée de séjour en fonction de la luminosité de la particule pour définir le temps consacré à chaque point de l'orbite, ce qui permettra également de déterminer le taux de photo-blanchiment. Utilisez un temps d'arrêt entre 10-100 microsecondes.
   4. Définissez le nombre de points dans chaque orbite à 64 ou 128 pour obtenir des périodes orbitales de l'ordre de 4-32 ms et fournir une haute résolution temporelle pour déterminer la position de la particule.
4. Changer le signal de décalage à courant continu envoyée à miroirs afin de centrer le faisceau sur la particule par l'intermédiaire de l'interface utilisateur graphique par l'intermédiaire d'un curseur de sélection dans l'image de balayage de trame.
5. Commencer à suivre en changeant de mode de raster-imagerie microscope à balayage orbital.
6. Activer la collecte de commentaires et données.

4. TrajectAnalyse ory

1. Utilisez le logiciel pour afficher la fluorescence collectées à chaque point le long de l'orbite et à chaque point de temps sous la forme d'un «tapis d'intensité». L'intensité recueillie sur le tapis contient des informations sur l'interaction de la particule avec d'autres objets lumineux. Utiliser le logiciel pour afficher à la fois les informations de trajectoire (c'est à dire le déplacement continu au cours du temps de la x, scanners y et des z -piezo) ainsi que l'intensité de fluorescence collecté par le tube photomultiplicateur au cours du temps sous forme de séries chronologiques.
2. Utiliser la représentation de série de temps et l'information "d'intensité de tapis» à sélectionner uniquement une région d'intérêt dans la trajectoire.
3. Utiliser le logiciel pour afficher une projection 2D de la partie sélectionnée de la trajectoire des particules. Sélectionnez les contrôles appropriés à code couleur de la trajectoire selon l'intensité de fluorescence des particules.
4. Sélectionnez l'option pour afficher la pagearticle trajectoire en 3D, et un code couleur en fonction de l'intensité de fluorescence. Tournez la trajectoire en 3D en utilisant les contrôles de visualiser les caractéristiques de la motion de lysosome le long des microtubules.

Résultats

Selon ce protocole suivi rapide de particules isolées 3D peut être effectué à l'intérieur de cellules vivantes à l'aide d'un microscope à deux photons à jour pour suivre le déplacement des lysosomes marquées par fluorescence. L'expérience réalisée consiste en un suivi de lysosome isolée se déplaçant à l'intérieur de la cellule après le processus de maturation de l'endosome ^9. Les lysosomes ont été colorées en utilisant un colorant vert fluorescent et excités à 930 nm exploitant 2-photon excitation. Nos donnée...

Discussion

Malgré les énormes progrès des techniques de fluorescence en microscopie et instrumentations au cours des dernières années, la réalisation de trajectoires de particules fluorescentes en trois dimensions avec une résolution temporelle est restée un défi dans le domaine. Si une haute résolution temporelle a été atteinte particules de repérage à deux dimensions, l'extension à la direction axiale apporte généralement une réduction drastique de la réponse en fréquence du système ^10.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Tubuline tracker Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Glan Taylor Calcite Polarizer	Melles Griot	03PTA001
Galvanomètre-moteur miroir	Cambridge Technologies	M 6350
Miroir dichroïque	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Platine motorisée	ASI	MS2000
Piezo  ;	PI	P721-LLQ
Tube photomultiplicateur	Hamamatsu	H7422P-40
Carte d’acquisition de données	IO tech	PCI 1128-4000
Logiciel d’imagerie	LFD	Global pour images-SimFCS