In Vivo L'électroporation et microinjection de testicule de souris

Résumé

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

Résumé

Cette vidéo et l'article contribution donne une description complète de micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo. Cette technique de transfection particulier pour les cellules testiculaires de souris permet l'étude des processus uniques de la spermatogenèse.

Le protocole qui suit se concentre sur la transfection de cellules testiculaires de souris avec des constructions plasmidiques. Plus précisément, nous avons utilisé le vecteur rapporteur pEGFP-C1, qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) et aussi le vecteur pDsRed2-N1 exprimant la protéine fluorescente rouge (DsRed2). Les deux gènes rapporteurs codés étaient sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain précoce immédiat (CMV).

Pour effectuer un transfert de gène dans les testicules de souris, les constructions de plasmides rapporteur sont injectés dans les testicules de souris vivantes. À cette fin, les testicules d'un animal anesthésié est exposé et le site de micro-injection est préparée. Notre lieu privilégié deinjection est conduit efférent, avec le rete testis finalement connecté en tant que voie de transport anatomique des spermatozoïdes entre le testicule et l'épididyme. De cette manière, le remplissage des tubes séminifères après la micro-injection est très bien gérée et contrôlée grâce à l'utilisation de solutions d'ADN colorées. Après avoir observé un remplissage suffisant du testicule par sa structure de tube de couleur, l'organe est soumis à une électroporation. Ceci permet le transfert de la solution d'ADN dans les cellules testiculaires. À la suite de 3 jours d'incubation, le testicule est enlevé et étudiée au microscope à fluorescence verte ou rouge, ce qui illustre le succès de la transfection.

Généralement, ce protocole peut être utilisé pour fournir l'ADN ou l'ARN construit dans les testicules de souris vivante pour (sur) exprimer ou abattre des gènes, ce qui facilite l'analyse de la fonction des gènes in vivo. En outre, il est adapté pour l'étude de constructions rapporteurs ou règlements de gène putatiféléments conservateurs. Ainsi, les principaux avantages de la technique d'électroporation sont des performances rapides en combinaison avec peu d'effort ainsi que l'équipement technique modérée et les compétences requises par rapport à d'autres techniques.

Introduction

Spermatogenèse chez les mammifères est considérée comme un processus complexe de cellules souches auto-renouvelables subissant successivement la mitose, la méiose et de la différenciation, afin de développer dans les spermatozoïdes matures haploïde. Ces changements morphologiques sont orchestrées par différents types de cellules et malgré les tentatives profondes, il est encore impossible d'imiter ces procédés en culture cellulaire ^1,2. Par conséquent, la recherche sur la spermatogenèse jusqu'à maintenant s'appuie sur les organismes vivants comme des modèles in vivo. En général, les études de la fonction des gènes sont généralement bas....

Protocole

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Allemagne).

Préparation 1 Le plasmide

1. Pour la préparation de plasmides, en utilisant des kits de purification de plasmide (voir le tableau des matériaux) ou des procédés similaires avec du tampon d'élimination de l'endotoxine de sorte que les réactions immunitaires de l'animal peuvent être évités. Suivez les instructions du manuel. Employer le trou DDH ₂ O pour diluer la solution de plasmide.
2. Eliminer le....

Résultats

Le cadre expérimental pour réaliser une micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo tel qu'il est utilisé selon le protocole est illustré à la figure 1. Même si il est possible d'acquérir micropipettes fabriqués industriellement, nous avons préféré pour générer nos propres pipettes en tirant (figure 1A ) et le biseautage (figure 1B) des capillaires en verre de sorte que qu'ils équipés nos besoins. L'équipement pour la micro-in.......

Discussion

La recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction, en particulier dans le domaine de la fertilité masculine et la spermatogenèse inévitablement s'appuie sur les organismes vivants. Afin d'examiner la fonction testiculaire, pas de système de culture cellulaire adéquate / in vitro a été mis en place capable de réfléchir tous les essentiels des changements morphologiques d'un spermatogonies diploïdes à un ^1,2 spermatozoïde haploïde maturité. Ainsi, la production.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse	Sigma	1-15 PK
Spectrophotomètre	Nanodrop	ND-1000
Extracteur de micropipette	Narishige	PC-10	Extracteur de capillaires vertical
Micro-injection Capillaires	Clark	GC100-10	borosilicate paroi standard
Micropipette biseauteur	Bachofer	Typ 462	disque rotatif biseauteur
Électroporateur	Nepagene	CUY 21EDIT	Électroporateur à ondes carrées
Pince à épiler	Nepagene	CUY 650P5	5 mm & Oslash ; électrodes à disque
Stéréomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Source de lumière froide	Zeiss	KL 1500LCD
Pompe de micro-injection	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulateur	maison		XYZ table croisée
Instruments chirurgicaux	FST		ciseaux, pinces, porte-aiguille
Pince fine	FST	Dumont #5, #7	préparation des canaux efférents Clip
Michel application agrafeuse	FST	Michel, 12029-12
Michel pinces de suture	FST	Michel, 12040-01	7,5 x 1,75 mm
Suture chirurgicale	Catgut, Markneukirchen, Allemagne	Catgut 00
Seringue avec aiguille 30 G	B. Braun	Omnican 40	pour charge micropipette et pour anesthésie
Kit d’isolement du plasmide	Promega	Cat. # A2495	plasmide Midiprep
Plasmide pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	Promoteur CMV +
EGFP Plasmide pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	Promoteur CMV + DsRed2
Colorant vert rapide	Sigma	F7258-25G	pour dilution dans ddH2O
10 % Kétamine	Serum Werk, Bernburg, Allemagne	Mélange d’Urotamin	dans un taux de 1:1 avec xylazine
2 % Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Allemagne	Mélange de xylazin	dans un taux de 1:1 avec kétamine
Sterilium	Bode Chemie	Désinfection au stérilisaire
Pommade vétérinaire	S& K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5 %, Augensalbe	pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire
To-Pro-3 iodure	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofène, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	solution analgésique pédiatrique (AINS) pour le soulagement de la douleur postopératoire
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4· ; 2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1