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Article de méthode

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

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DOI :

10.3791/51805

⸱

20 octobre 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Dans cet article

Résumé

endocytose médiée par la clathrine, un processus rapide et hautement dynamique internalise de nombreuses protéines, y compris les récepteurs de signalisation. Le protocole décrit ici visualise directement la cinétique des événements endocytaires individuels. Ceci est essentiel pour comprendre comment les membres centraux de la machinerie endocytaire se coordonnent les uns avec les autres, et comment la cargaison de protéines influence ce processus.

Résumé

De nombreux récepteurs de signalisation importants sont internalisés par le processus bien étudié de l’endocytose médiée par la clathrine (CME). Les tests biologiques cellulaires traditionnels, qui mesurent les changements globaux dans l’endocytose, ont permis d’identifier plus de 30 composants connus participant à l’ECM, et les études biochimiques ont généré une carte d’interaction de bon nombre de ces composants. Cependant, il devient de plus en plus clair que la FMC est un processus très dynamique dont la régulation est complexe et délicate. Dans ce manuscrit, nous décrivons l’utilisation de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser directement la dynamique des composants de la machinerie endocytaire médiée par la clathrine, en temps réel dans les cellules vivantes, au niveau des événements individuels qui interviennent dans ce processus. Cette approche est essentielle pour élucider les changements subtils qui peuvent altérer l’endocytose sans la bloquer globalement, comme on le voit avec la régulation physiologique. Nous nous concentrerons sur l’utilisation de cette technique pour analyser un domaine d’intérêt émergent, le rôle de la composition de la cargaison dans la modulation de la dynamique des fosses distinctes recouvertes de clathrine (CCP). Ce protocole est compatible avec une variété de sondes de fluorescence largement disponibles et peut être appliqué à la visualisation de la dynamique de nombreuses molécules cargo qui sont internalisées à partir de la surface cellulaire.

Introduction

Le processus de clathrine endocytose (CME) dépend de l'arrivée au bon moment des nombreux composants de la machinerie d'endocytose clathrine pour recueillir le fret et manipuler la membrane plasmique dans les vésicules 1-3. CME est initiée par la déformation de la membrane et de la cargaison à l'adaptateur protéines qui se réunissent sur ​​les sites naissantes d'endocytose 1. Ces protéines recrutent la clathrine de protéine d'enveloppe, qui rassemble dans une structure en forme de cage qui forme la fosse recouverts de clathrine (PCC) 4. Une fois que le PCC est entièrement assemblé en une forme sphérique, la scission de la membrane, principalement grâce à l'action de la grande GTPase dynamine, génère gratuits vésicules de clathrine (CCVS) 5,6. Cette internalisation déclenche démontage rapide de la couche de clathrine, permettant aux composants d'être réutilisés pour de multiples séries de CME.

La découverte et la caractérisation des protéines impliquées dans la FMC a été enracinée dans Bioch traditionnelleemical, génétiques, et des techniques de microscopie 4-6,8. Ces essais ont permis d'élucider les rôles et les points d'interaction de ces composants d'endocytose. Bien que très utile pour définir des éléments essentiels de la machinerie de trafic, ces tests sont très limités à capturer le comportement dynamique des composants de FMC ou de la concentration de la cargaison. Il s'agit d'une limitation critique, puisque CME est entraîné par l'ensemble chorégraphié des ensembles de modules de protéines dans les étapes définies, et depuis de petits changements dans la dynamique des événements d'endocytose individuels peut avoir de grandes conséquences cumulatives sur l'endocytose. En outre, des données récentes indiquent que les CCP individuelles peuvent différer à la fois dans la composition et dans le comportement, ce qui suggère que la régulation physiologique de ce processus est très spatialement et temporellement limitée 9-14. Visualisation des événements d'endocytose individuels, par conséquent, il est essentiel de comprendre pourquoi il ya plusieurs protéines impliquées dans redondants CME et b comment ces protéines pourraient être contrôléssignaux physiologiques y pour réglementer cargaison internalisation.

Nous décrivons ici l'utilisation de la réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) pour observer CME au niveau de la dynamique des contreparties centrales individuelles dans les cellules vivantes. TIRFM repose sur la différence d'indice de réfraction entre la lamelle de verre et l'environnement de fluide de cellules 15,16. Lorsque la lumière d'excitation est dirigée vers les cellules situées plus à l'angle critique, elle est réfléchie à l'intérieur, ce qui crée une onde évanescente qui maintient un champ d'illumination mince s'étendant à peu près 100 nm au-dessus de la lamelle. Cela garantit que seules les molécules fluorescentes dans ce domaine étroit sont excités. En pratique, cela permet à l'excitation des molécules fluorescentes sur ou près de la membrane plasmique, et minimise la fluorescence à partir des parties intérieures de la cellule. Ceci permet d'obtenir un rapport signal sur bruit et la résolution de l'axe z sensiblement plus élevé pour visualiser les événements à la membrane plasmique, compared de modes plus couramment utilisés tels que épifluorescence classique ou microscopie par fluorescence confocale. Nous décrivons également, à une initiation et pratique, l'utilisation d'une image couramment utilisé la plate-forme d'analyse pour analyser et quantifier les caractéristiques et la dynamique des événements individuels cargaison de endocytose morphologiques simples.

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Protocole

1 Expression de fluorescence Tagged CME composants dans des cellules cultivées

Cellules HEK293 sont des cellules de modèles utiles qui ont été largement utilisés pour étudier la biologie RCPG et l'endocytose, et ne sont donc utilisés comme modèles de ce protocole. Utiliser n'importe quel protocole de transfection fournir expression uniforme sans surexpression et une faible cytotoxicité.

  1. Gérer toute la culture de cellules dans une hotte à flux laminaire stérile. Remplir 4 puits d'une plaque de 12 puits avec 1 ml de milieu essentiel modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS). A partir d'une fiole T25 confluente de cellules HEK293 diluer 01:50, 01:25, 01:16, 01:10, respectivement dans chacun des quatre puits.
    1. Sinon, semences cellules sur une plaque multi-puits de la taille souhaitée, selon les instructions du fabricant. Graine de 0,4 à 2 x 10 4 cellules dans une plaque à 12 puits. Cultiver les cellules pendant une nuit dans une solution stérile à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d'humidité.
      NOTE: Étant donné que la croissance rates varient en fonction des conditions et des lignées cellulaires, il peut être préférable pour ensemencer des puits multiples pour assurer la confluence idéal pour la transfection, le lendemain ou la possibilité de réaliser des transfections en double.
  2. Le lendemain matin, sélectionner un bien qui est ~ 70% de confluence pour la transfection (voir figure 1B). Si aucun puits a atteint cet état, attendre un autre jour.
    NOTE: 70% de confluence est idéal pour les cellules HEK293. Transfecter des cellules qui sont plus rares résultats dans la mort cellulaire et la toxicité. Transfection de cellules confluentes sur les résultats en faible expression.
  3. Ajouter 60 ul de tampon EC (de la trousse de transfection), 400 ng de plasmides codant étiqueté GPCR et / ou des composants de la machinerie de la clathrine et 2,4 pi d'activateur dans le tube de 1,5 ml, comme décrit dans le protocole du fabricant. Vortex pendant 2 secondes pour assurer un mélange suffisant, et tourner dans une microcentrifugeuse à 2000 g pendant 2 s pour collecter le liquide au fond.
  4. Ajouter6 pl Effectene comme décrit dans le protocole du fabricant. Vortex pendant 2 secondes, et centrifuger à 2000 g pendant 2 secondes dans une centrifugeuse pour collecter le liquide au fond. Attendre 20 min pour permettre la formation de micelles complexes de transfection.
  5. Aspirer le milieu du puits à être transfectées. Ajouter avec précaution 0,8 ml de DMEM avec 10% de FBS dans le mélange réactif de transfection et mélanger par pipetage de haut en bas afin de réduire lentement la rupture des micelles. Ajouter le support et le mélange de transfection pour le bien que très lentement à partir du côté. Ajouter tout mélange de transfection restante du tube à centrifuger pour le puits à l'aide d'une micropipette.
    NOTE: En option, ajouter un supplément de 0,5 ml de DMEM avec 10% de FBS au bien transfectées de donner les cellules nourriture supplémentaire résultant en transfection doux et expression transitoire inférieure.
  6. Retour aux cellules de la 37 ° C incubateur pendant 5 heures.
  7. Aspirer le milieu contenant le mélange de transfection. Remplacer avec 1 ml de DMEM avec 10% de FBS. Permettreles cellules de se développer pendant la nuit.
  8. Le lendemain, passer les cellules à lamelles non couchés, préalablement stérilisés par autoclave.
    1. Ajouter 0,5 ml de tampon phosphate salin (PBS) avec 1 mM d'EDTA dans chaque puits. Vous pouvez également utiliser 0,5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. Laisser dans l'incubateur pendant 1 min.
    2. Placez 3 rond, 25 mm lamelles stériles dans des puits séparés d'une plaque à 6 puits. Remplir chaque puits avec 2 ml de milieu. Pousser doucement la lamelle vers le fond du puits pour empêcher les cellules de se développer sur le fond de la lamelle.
    3. Manuellement agiter le bien décoller les cellules du fond du puits. Ajouter 1 ml de DMEM avec 10% de FBS pour suspendre à. Distribuez les cellules levées à partir du 1er puits d'une plaque de 12 puits de manière égale entre les trois lamelles. Alternativement, la plaque cellules sur 3 plats à fond de verre.
  9. Permettre aux cellules de se développer sur les lamelles pendant au moins 48 heures avant l'imagerie. Veiller à ce que les cellules sont étalées et plat.

2.Imagerie PCC et de fret Dynamics Utilisation TIRFM

  1. Anticorps anti-FLAG conjugué M1 avec des colorants Alexa utilisant Alexa Fluor kit protéines d'étiquetage selon le protocole de la fabrication. Alternativement, les anticorps pré-conjugués peuvent être achetés.
  2. Pré-incuber les cellules avec les anticorps à une dilution de 1: 1000 à 1 ml de milieu préchauffé Leibovitz avec 10% de FBS, ou Opti-MEM avec 50 mM de HEPES pH 7,4 et 10% de FBS pendant 10 min à 37 ° C (formation d'image moyen), pour marquer des GPCR étiquetée FLAG sur la surface de la cellule. Passer ces étapes si les protéines fluorescentes codées génétiquement, comme la GFP, sont utilisés comme étiquettes (voir la discussion pour plus de détails).
  3. Transférer la lamelle à une chambre d'imagerie des cellules vivantes. Sinon, pour les plats à fond de verre, aspirer médias anticorps-étiquetage et ajouter 700 pi de milieu de l'imagerie pré-chauffé.
    1. Utilisez une paire de pinces et plier la pointe d'une aiguille de calibre 25 dans un crochet.
    2. Tenez une paire de pinces à la main dominante. Tenez l'aiguille recourbée en OTHer. Tourner l'aiguille jusqu'à ce que les courbes de crochet vers le bas vers le verre. Faire glisser doucement l'aiguille, côté crochet vers le bas, à travers le fond d'une plaque à 6 puits jusqu'à ce qu'il s'accroche à la lamelle. Prenez soin de ne pas rayer la surface de la lamelle, comme il détacher les cellules. Soulevez délicatement la lamelle du fond du puits. Équilibrer la lamelle contre le mur du puits de soutien.
    3. Utiliser la pince pour saisir à proximité du bord de la lamelle couvre-objet et déplacer du côté de la cellule de la lamelle jusqu'à la chambre d'imagerie, et à assembler la chambre. Ajouter 700 ul (ou quantité appropriée) du milieu de l'imagerie pré-chauffé. Manipuler avec précaution les lamelles sans pression pour éviter les fissures ou rupture.
  4. Transférer la chambre sur le microscope et maintenir la température des cellules à 37 ° C en utilisant un dispositif de chauffage de l'étape ou un incubateur fermé.
  5. Apportez cellules dans le foyer en utilisant un objectif à immersion d'huile 100X ou 60X FRBR (1,45 NA ou au-dessus). Image les cellules en épifluorescence ou con classiquemodes d'intervention de l'éclairage (c'est à dire pas TIRFM) pour identifier les cellules exprimant les constructions appropriées. Out-of-focus cellules sont presque invisibles dans la mince profondeur d'éclairage FRBR ce qui rend difficile de trouver le plan focal et cellules.
    REMARQUE: Certains systèmes utilisent les mêmes lasers pour TIRFM à l'image en épifluorescence classique, en déplaçant l'angle d'incidence du laser au-dessus de l'angle critique. Comme une mesure de sécurité importante, toujours être conscient de l'angle du faisceau laser, et toujours diriger loin de l'observateur.
  6. Concentrer le bas à la surface inférieure d'une cellule exprimant jusqu'à ce que le contour de la membrane de plasma autour de la cellule disparaît et le centre de la cellule apparaît. Ceci est plus évident avec une protéine cargo localisée de la membrane plasmique, tels que le récepteur de μ-opioïdes (voir figure 2A).
  7. Passez à l'imagerie TIRF.
    1. Si l'on utilise le même laser pour l'imagerie à épifluorescence classique, d'augmenter l'angle d'incidence de l'fluorescence laser jusqu'à ce que l'extérieur de la mise au point à l'intérieur de la cellule disparaît, et sans contour de la membrane de plasma autour de la cellule est considéré. (Comparez la figure 2C aux figures 2A et 2B)
      NOTE: Dans TIRFM, déplacer le plan focal, l'image d'aller complètement hors du foyer et / ou faible, et les niveaux de fluorescence globale diminue en raison de la plus petite profondeur d'éclairage. Par conséquent, une autre méthode pour mettre à l'illumination de TIRFM est d'abord mise au point sur le centre de la cellule en épifluorescence confocale / classique, puis à augmenter l'angle d'incidence jusqu'à perdre plus de la fluorescence, et ensuite concentrer jusqu'à la membrane plasmique.
    2. Une fois dans TIRFM, assurer le laser d'excitation reflète à travers l'objectif et n'est pas visible au-dessus de l'objectif. Confirmer en vérifiant si le spot laser est visible.
      NOTE: Dans les modes de épifluorescence ou confocale classiques, l'illumination laser est visible au-dessus de l'objectif,par exemple sur le plafond.
    3. Affiner la mise au point pour obtenir une image nette. Les principaux composants de la machinerie d'endocytose, telles que la clathrine, seront visibles dans lacrymaux. Réglez la mise sur amende, si les points lacrymaux sont aussi ronde que possible.
      REMARQUE: Pour le fret membrane localisée, ajuster la mise au point fine jusqu'à la filopodia semble distincte.
    4. Utilisez un programme d'acquisition pour enregistrer tous les paramètres d'imagerie tels que les miroirs et l'angle de la FRBR. Faites de même pour toutes les longueurs d'onde nécessaires.
  8. Scannez autour de la lamelle de trouver des cellules exprimant tous les marqueurs d'endocytose souhaités: le récepteur μ-opioïde et l'adaptateur β-arrestine dans l'exemple représenté sur la figure 3A. Sélectionnez les cellules qui expriment mais pas trop exprimant. Voir discussion pour plus de détails.
  9. Une fois que les cellules sont identifiées, d'acquérir des images toutes les 3 secondes pendant 10 min. Cela est suffisant pour capturer la durée de vie d'une contrepartie centrale, puisque la durée de vie moyenne d'un CCP dans les cellules HEK293 imagées dans ces conditions est aro40 und 10 à 11 sec. Cela permet environ 12-14 images d'observer le PCC. Par exemple, voir le film 1. Répéter toutes les étapes de cellules supplémentaires d'image.

3 Analyse de la dynamique endocytose par vérification manuelle

Bien que la vérification manuelle de la durée de vie du PCC est fortement limitée par le nombre de contreparties centrales qui peuvent être détectés, il reste encore un moyen précis de détection sans se laisser décourager par les changements globaux dans l'image et de détection des objets. Voir discussion pour plus de détails.

  1. Ouvrez le fichier dans ImageJ. Les images sont stockées dans une pile de fichiers TIFF avec chaînes entrelacées. Convertir les images en hyperstacks. Allez dans Image> Hyperstacks> Pile à HyperStack. Entrez le nombre de canaux acquis (c'est à dire si l'imagerie β-arrestine et le récepteur μ-opiacé, entrez 2), Saisissez 1 pour Z pile (TIRFM est un seul plan), et le nombre d'images du film (c'est à dire 10 min film à 1 image toutes les 3 s is 200) dans la fenêtre pop-up.
  2. Le format HyperStack donne une fenêtre avec deux barres de défilement. Utilisez la barre haut pour parcourir les canaux et le fond de se déplacer à travers le temps. Faites défiler jusqu'au canal de la protéine dont la durée de vie va être testée.
  3. Déplacez à encadrer 10 ou 15 du film à réduire l'inclusion des contreparties centrales préexistantes dont les durées entier ne sont pas visibles. Dessiner une boîte de ROI autour d'un point choisi au hasard.
  4. Comptez le nombre de cadres est un endroit visible.
    REMARQUE: Voir la figure 3B et 3C pour des exemples de trois catégories morphologiques d'événements d'endocytose 10,11,16-19.

4 Analyse de la dynamique endocytose par reconnaissance Objectif

Reconnaissance objective permet la détection de la quasi-totalité des contreparties centrales imagées dans une cellule, mais peut être sujette à l'erreur due à la détection des rayonnements non essentiels des structures erronées. Voir discussion pour plus de détails pesant les avantages et les inconvénients de l'eméthode d'ach. Plusieurs programmes, y compris des algorithmes sur mesure, peuvent être utilisés pour détecter objectivement CCP. Ce protocole décrit reconnaissance objective des contreparties centrales utilisant Imaris, un logiciel d'analyse d'image (voir Matériaux).

  1. Pour commencer, ouvrez le fichier image brute dans le logiciel d'analyse d'image. Par défaut, une image couleur fusionné s'affiche. Utilisez la fenêtre "Réglage de l'affichage" pour régler la luminosité d'un canal. Cliquez sur le nom d'un canal pour changer la couleur affichée. Décochez la case à côté du canal pour empêcher son affichage (voir la figure 4A).
  2. Créer des «spots» en cliquant sur l'icône avec des taches orange. Voir la Figure 4B. Choisissez une région d'intérêt (ROI) autour de la cellule. Voir la figure 4C. Utilisez un retour sur investissement à exclure les zones qui seront mal détecter les bords d'attaque et de plaques lumineuses. Analyser plusieurs cellules avec différents niveaux séparément d'expression.
  3. Mesurer le diamètre d'un spot à ProviDe premières estimations pour l'algorithme. Passez en mode "Slice", et cliquez sur les extrémités polaires d'un endroit pour mesurer le diamètre. Voir la figure 4E. Pour ce faire, pendant 4 ou 5 taches rondes qui ressemblent indicatif d'une contrepartie centrale à la hauteur de sa stabilité, après la formation et avant la scission. Utilisez ces mesures pour calculer le diamètre moyen jusqu'à la dixième de micron.
  4. Détecter les points. Retour au mode "surpasser". Sélectionnez le canal approprié pour la détection. Entrez le diamètre moyen mesuré, généralement 0,3 ou 0,4 um. Cliquez sur la flèche bleue vers l'avant pour quantifier les taches. Voir la figure 4E. Si le diamètre des taches est sous-estimée, les points parasites de fluorescence seront considérés comme des points. Si le diamètre est trop grand, les vrais spots seront ignorés. En cas de doute, estimer un peu plus bas, et filtrer les détections incorrectes ultérieurement.
  5. Filtre Spots par la qualité. Réglez le filtre de capturer autant de points que possible sans retoursol. Le filtre de qualité est sélectionné par défaut 20. Voir la figure 4F.
    1. Utilisez la courbe «qualité» comme guide pour définir un seuil approprié. Déplacez le seuil bas du filtre avec le bouton gauche de la souris pour ce premier plongeon dans la courbe. C'est un bon point de départ pour le filtre, comme cette position affine généralement la détection de taches visibles seulement. Voir la figure 4F.
    2. Spots détectés apparaissent sur le film sous forme de sphères ou de pixels centraux. Utilisation de l'onglet "Couleurs", régler la couleur des taches de couleur contrastante pour le rendre plus facile de les voir. Faites défiler le film d'examiner les points dans chaque trame. L'objectif est de détecter le plus de points que possible pour l'ensemble de leur durée de vie.
    3. Éliminer les taches de gradation ou manuellement les connecter en pistes continues plus tard, car ils ne sont pas bien détectés par le cours de leur vie.
    4. Retirer des plaques lumineuses avec une "intensité" filter, si nécessaire. Cliquez sur le signe plus vert pour ajouter un nouveau filtre. Voir la figure 4F. Créer un filtre d'intensité de filtrer ou à taches d'un des signaux de fluorescence donnés. Utilisez la courbe générée intensité, (analogue à la qualité Curve discuté en 4.5) pour définir le seuil. Utilisez le bouton gauche de la souris pour enlever l'extrémité gauche de la courbe qui représente les points brillants.
      REMARQUE: Les grandes structures de la plaque sont généralement parmi les éléments les plus brillants de la cellule, et ils sont facilement exclus de ce filtre.
    5. Faites défiler le film de veiller à ce que les contreparties centrales sont détectés comme des taches et les plaques brillantes ne sont plus détectés. Figure 3D montre une cellule où la détection des contreparties centrales (notée sphères blanches) a été optimisé avec le filtre de la qualité et des plaques ont été exclus de la qualité filtre.
    6. Réduire les bords de cellules lumineuses avec le filtre de qualité. Objets brillants peuvent encore être supprimés manuellement, à l'étape suivante. Continuer avec le bleuflèche.
    7. Enlever les taches aberrantes dans l'écran Modifier Spots. Passez à "Sélection" en mode. Cliquez sur le champ. Il devient jaune. Cliquez sur "Supprimer". Cliquez sur la flèche bleue pour continuer la construction de l'algorithme. Voir Figure 4G.
  6. pistes de mesure. Réglez les pistes de "mouvement brownien." Le PCC doit pas présenter de mouvement dirigé, ne dérive minimale à travers la membrane plasmique. Cet algorithme est le plus approprié pour cette motion. Voir la Figure 4H.
    1. Réglez la Distance maximale à une petite valeur telle que 0,7 um. Voir la Figure 4H.
      REMARQUE: Le réglage sur une petite distance minimise connexion des taches adjacentes et permet encore pour le suivi continu d'un point de cellule par CCP ou le mouvement des cellules.
    2. Réglez Max Gap Taille à 1 Ceci permet une bonne voie pour continuer s'il n'y a qu'une seule trame manquante dans la succession. Cliquez sur la flèche bleue pour calculer pistes. Voir la Figure 4H.
      REMARQUE: Gtailles ap de plus de 3 causes différentes pistes à mal reliés entre eux.
    3. piste de commutation écoute de "Dragon Tail". Faites défiler le film en observant la qualité de détection. Si les points adjacents sont connectés, diminuer le Max Distance inférieure à 0,7 um. Si les points sont divisés trop facilement, augmentez la taille maximale Gap. Cliquez sur la flèche bleue pour créer des pistes. Cela conduit à l'écran des plages de filtration. Voir la Figure 4H.
  7. Pistes de filtrage et d'exportation de données. Utilisez une "intensité" filtre pour éliminer les plaques lumineuses supplémentaires. Utilisez un filtre "Déplacement" pour supprimer les endosomes qui entrent dans le champ de la FRBR. Faites preuve de prudence, car plus les points auront plus de déplacements ainsi. Cliquez sur la double flèche verte pour compléter le protocole. Voir la figure 4E.
    1. Utilisez l'onglet Modifier Tracks, avec l'icône de crayon, de supprimer les détections faussement positives de chansons qui ne peuvent être éliminés par des filtres. Vérifiez discontinuities ou de fausses connexions. Pour relier deux pistes, sélectionnez-les en appuyant sur Ctrl-clic gauche, puis cliquez sur "Connect" dans la boîte d'édition des pistes. Pour déconnecter pistes en taches distinctes, sélectionnez une piste et cliquez sur "Déconnecter". Sélectionnez plusieurs points avec Ctrl + clic gauche et cliquez sur "Connect" pour créer une nouvelle piste. La méthode est la même pour les taches Edition, décrits dans 4.5.7. Voir Figure 4J.
    2. Pour exporter les données, cliquez sur l'onglet Statistiques. Cliquez sur l'icône unique de disquette pour exporter la statistique sélectionnée. Cliquez sur l'icône qui ressemble à une série de disquettes d'exporter toutes les statistiques. Le "Track Durée" statistique contient la longueur des pistes d'endocytose. Voir Figure 4K.

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Résultats

En utilisant des cellules vivantes microscopie TIRF nous avons enregistré la dynamique d'endocytose de la μ-récepteurs opioïdes (MOR), un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) et son endocytose protéine adaptatrice β-arrestine. La construction β-arrestine été transfecté de manière transitoire dans une lignée cellulaire exprimant de manière stable MOR en utilisant le protocole présenté sur la figure 1, et 96 heures plus tard imagée. Le MOR dans la lignée cellulaire stable est le N-terminale marquée ave...

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Discussion

Nous décrivons ici l'utilisation de TIRFM de visualiser endocytose clathrine (CME) au niveau de l'individu CCP dans les cellules vivantes en temps réel. CME est un événement rapide et très dynamique induite par l'effet cumulatif de plusieurs spatialement et temporellement séparées épreuves individuelles. La plupart des tests qui sont actuellement utilisés, tels que les mesures biochimiques de l'internalisation en utilisant biotinylation de surface ou de liaison ligand, la cytométrie de flux ou des cellul...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les Drs C. Szalinski, H. Teng et M. Bruchez pour leur aide avec Imaris, R. Vistein et D. Shiwarski pour leur aide et leurs conseils techniques, ainsi que le Dr M von Zastrow, le Dr T Kirchhausen, le Dr D Drubin et le Dr W Almers pour les réactifs et la discussion utile. Le financement fourni par la subvention T32 NS007433 à SLB et NIH DA024698 et DA036086 à MAP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM/High Glucose avec L-glutamine et pyruvate de sodiumFisher Scientific  ;
Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), sans calcium, sans magnésiumGibco, par Life Technologies21600-010
Acide libre EDTAAmresco0322-500G
Sérum de veau fœtalGibco, par Life Technologies10437-028
Milieu L-15 de Leibovitz, sans rouge de phénolGibco, par Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, par Life Technologies
HEPESCellPURE par Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Réactif de transfection
25 mmCoverglass Fisher Scientific12-545-86
Fioles traitées pour culture cellulaire Corning, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Culture cellulaire à plaque 6 puitsGreiner Bio-One, par VWR82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG[
D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sel d’acétate d’enképhaline (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling KitLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Logiciel d’analyse d’imagesBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, pour l’analyse automatisée
Microscope inversé Nikon Eclipse Ti et accessoires nécessaires, y compris les cubes de filtre et les filtresNikon
Nikon TIRF bras avec adaptateurs nécessaires pour Nikon Eclipse TiNikonPour le réglage de l’angle d’incidence
Appareil photo iXon+ EMCCD et adaptateursAndor
SH3024301

Références

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