Research Article
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La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.
Une large gamme de méthodes sont actuellement disponibles pour la détermination de la constante de dissociation entre une protéine et l'interaction des petites molécules. Cependant, la plupart d'entre eux nécessitent l'accès à des équipements spécialisés, et ont souvent besoin d'un degré d'expertise d'établir efficacement des expériences fiables et analyser les données. Fluorimétrie à balayage différentiel (CSD) est de plus en plus utilisée comme une méthode robuste pour le criblage initial de protéines de petites molécules de l'interaction, soit pour l'identification de partenaires de découverte physiologiques ou de toucher. Cette technique présente l'avantage qu'il suffit d'une machine appropriée pour la PCR quantitative PCR, et si approprié instrumentation est disponible dans la plupart des institutions; une excellente gamme de protocoles sont déjà disponibles; et il existe de fortes précédents dans la littérature pour de multiples utilisations du procédé. Les travaux antérieurs a proposé plusieurs moyens de calculer les constantes de dissociation à partir des données de DSF, mais ceux-ci sont mathématiquement exigeant. Ici, nous DEMtrent un procédé d'estimation des constantes de dissociation à partir d'une quantité modérée de DSF des données expérimentales. Ces données peuvent généralement être recueillies et analysées en une seule journée. Nous démontrons comment les différents modèles peuvent être utilisés pour ajuster les données recueillies à partir des événements de liaison simples, et où les sites de liaison ou indépendants de liaison de coopération sommes présents. Enfin, nous présentons un exemple d'analyse de données dans le cas où les modèles standard ne s'appliquent pas. Ces méthodes sont illustrées avec les données recueillies sur les protéines de contrôle disponibles dans le commerce, et deux protéines de notre programme de recherche. Dans l'ensemble, notre méthode fournit un moyen simple pour les chercheurs d'acquérir rapidement d'autres renseignements sur les interactions protéine-ligand à l'aide de DSF.
Toutes les protéines se lient avec des affinités variables, à un large éventail d'autres molécules de simples ions à d'autres grandes macromolécules. Dans de nombreux cas, les protéines se lient à des petites molécules partenaires dans le cadre de leur fonction normale (par exemple, une kinase de liaison à l'ATP). Autres interactions peuvent être sans rapport avec la fonction, mais sont expérimentalement utiles comme outils (par exemple, les petites molécules qui stabilisent les protéines pour améliorer la réussite de cristallisation, ou aider à maintenir les protéines en solution); tandis que les petites molécules qui se lient à des sites actifs et les sites allostériques des protéines peuvent agir comme des inhibiteurs, et ainsi de moduler l'activité des enzymes.
Il existe une grande variété de techniques qui peuvent être utilisées pour déterminer l'affinité pour les molécules de protéines partenaires. Calorimétrie de titration isotherme 1 est largement considéré comme un "étalon-or", car il fournit des informations riches sur les réactions, est le marqueur libre, et a limité les possibilités pour unertifacts de l'expérience. Cependant, malgré des améliorations récentes dans la sensibilité de l'instrumentation et de l'automatisation de montage expérimental, il est encore relativement coûteux en termes de besoins en protéines, a au mieux un débit faible à moyen, et est le mieux adapté aux interactions avec modéré à affinités élevées (10 nM à 100 pM Kd) 2. D'autres méthodes étiquettes libres, tels que la résonance des plasmons de surface ou bicouche interférométrie 3 offre des débits plus élevés, et ont réalisé la sensibilité pour détecter des molécules plus petites aussi faibles que 100 Da. Toutefois, les instruments à haut débit pour ces méthodes sont relativement coûteux, sont justifiées que si il y aura un débit continu de projets pertinents, et sont donc susceptibles d'être inaccessibles à de nombreux laboratoires universitaires.
Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF ou thermofluor) a été décrite pour la première fois en 2001 en tant que méthode 4 pour la découverte de médicaments. Dans cette méthod, les protéines sont incubées avec un colorant fluorescent (colorants initialement naphtalène-sulfonique ont été utilisés), ce qui modifie sa fluorescence lors de la liaison à des régions hydrophobes des protéines. L'échantillon de protéine-colorant est ensuite chauffé, et la fluorescence contrôlée comme la chaleur monte. Le dépliement de la protéine, et l'exposition des parties hydrophobes de la protéine, donne naissance à un motif caractéristique de la fluorescence en fonction de la température (Figure 1A). L'essai peut être réalisé en de petites quantités dans un instrument PCR quantitative commerciale, et donc en une seule expérience, un grand nombre d'échantillons peuvent être testés en même temps (habituellement 48, 96 ou 384 échantillons, en fonction du modèle de l'instrument). Des expériences peuvent être effectuées habituellement en environ une heure, offrant la possibilité d'une analyse à haut débit de 5 échantillons.
D'autres améliorations de la méthodologie ont vu l'adoption de colorants avec de meilleures propriétés spectrales 6,7 8,9. La gamme des applications de la méthode a été étendue, avec un accent particulier sur la création de conditions optimales pour la préparation et le stockage des protéines 10, et sur l'identification de partenaires potentiels de liaison pour faciliter la cristallisation 11. Le débit relativement élevé de la méthode, un coût relativement faible en protéines (~ 2 pg par réaction), et l'applicabilité à l'étude de la faiblesse des molécules de liaison a fait DSF un outil précieux pour le fragment basé la conception de médicaments, en particulier dans un contexte académique 12-14.
Malgré la large application de DSF à l'étude des interactions protéine-ligand, peu d'études ont décrit la détermination des constantes de dissociation de ces études. Toutefois, ceux-ci ont tendance à produire des équations détaillées décrivant le déroulement de la protéine, avec de nombreux paramètres qui doivent être montés sur des données éparses ou dans certains cas, estimated 7,15-17. Ces méthodes sont d'une importance particulière dans les cas difficiles, tels que les composés fortement contraignants, ou des protéines présentant des transitions inhabituelles. Cependant, pour de nombreux laboratoires, ces analyses détaillées sont trop lourdes pour une utilisation courante. Nous proposons donc des traitements alternatifs pour les différents scénarios, et montrons comment elles peuvent être utilisées pour ajuster les données résultant de différentes interactions protéine-ligand. Notre méthode utilise l'instrument StepOne qPCR, pour lequel le logiciel d'analyse de données sur mesure est disponible; tout ce qui accélère l'analyse des données, les résultats d'autres instruments peuvent être traitées en utilisant des procédés publiés antérieurement neuf, et en aval à la même analyse peut être effectuée.
1 Détermination d'une valeur approximative de la constante de dissociation (c'est à dire, à moins d'un ordre de grandeur)
2. expérimental pour la détermination de la constante de dissociation
3 Analyse des données pour déterminer la constante de dissociation sous dénaturation thermique
4. adaptation de données à des modèles de coopération
Pour ajuster les données à un modèle coopératif, choisir entre un modèle coopératif simple, ou un modèle où deux constantes de dissociation distincts sont définis. La première approche est préférable dans le cas de coopérativité négative, ou comme une enquête initiale. Toutefois, en principe, il est préférable dans les cas de coopération positive pour modéliser deux dissociation des constantes 18. Dans ce cas, la modélisation peut procéder soit en supposant liaison séquentielle de ligands, ou indépendant de liaison des ligands.
5. adaptation de données à des courbes montrant Changements binaires dans Température de fusion
De temps en temps, au lieu d'une réponse graduée de ligand, les protéines ont étéobservé à adopter une réponse binaire, où l'échantillon est clairement lié séparé de l'échantillon non lié. Un exemple est fourni dans les résultats représentatifs (figure 4). Dans ce cas, l'ajustement de la température de fusion ne fournira pas un bon ajustement pour K d.
Un excellent substrat de test de cette méthode est l'hexokinase. Ceci présente l'avantage d'être facilement disponibles dans le commerce, et ayant deux substrats que l'on trouve dans la plupart des laboratoires, et qui fournissent des résultats reproductibles, claires dans l'essai. Un écran de concentration initiale (protocole 1), en utilisant l'hexokinase et de glucose (figure 2A), suggère que le K d sera probablement dans la gamme de 0,2 à 1,7 mm. Par conséquent, un plus grand écran (protocole n ° 2) a été réalisée en utilisant les concentrations indiquées dans le tableau 4 Les résultats (figure 2B) montrent un bon ajustement à l'équation de liaison du ligand à un seul site (section Protocole 3.3) [9], et a donné un K d de 1,2 ± 0,1 mM.
Le putatif heptose guanyl-transférase WCBM 19,20 montre une forte dérive thermique de la liaison de GTP (figure 3A). Un écran initial suggéré que le Kd est dans l'intervalle d'environ 100 pM. Par conséquent, un grand écran a été mis en place, en utilisant les concentrations indiquées dans le tableau 5 Montage des résultats à l'équation 3.3 a montré un ajustement raisonnable (R 2 de 0,981; figure 3B). .Toutefois, Il ya une différence évidente entre les données et la modèle, ce qui suggère que d'une équation différente est nécessaire. La recherche de la banque de données de protéines 21 avec la séquence WCBM montré que les homologues les plus proches pour lesquels les structures ont été déterminées forment des dimères. Les données ont donc été analysées en utilisant les trois équations de coopérative, séquentielle, et indépendant de liaison de deux ligands (protocole n ° 4). Les statistiques de montage pour un modèle coopératif a donné une valeur R 2 de 0,998 et l'écart type des résidus (Sy.x) de 0,215, tandis que les deux modèles de fixations successives et indépendantes ont une valeur R 2 de 0,992 et une Sy.x de 0,480 et 0,461 respectivement. Ceci suggère que le modèledonne le meilleur ajustement aux données a été le modèle coopératif: ici, un K ½ de 230 ± 10 pM a été observée, avec une valeur de n de 0,52 ± 0,02 (figure 3C). Ceci indique une coopérativité négative à la liaison. Notez qu'une ½ K a été utilisé dans ce cas, plutôt que de Kd, comme les unités de K d seraient plutôt insatisfaisante la uM 0,52.
Le PIB-6-désoxy-β-D-manno putatif -heptopyranose 2 O -acetylase, WcbI 22, montre un résultat plutôt inhabituel dans différentielle à balayage fluorimétrie. En l'absence de ligands, il montre une dénaturation clair et simple (figure 4A). Coenzyme A (CoA) a été identifié comme un ligand de cette protéine en utilisant DSF, et l'affinité de la protéine pour ce partenaire a été étudiée de la manière décrite dans le protocole. En présence de concentrations élevées de CoA, une forte shift à une température plus élevée est observée, avec un changement de la température de fusion de 15 ° C. Cependant, à des concentrations intermédiaires, plutôt que d'un passage à une fusion monophasique à une température de fusion intermédiaire, WcbI montré une fusion à deux phases, avec la protéine apparaissant à l'état fondu à une ou l'autre de la température de droits ligand, ou la température de fusion entièrement lié (figure 4A) . Les proportions des deux espèces modifiées d'une manière dépendante de la dose, avec des concentrations croissantes de substrat augmentant la proportion qui fond à une température plus élevée (figure 4B). L'analyse directe de ces données a été difficile: le montage de l'équation de Boltzmann a donné, elle s'adapte très pauvres, tandis que les méthodes dérivés mis en évidence que deux événements de fusion se produisaient, mais n'ont pas aidé à démontrer un changement avec l'augmentation de la concentration de ligand.
Une approche moins conventionnelle pour analyser ces données a donc été adopté (protocole n ° 5). La fluorescence drésultats erivative sans ligand et à la concentration de ligand plus ont été prises comme représentant la quasi-totalité des protéines de la température de fusion plus bas, ou l'état de la température de fusion plus élevé. Les données dérivés restants ont été installés à chaque point comme la somme d'une partie de chacun de ces deux Etats, la proportion a résumé à l'unité (figure 4C). Les données obtenues ont ensuite été montés comme précédemment pour obtenir un Kd apparent, en utilisant les mêmes équations que précédemment. Cela a fait ressortir que le point de ligand "haute" est susceptible d'être seulement 95% ligand lié. Les données ont été ensuite extrapolés à une prédiction du résultat pour une protéine liée de 100%, et les données raccord répétées pour donner un Kd apparent de 58 ± 2 uM. Cela a donné un excellent ajustement des résultats expérimentaux pour le modèle de liaison (figure 4D).
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Figure 1: Exemples de configuration du test et de l'analyse. (A) Exemple de la forme attendue d'un profil de dénaturation thermique (pris à partir de données de l'hexokinase de levure). La forme caractéristique des données brutes montre une augmentation progressive de la fluorescence au maximum, suivie d'une baisse peu profond (discuté plus en détail en 9). Ceci est accompagné par un seul pic dans la dérivée première de la fluorescence (B). Exemple de saisie de données dans Graphpad. concentration de ligand est indiquée sur l'axe des X, et observer les températures de fusion sur l'axe des ordonnées (C). Exemple de définition de l'équation dans Graphpad. (D) Exemples de mise correctement les valeurs initiales des variables et de la fixation de la concentration de protéine, afin de permettre une détermination correcte de la constante de dissociation.m / fichiers / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2 l'interaction de l'hexokinase de glucose mesuré par analyse différentielle fluorimétrie (A) Une expérience initiale tester une large gamme de concentrations en glucose suggère que le Kd est susceptible d'être comprise dans l'intervalle de 0,2 -. 1,7 mM (B) Un détaillée expérience, tester 16 concentrations de glucose, permet de déterminer le Kd apparent que 1,12 ± 0,05 mM. Les données s'adapte très bien au modèle pour un seul cas de liaison (avec le fond (T1) et supérieure (T2) des températures raccord à 35,4 ± 0,2 ° C et 49,3 ± 0,5 ° C respectivement). Noter queces données ont été recueillies en présence de 10 mM MgCl 2. Ces images ont été préparés en utilisant GraphPad. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Interaction de WCBM avec GTP révèle une liaison anti-coopérative. (A) Une expérience initiale tester une large gamme de concentrations de GTP suggère que le Kd est susceptible d'être dans la plage de 200 -. 500 uM (B) Une expérience détaillée, en testant 16 les concentrations de GTP, indique une valeur pour le ressort Kd de 120 ± 20 pM. Cependant, quand une échelle logarithmique est utilisée pour l'axe des abscisses, il est important discrétionpation entre le modèle et les données. (C) L'analyse des mêmes données avec un modèle coopératif représente un excellent ajustement aux données où le modèle coopératif simple est utilisé. Ici, un K ½ de 230 ± 20 pM a été déterminée, le coefficient de coopérativité de n = 0,52 ± 0,02 (avec le fond (T1) et supérieure (T2) à des températures de montage 69,63 ± 0,06 ° C et 79,9 ± 0,1 ° C, respectivement). Comme WCBM semble être dimère, ce qui implique que l'enzyme est parfaitement anticooperative dans sa liaison au GTP. Ces images ont été préparés en utilisant GraphPad. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4 montre un schéma WcbI de fusion biphasiqueen présence de son ligand coenzyme A (CoA). (A) WcbI, en l'absence de ligand (bleu), représente un motif de fusion monophasique simple. À des concentrations élevées de ligand (1 mM; ligne verte), une tendance similaire est observée. Cependant, à des concentrations de ligand intermédiaire. (60 uM; ligne rouge), deux pics de fusion distincts, correspondant à des états de libre-ligand et un ligand lié sont observés (B) La transition entre les deux séries de pics est proportionnelle à la dose sur toute la gamme de concentrations. (C) Modélisation de la fusion biphasique comme la somme d'une partie des ligands résultats ligand libre et de haute donne un bon ajustement aux données (ligne violette en pointillés, par rapport à la ligne rouge). Cette coupe est améliorée en extrapolant le résultat observé pour une forte concentration de ligand (où le modèle suggère ~ 95% d'occupation) à la pleine occupation (ligne pointillée bleue). (D) Les données obtenues pour la proportion de WcbI lié à CoA sho ws un excellent ajustement à un modèle de liaison simple, avec un Kd de 58 ± 2 pM (les données représentent les données recueillies sur deux jours différents, avec des concentrations de ligand légèrement différentes, choisies pour le deuxième jour sur la base du premier ensemble de résultats). Panneaux. (A - C) ont été préparés en utilisant Excel, et le panneau (D) à l'aide de Graphpad S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1 Recette pour les premières expériences.
| Réactif | Volume en mélange (pl) |
| Protéine | Pour une concentration finale de 0,11 mg / ml |
| 0,3 | |
| HEPES 0,5 M pH 7,0 | 3.7 |
| 5 M de NaCl | 5.6 |
| Eau | Pour 180 ul |
Il décrit le "master mix" de protéines, réactif de détection et de tampon pour une expérience de dépistage initial de fournir une estimation de K d, tel que décrit dans la section du protocole 1 Ce mélange tampon est appropriée pour des protéines génériques. Lorsque les résultats précédents suggèrent d'autres tampons doivent être utilisés, ils devraient être remplacés. Si la protéine stock est à une faible concentration (par exemple, moins de 0,3 mg / ml), il peut être nécessaire de réduire la quantité de tampon supplémentaire ajouté au tampon pour compenser une présence dans l'échantillon de protéine.
Tableau 2 Recette pour la détermination de K d.| Réactif | Volume en mélange (pl) |
| Protéine | Pour une concentration finale de 0,11 mg / ml |
| 5,000X SYPRO orange | 1,78 |
| HEPES 0,5 M pH 7,0 | 22.2 |
| 5 M de NaCl | 33,3 |
| Eau | Pour 180 ul |
Il décrit le "master mix" de protéines, réactif de détection, et buffer pour une détermination complète de K d pour un échantillon de protéine, tel que décrit dans la section 2 du protocole Ce mélange tampon est appropriée pour des protéines génériques. Lorsque les résultats précédents suggèrent d'autres tampons doivent être utilisés, ils devraient être remplacés. Si la protéine stock est à une faible concentration (par exemple, moins de 0,3 mg / ml), il peut être nécessaire de réduire la quantité de tampon supplémentaire ajouté au tampon pour compenser une présence dans l'échantillon de protéine.
Tableau 3 équations et des paramètres d'analyse des données.
| Étape dans le protocole expérimental | Équation nécessaire | Paramètres nécessaires | Description des variables et des paramètres |
| 3.3 | </ Td> | ||
| Seul site de liaison du ligand | Y = Bas + ((Haut-Bas) * (1 - ((PK-X d + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P: concentration en protéine. Kd: constante de dissociation. P et Kd sont donnés dans les mêmes unités qui ont été utilisées pour les concentrations de ligand. Haut, Bas: des températures de fusion à une concentration de ligand infinie et aucune concentration de ligand respectivement. | |
| 3.4 | Bas = * YMIN | YMIN: valeur minimum de Y (plus bas protéine expérimentale Tm, dans ce cas) | |
| Haut = * YMAX | YMAX: valeur maximale de Y (le plus élevé de protéines expérimental Tm)|||
| K d = * X à ymid | Ymid: valeur de Y qui correspond à la moyenne de YMIN et YMAX. X est la valeur correspondant à X (ici, la concentration de ligand pertinent) | ||
| P = (valeur initiale, pour être en forme) | |||
| 4.1 | |||
| Modèle coopératif simple | Y = Bas + ((Haut-Bas) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) | n: Hmauvais coefficient. Ceci décrit la coopérativité, ou d'autres propriétés biochimiques de la protéine, et n'est pas nécessairement une estimation du nombre de sites de liaison de ligand dans la protéine. Un coefficient de Hill de l'un représente pas coopérativité; des valeurs inférieures à un indiquent coopérativité négative, et les valeurs supérieures à un coopérativité positive. | |
| Bas = * YMIN | |||
| Haut = * YMAX | |||
| K d = * X à ymid | |||
| P = (valeur initiale, pour être en forme ) | |||
| n = (valeur initiale, pour être en forme) | |||
| Séquentiel de liaison de deux ligands | Y = Bas + ((Haut-Bas) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2))) ) | K2: constante pour la deuxième événement de liaison dissociation. | |
| Bas = * YMIN | |||
| Haut = * YMAX | |||
| dth: 123px; "> K d = * X à ymid | |||
| K2 = * X à ymid | |||
| P = (valeur initiale, pour être en forme) | |||
| Indépendant et contraignant de deux ligands | Y = Bas + ((Haut-Bas) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (2 * X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2) ))) | ||
| Bas = * YMIN | |||
| h: 123px; "> Haut = * YMAX | |||
| K d = * X à ymid | |||
| K2 = * X à ymid | |||
| P = (valeur initiale, pour être en forme) | |||
| 5.5 | |||
| Analyse des changements binaires de la température de fusion | Y = 1 - ((PK-X d + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px; ">||
| Bas = * YMIN | |||
| Haut = * YMAX | |||
| K d = * X à ymid | |||
| P = (valeur initiale, pour être en forme) | |||
| 5.8 | |||
| L'extrapolation à la concentration de ligand infini | (C2 - ((1 $ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: cellule contenant le résultat sans ligand. C2: cellule contenant le résultat avec le ligand maximale. $ R $ 2: cellule contenant la proportion liée à la concentration de ligand maximale. |
Les étapes 3, 4 et 5 nécessitent l'ajout d'équations détaillées dans le logiciel d'analyse et de définition précise des paramètres de départ pour l'analyse des données. Les équations pour chaque étape pertinente sont présentés, avec les sélections correctes des paramètres. Une explication de la signification des variables et des paramètres est fourni à titre de référence.
Tableau 4: Concentrations pour le dépistage de l'interaction de l'hexokinase avec du glucose.
| point de l'échantillon | Ligand (glucose) la concentration (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0,001 |
| 3 | 0,005 |
| 4 | 0,01 |
| 5 | 0,03 |
| 6 | 0,1 |
| 7 | 0,3 |
| 8 | 0,4 |
| 9 | 0,7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
L'hexokinase de la bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae de la levure a été ajoutée au mélange maître tel que décrit dans le protocole, additionné de 10 mM de MgCl2 en tant que magnésium est un cofacteur connu. L'estimation initiale de la valeur de Kd était entre 0,5 et 2 mM. Les expériences ont été mises en place pour fournir des concentrations finales indiquées de glucose.
Tableau 5: Concentrations pour le dépistage de l'interaction de WCBM PIB.
| point de l'échantillon | Ligand (GTP) concentration (M) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0,5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px; "> 500|
| 11 | 1000 |
| 12 | 2500 |
| 13 | 5000 |
| 14 | 7500 |
| 15 | 10000 |
| 16 | 20000 |
WCBM de Burkholderia pseudomallei a été ajouté au mélange maître tel que décrit dans le protocole. L'estimation initiale de la valeur de Kd est d'environ 100 pM. Des expériences ont été mis en place pour obtenir les concentrations finales indiquées de GTP, visant à couvrir au moins deux ordres de grandeur ci-dessus et ci-dessous K d.
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.
La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.
Ce travail a été financé par une subvention du BBSRC (numéro de subvention BB/H019685/1 et BB/E527663/1) à l’Université d’Exeter.
| L’instrument de PCR en temps réel StepOne | Life Technologies | 4376357 | DSF peut être réalisé avec de nombreux autres instruments. L’instrument StepOne dispose d’un logiciel très pratique pour l’analyse des données. |
| Logiciel de décalage thermique protéique v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| Plaques optiques 48 puits MicroAmp Fast | Life Technologies | 4375816 | |
| Ruban d’étanchéité optique ; | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad n° de pièce 223-9444 est un fournisseur alternatif |
| Plaques à fond en U à 96 puits | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | Pour un fournisseur de plus petit volume, utilisez la référence Sigma n° S5692 |
| Statistiques SPSS version 20 | IBM | D’autres progiciels de statistiques fourniront des fonctionnalités similaires | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | D’autres progiciels de statistiques offrent des fonctionnalités similaires | |
| Applicateur manuel (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase de Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher | 10141520 | scientifique |
