Article de méthode

Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

DOI :

10.3791/51824

⸱

5 septembre 2014

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Dans cet article

Résumé

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Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer polype morphologie et la structure des tissus dans le coraux des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Fluorescence, le visage de bloc série, et à deux photons laser microscopie confocale à balayage ont identifié la structure lobée, murs de polype, et chromatophores estimée et la densité de zooxanthelles et des distributions.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer le (3D) morphologie tridimensionnelle et la structure cellulaire des tissus des polypes comprenant l'coraux constructeurs de récifs des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Ces approches comprennent la microscopie à fluorescence (FM), le bloc de série visage imagerie (SBFI), et à deux photons laser microscopie confocale à balayage (TPLSM). SBFI fournit des images des tissus profonds après sectionnement physique; Il détaille la texture de surface de tissu et visualisation 3D pour des profondeurs du tissu de plus de 2 mm. FM complémentaire et de rendement de TPLSM images de très haute résolution de la structure cellulaire des tissus. Les résultats ont: (1) identifier les morphologies de tissus lobés non signalés précédemment sur ​​la paroi extérieure de polypes coralliens individuels et (2) a créé les premières cartes de la surface de la densité de la distribution et du tissu 3D de chromatophores et endosymbiontes dinoflagellés zooxanthelles algues comme. Pois d'absorption spectraleks de 500 nm et 675 nm, respectivement, indiquent que M. annularis et M. faveolata contient types de chlorophylle et de chromatophores similaires. Toutefois, M. annularis et M. faveolata présentent des différences significatives dans la densité et la distribution de tissu 3D de ces composants cellulaires essentiels. Cette étude portant sur les méthodes d'imagerie indique que SBFI est extrêmement utile pour l'analyse de grands échantillons mm échelle de tissus coralliens décalcifier. FM gratuit et TPLSM révèlent de subtiles changements d'échelle submillimétrique de la distribution et de la densité cellulaire dans des échantillons de tissus de corail nondecalcified. La technique permet de TPLSM: (1) préparation de l'échantillon à effraction minimale, (2) de capacité supérieure sectionnement optique, et (3) l'absorption de la lumière et de diffusion minimale, tout en permettant l'imagerie des tissus profonds.

Introduction

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Le réchauffement climatique et les changements environnementaux accompagnement affectent directement la santé et la distribution des coraux marins tropicaux 1-4. Impacts multiples sont observés, y compris le blanchiment des coraux et l'émergence de maladies infectieuses 5-6. Toutefois, une prévision plus précise de la future réponse de corail à ces menaces environnementales, il faudra qu'une "ligne de base" histologique être établi, qui définit la morphologie des tissus et de la composition de la cellule et de la distribution pour les coraux "apparemment en bonne santé". À son tour, "touchés" coraux peuvent alors être comparés quantitativement. En outre, cette référence devrait être établi pour les coraux apparemment en bonne santé dans une variété de conditions environnementales, de sorte que «réaction saine» peut également être évaluée à travers des gradients environnementaux. Comme un premier pas vers l'établissement de cette base, une étude 3D à haute résolution a été réalisée de façon apparemment tissu polype corallienmorphologie et la composition cellulaire répond à l'augmentation de la profondeur de l'eau (WD) et des baisses d'accompagnement dans la lumière du soleil irradiance. Les résultats peuvent ensuite être utilisées pour établir une compréhension mécaniste plus complet de corail adaptation, ainsi que de mieux comprendre l'évolution de corail symbiote et l'amélioration de la récolte de la lumière.

Coraux durs (Scleractinia) sont coloniales animaux marins invertébrés qui accueillent un assemblage complexe d'autres microorganismes, appelés collectivement le corail holobiont 7-10. Les recherches menées dans la présente étude cherche à utiliser une suite de technologies d'imagerie de pointe pour suivre simultanément des changements avec l'augmentation de la profondeur de l'eau dans les pigments de tissus et de zooxanthelles symbiotiques des coraux d'accueil apparemment en bonne santé. Ceci permettra d'établir le tissu cellulaire comparative "de base" nécessaire dans un gradient bathymétrique des coraux apparemment en bonne santé et agissent comme des indicateurs de corail heaLTH 10. pigments coralliens, appelées chromatophores, agissent pour absorber, de réfléchir, la diffusion, la réfraction, la diffraction, ou interférer avec le rayonnement solaire incident 11. La relation endosymbiotique zooxanthelles-chromatophores a permis la coévolution de l'optimisation lumière de récolte stratégique avantageuse et des stratégies de croissance du squelette, ainsi que la plasticité trophique (stratégies d'alimentation déplacement de va-et-vient de autotrophie à Hétérotrophie) pour l'animal corail 12.

Les Caraïbes île nation sud de Curaçao (anciennement partie des Antilles néerlandaises) se trouve à environ 65 km au nord du Venezuela au sein de l'orientation est-ouest Aruba-La Blanquilla archipel (figure 1A). Le 70 km côte sud de Curaçao contient un ancien récif corallien frangeant partie continue moderne et Miocène-Pliocène-Pléistocène-Holocène 13,14. SST moyenne annuelle sur Curaçao varie d'environ 3 ° C unenuellement, allant d'un minimum de 26 ° C à la fin de Janvier jusqu'à un maximum de 29 ° C au début de Septembre, avec une température annuelle moyenne de 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST ensembles de données, 2000-2010). Le récif de corail à Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), située près de la pointe nord-ouest de Curaçao (figure 1A), a été choisi pour l'échantillonnage, car il a déjà été bien étudiée et la écosystème marin à cet endroit est baigné dans l'eau de mer non polluée frais 7,15-19. . Deux espèces de coraux scléractiniens étroitement liées, M. annularis et M faveolata, ont été choisis pour l'expérimentation et l'analyse dans cette étude parce que chaque espèce: (1) des expositions très différentes et ne se chevauchent pas distributions bathymétriques sur les voies de récif par rapport à la limite du plateau continental et la milieux sédimentaires carbonate sédimentaires associés (M. gamme annularis = 0-10 m WD, M. faveolatagamme = 10-20 m WD 20; figures 1B, 2A, et 2B); (2) est un corail cadre commun de récif constructeur tout au long de la mer des Caraïbes 21; et (3) est bien étudiée écologique, physiologique, et les relations d'évolution 22.

échantillonnage sur le terrain pour la présente étude a été réalisée en utilisant des techniques de plongée sous-marine au large de standards Playa Kalki à Curaçao. Un bathymétrique de l'eau peu profonde transect à profonde a été établi que traversait le plateau, sur le rebord du plateau, et dans les environnements récifaux antérieures en eau profonde. Apparemment, têtes de corail en bonne santé ont ensuite été identifiés pour l'échantillonnage le long de ce transect bathymétrique, y compris: (1) trois individuel ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. annularis, qui étaient tous à 5 m de profondeur d'eau (WD); et (2) trois individuels ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. faveolata, qui étaient tous à 12 m WD. Rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) a été mesurée comme 33-36% PAR à 5 m WD et 18-22% PAR à 10 m WD. L'échantillonnage a été effectué en Janvier lorsque la SST était de 26 ° C à des profondeurs d'eau de la 5 m et 12 m. Chacun de ces six têtes de corail a été échantillonné en triple exemplaire à des positions spatiales équivalentes (c'est à dire., Environ 45 ° de latitude nord sur chacune des six têtes de corail hémisphériques). Chaque échantillon se composait d'un diamètre de 2,5 cm corail biopsie de tissu-squelette qui a été recueilli avec un coup de poing de la voûte nettoyé. Trois biopsies de tissus-squelette de corail ont été échantillonnés sur la plongée sous-type avec des mains gantées de chacune des têtes de corail (9 de M. annularis colonies à 5 m WD et 9 de M. faveolata à 12 m WD). Immédiatement après la collecte de profondeur, chacune des carottes de biopsie a été placé dans un tube de polypropylene de 50 ml à centrifuger stérile, étanche vis-haut, et est retourné à la surface. L'eau de mer a été décantée à partir de chaque tube de centrifugeuse et chaque biopsie au trocart est ensuite immergé, stocké et transporté dans 4% de paraformaldéhyde.

imagerie SBFI a déjà été réalisée sur un large éventail d'échantillons biologiques, y compris l'ensemble du cerveau et tout-cardiaques tissus humains, des embryons de souris intactes, des embryons de poisson zèbre, et plusieurs types d'échantillons d'animaux avec des os intacts 23-30. La plupart de ces études utilisées microscopie optique / lumière soit avec fluorescence ou technique sur le terrain vives. Cependant, des études ont été menées à ultra-forts grossissements utilisant électronique à balayage bloc série visage imagerie dans le passé 31. Dans la présente étude, un protocole de SBFI modifié a été mis au point pour les coraux et appliqué pour la première fois. Parce que M. annularis et M. polypes coralliens faveolata sont 1-2 mm d'épaisseur, aucune des techniques de microscopie optique de routine serait capable de pénétrer toute l'épaisseur du tissu corail de polypes. Par conséquent, nous avons SBFI protocole de préparation des échantillons spécialement conçu pour les échantillons de corail. En outre, nous avons conçu sur mesure un porte-stéréoscopique, Qui est motorisé pour se déplacer dans les deux directions x et y. Cet appareil prend des images de la face du bloc de l'échantillon plutôt que de recueillir les sections à l'aide d'un microtome régulier devant le microscope. Nous avons également introduit une autre à deux photons technique de microscopie optique non linéaire à l'image les mêmes polypes coralliens dans toute l'épaisseur des tissus coralliens. Cette surmonte les limitations imposées par SBFI en termes de décalcification et la possibilité de changements dans la morphologie des tissus et le volume (rétrécissement) pouvant être induites par la préparation des échantillons (déshydratation) et les protocoles de traitement. En outre, les profils d'émission des coraux ont été résolues spectralement à identifier leurs émissions de pointe et les variations entre les chromatophores et les zooxanthelles photosynthétique. Ces résultats ont été évalués dans le contexte de la méthode utilisée et leurs avantages particuliers en ce qui concerne le temps d'acquisition, le temps d'analyse, et la capacité de résoudre des détails fins structurelles sans compromettre la strintégrité uctural du tissu corail.

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Protocole

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NOTE: Réactifs pour être préparés pour Serial Block Face imagerie des échantillons de corail

1. Preinfiltration Cire

  1. Faire fondre 3,6 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre. Mélangez bien sur une plaque chaude (60-70 ° C).
  2. Ajouter 400 mg de Soudan IV (pour minimiser la cire fond fluorescence). Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint.
  3. Ajouter 96 ml de la paraffine fondue chaude (100%) et bien mélanger.

1.2) Embedding Cire

  1. Faire fondre 7,2 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre et bien mélanger sur une plaque chaude (60-70 ° C).
  2. Ajouter 0,8 g du Soudan IV. Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint.
  3. Ajouter granulés de paraffine (162 g) et mélanger jusqu'à ce que la paraffine fond complètement.
  4. Ajouter 30 g de blanc granulaire Vybar et fondre complètement dans le même bécher; Une fois fondu, mélanger.
  5. Fermer sans serrer la bouteille en verre avec un couvercle. Placer le flacon en verre à 60 ° C une convection ovfr pour garder les ingrédients dans un état liquide. Effectuer toutes les infiltrations dans ce four.
  6. Diviser le volume total de 200 ml de la cire rouge dans deux flacons en verre de 100 ml chacune. Utilisez une aliquote pour l'infiltration et l'autre pour l'incorporation finale.

1.3) incorporation Coral tissus pour Serial Block Face Imaging

  1. Laver les polypes coralliens recueillies sur le terrain (SI vidéo 1) et stockées (3-6 mois à 4-5 ° C dans du paraformaldéhyde) dans un tampon phosphate salin (3x 5 min) et détartrer lorsque vous êtes prêt à imager. Détartrer les polypes en solution Excal pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les polypes sont totalement dépourvus de CaCO3. Incuber plusieurs polypes coralliens décalcifié comme un seul bloc dans une série 25, 50, 75, et 100% d'éthanol, suivie d'un substitut de xylène 1x à déshydrater les échantillons.
  2. Placez les polypes transformés dans un four préchauffé à 65 ° C four contenant 100% de substitut de xylène. Incuber pendant 30 min à deux reprises par Changing de solution fraîche. Orienter les polypes de telle manière que la partie supérieure des polypes orientée vers le bas et la surface supérieure est aussi plat que possible.
  3. Faire des solutions de 2: 1, 1: 1, et 1: 2 substitut de xylène et preinfiltration cire (étape 1.1) dans 50 ml tubes Falcon.
  4. Incuber polypes de corail avec ces trois concentrations croissantes de cire de preinfiltration, suivis par 3x incubation dans 100% de cire de preinfiltration pendant 30-60 minutes à chaque fois.
  5. Remarque: Selon l'épaisseur des échantillons, étapes 1.3.1-1.3.5 pourrait être augmenté avec de plus longues périodes.
  6. Déplacez les échantillons à l'intégration de la cire (voir l'étape 1.2.6) après incubation en 3x 100% cire de preinfiltration.
  7. Retirer la cire intégration après 30 min. Remplacer avec de la cire d'enrobage frais et continuer incubation pour un minimum de 4 heures à 65 ° C.

1.4) L'intégration dans Red Wax

  1. Photographier le bloc (la plaque en acier inoxydable où la cire blanche et est placé au-dessus de laquelle le sample est placé). Ceci est nécessaire parce que, une fois incorporé dans la cire, l'emplacement de l'échantillon devient invisible comme l'enrobage de cire rouge est opaque.
  2. Placez de petites gouttes de haut point de fusion de la cire autour de la nouvelle intégration moule en acier inoxydable préchauffé et laissez-le refroidir. Verser une petite quantité de cire fondue à partir de l'incorporation fraîchement second récipient comme indiqué à l'étape 1.2.6.
  3. Placez le polype vers le bas rapidement sur la cire point blanc, puis placez un porte-échantillon en plastique sur la plaque en acier inoxydable et verser de la cire plus plongement de sorte que la cire remonte à la surface du moule en plastique.
  4. Prenez toute la configuration de 65 ° C du four et laisser refroidir sur un banc ou une surface froide jusqu'à ce que la cire durcit complètement.
  5. Cela peut prendre 6 heures jusqu'au jour ou deux. Placez le bloc desséché dans un réfrigérateur à 4 ° C, à l'abri de la lumière, pour le stockage à long terme.

1.5) de sectionnement à la configuration Block Face série

  1. Trim le bloc et couper 1 um sections à l'aide d'un microtome. Ne pas recueillir les sections car elles deviendront comme de la poudre. Rappelez-vous, nous sommes imagerie que la face du bloc. L'échantillon apparaît lorsque la cire blanche commence à disparaître.
  2. Capturer des images de la face lisse du bloc qui contient l'échantillon chaque fois qu'un article est retiré. Continuez jusqu'à ce que le polype disparaît en SI Vidéo 2.
  3. Record / capture les images avec une caméra monochrome en utilisant un filtre fluorescent FITC pour ramasser l'auto-fluorescence de la chromatophores / corail polype. Image 3-4 noyaux décalcification de chaque espèce.

2. imagerie coraux de moins de deux photons microscopie de fluorescence

  1. Fixer des noyaux de polypes coralliens, contenant chacune environ 10-12 polypes environ un pouce de diamètre, à 4% de paraformaldéhyde sur le site de collecte (rivage) dès qu'ils sont récoltés sous l'eau.
  2. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. Noyaux lavés sont placés dans ee même solution à l'envers dans un plat à fond de verre de couverture (0,17 mm d'épaisseur).
  3. L'utilisation d'un laser à deux photons à 780 nm excitation, l'image 3-4 polypes à deux agrandissements différents (zoom numérique) en utilisant un (NA 0,3) objectif 10X. La forme de polype et la hauteur varie entre les échantillons (généralement 1-2 mm) et la profondeur d'imagerie est également limité par la distance de travail de l'objectif d'imagerie.
  4. Utilisez le mode de balayage de tuile de recueillir environ 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 carreaux) images par plan focal en xy et 50-100 des images par le biais de l'axe z à intervalle de 10 ou 20 um, totalisant environ 5.000-10.000 images / polype.
  5. Image en trois quatre zones de polypes pour représenter un noyau et des espèces coralliennes. NOTE: Image temps d'acquisition varie entre 2-5 h / zone de polype.
  6. Stocker toutes les images de format de données brutes dans le disque dur du système LSM 5 Rendu 3D d'une analyse d'images 3D et de rendu logiciel.

3. rendu 3D du volume et Visualization de SBFI et à deux photons de fluorescence spectrale des données

  1. Recadrer les données 2D afin de réduire la taille du fichier en se concentrant sur un seul polype en utilisant l'outil de recadrage carré dans le programme et le compiler comme un seul fichier TIFF (réduire la taille du fichier aussi en enregistrant le fichier au format 8 bits) dans le logiciel d'acquisition.
  2. Ouvrez les fichiers assemblés des données de SBFI (collectés à l'étape 1.5.1) ou les multiples z piles de tuiles de sections optiques de deux photons (collectés à l'étape 2.1.4) dans le programme Imaris Surpass module sous algorithme de volume.
  3. Projeter les données de SBFI rendus en 3D en utilisant une projection de l'ombre. Créer un mode isosurface où les voxels sont seuillés pour créer un motif de surface solide (SI Vidéo 3).
  4. Visualisez les projections en 3D en utilisant un algorithme coupure de plan à xy, xz et yz modes orthogonaux pour révéler la structure 3D et la forme des coraux.
  5. Animer les projections utilisant un module clé d'animation de trame dans le même programme de Imaris (SI Videos 3-7).
  6. Générer des fichiers vidéo à 5% de compression et de générer un clips en format avi en utilisant un volume (SI Vidéos 4 et 6), 3D et Isosurface modalités (SI Vidéos 5 et 7).

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Résultats

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Un appareil de SBFI conçu sur mesure (fabriqués spécifiquement pour la présente étude; Figure 3) a produit les premières cartes détaillées 3D numériques d'élévation (MNE) de la texture de la surface extérieure et la morphologie de la M. annularis et M. polypes coralliens faveolature (figure 4 et SI Vidéos 1-2). Cela a donné des images de lobes empilés jusqu'alors inconnus de tissus de corail concentrique rayonner à l'extérieur du centre de cha...

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Discussion

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Recherche sur les récifs de corail est un effort de recherche hautement interdisciplinaire, comprenant l'analyse de la simultanée physiques, chimiques, et des phénomènes biologiques qui opèrent dans le milieu marin. L'étude des écosystèmes de récifs coralliens complexes est donc préférable terminé dans un "Powers of Ten" cadre contextuel (Figure 10). Cette compilation graphique montre que l'écosystème corallien couvre un large éventail de dimensions spatiales (10 -9 à 10...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Nous remercions Donna Epps, histologiste à l’Institut de biologie génomique de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign (UIUC), pour son assistance technique compétente dans la préparation et la coupe des échantillons. Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche accordée à B.W. Fouke de l’Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). De plus, C.A.H. Miller a reçu des subventions du département de géologie de l’UIUC Wanless Fellowship, du fonds Leighton du département de géologie de l’UIUC et du fonds de travail de terrain Roscoe Jackson du département de géologie de l’UIUC. Les interprétations présentées dans ce manuscrit sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement celles des établissements subventionnaires. Nous remercions également le laboratoire de recherche et de gestion de la biodiversité des Caraïbes (Carmabi) à Curaçao pour son soutien et sa collaboration dans la collecte des échantillons de biopsie des tissus coralliens. Nous remercions Claudia Lutz, spécialiste de la communication médiatique chez IGB, pour son habileté à corriger la langue.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SqueletteBiopsie de 2,5 cm à partir d’un habitat naturel
Dispositif de carottage à poinçon d’archeC.S. Osborne et compagnien° 149Pour la collecte de biopsie de corail
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique SciencesRT 1570016 % Pré-dilué
Histoclear/Safeclear IIMicroscopie électronique SciencesRT 64111-04Alternative non toxique au xylène, déshydratation et déparafinisation
Xylène et éthanolFisher ScientificDéshydratation
Cire de paraffineRichard Allen ScientificType H REF 8338Solution d’infiltration
VybarThe Candle MakerComposant de la cire rouge
StéarineThe Candle MakerComposant de la cire rouge
Sudan IVFisher ChemicalS667-25Fond opaque à la cire rouge
Agglutinine de germe de blé (WGA)Life TechnologiesW32466Pour l’étiquetage  ; Coral Mucus
Prolong GoldLife TechnologiesP36095Média de montage anti-décoloration
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100Pour l’imagerie à deux photons
XY Moteur, pilote et contrôleurLin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY Mouvement de translation
Plaque chauffanteCorningDC-220Fusion de toute cire
Four à convectionDX-600d’infiltration et d’enrobage
LeicaASP 300Microtome de déshydratation, d’infiltration
LeicaRM2055Stéréomicroscope
Carl ZeissStereolumar V 12Microscope à fluorescence objectif 1,5x (30 mm WD)
avec ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I SystemImaging coupe mince d’un polype : Zooxanthellae
Caméra AxiocamCarl ZeissMRmCaméra monochrome 1388x1040 pixels
Logiciel AxiovisionCarl ZeissVersion 4.8Programme d’acquisition d’images
Spectration laser à deux photonsMaitai eHP, laser pulsé (70 fs)Avec module DeepSee
Microscope à balayage laserCarl ZeissLSM 710 avec détecteur spectralDétection PMT 34 canaux
Logiciel ZenCarl Zeiss2010 ou supérieurpour l’acquisition d’images à deux photons et spectraux
Logiciel Imaris SuiteBitplane, Inc.,version 7.0 ou supérieureVolume 3D, rendu iso-surface, visualisation
de tissu corallien Yamato Processeur de tissus

Références

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Imagerie des polypes coralliensimagerie par coupes s rielles de blocsmicroscopie deux photonsmicroscopie fluorescenceanalyse de la morphologie tissulairedistribution des chromatophoreslocalisation des zooxanthellestissu corallien d calcifitechnique d enrobage en ciresectionnement au microtome

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