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Article de méthode

Murin de transplantation de la cornée: Un modèle pour étudier la forme la plus courante de la transplantation d'organes solides

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DOI :

10.3791/51830

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17 novembre 2014

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1Department of Ophthalmology, Saint Louis University

Dans cet article

Résumé

Les souris ont été utilisées comme modèle pour étudier de nombreuses formes de transplantation, y compris la greffe de cornée. Nous décrivons dans ce rapport un modèle murin pour la transplantation cornéenne aiguë et tardive.

Résumé

La greffe de cornée est la forme la plus courante de transplantation d’organe aux États-Unis, avec entre 45 000 et 55 000 procédures effectuées chaque année. Bien qu’il existe plusieurs modèles animaux pour cette procédure, les souris sont l’espèce la plus couramment utilisée. Les raisons de l’utilisation de souris sont le coût relatif de l’utilisation de cette espèce, l’existence de nombreuses souches génétiquement définies qui permettent l’étude des réponses immunitaires et l’existence d’un large éventail de réactifs qui peuvent être utilisés pour mieux définir les réponses de cette espèce. Ce modèle a été utilisé pour définir les facteurs de la cornée qui sont responsables du statut de privilège immunitaire relatif de ce tissu qui permet aux allogreffes de cornée de survivre au rejet aigu en l’absence de traitement immunosuppresseur. Il a également été utilisé pour définir les facteurs les plus importants dans le rejet de telles allogreffes. Par conséquent, une grande partie de ce que nous savons sur les mécanismes d’acceptation et de rejet de l’allogreffe cornéenne est due à des études utilisant un modèle murin de transplantation cornéenne. En plus de décrire un modèle de rejet aigu d’une allogreffe cornéenne, nous présentons également pour la première fois un modèle de rejet tardif d’une allogreffe cornéenne.

Introduction

La transplantation de la cornée est un des types les plus communs et succès de la transplantation réalisée chez l'homme. Les raisons pour lesquelles cette intervention chirurgicale est pratiquée sont le résultat de blessures, de maladies infectieuses 1, ou d'autres formes de la maladie de la cornée non-infectieuse 2. Les chiffres de l'Association of America Banque d'yeux indiquent que plus de 46 000 ont été réalisées en 2011 (voir le site Web à l'adresse: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Une indication de son succès est que les taux de défaillance d'un an pour greffes de cornée allogéniques vont de 10 à 15% et à 5 ans, le succès est au-delà de 70% 3-8. Comme de nombreuses études ont démontré le succès des allogreffes de la cornée est directement lié au fait que l'oeil est un site immunologiquement privilégié. Les facteurs responsables de l'état des cornées comme un site de privilège immunitaire comprennent l'absence de ces deux vaisseaux sanguins et lymphatiques dans la cornée, une absence relative de cellules présentatrices d'antigènes, facteurs produite par la cornée qui Suppress funtions immunitaires effectrices 9-15, faible expression de antigènes du CMH 16, et l'expression de FasL 17-20.

Cependant, en dépit de ces facteurs prédisposants ces greffes de succès, ils ne subissent rejet 3-7. Par conséquent, la compréhension de ces mécanismes qui interviennent dans ce rejet et de tester différentes thérapies pour prévenir le rejet est d'une importance critique. À cette fin, nous décrivons ici un modèle murin de greffe de la cornée qui a été en usage depuis plus de 20 ans pour étudier la greffe de cornée dans un environnement expérimental contrôlé. Comme les réponses de transplantation impliquent de nombreux facteurs différents qui travaillent de concert, qui sera ultime de déterminer si le tissu transplanté échoue ou réussisse, il est impossible de comprendre l'importance de ces facteurs dans un modèle in vitro. Par conséquent, les études sur des animaux intacts sont nécessaires pour déterminer quels facteurs sont importants à succès ou failure du tissu transplanté.

Alors que d'autres espèces d'animaux ont été utilisés pour étudier la greffe de cornée, le modèle murin a plusieurs avantages par rapport à l'utilisation d'autres espèces. Le premier est l'existence de nombreuses souches de souris qui expriment certains transgènes ou ont été gène ciblées à l'absence d'expression de facteurs immunologiques spécifiques dont la fonction dans la transplantation peut être mieux étudié. En outre, il ya beaucoup de réactifs (deux facteurs recombinantes et d'anticorps qui neutralisent facteurs) qui sont spécifiques pour les souris et qui ne existent pour de nombreuses autres espèces d'animaux. En raison de l'existence de ces facteurs, ce modèle a été largement utilisée pour identifier les facteurs impliqués dans la cornée allogreffe réponses aiguës 15, 17,18,20 -29. En outre, un grand nombre de facteurs impliqués dans la transplantation de la cornée sont également connus pour être fonctionnels dans la transplantation d'autres tissus.

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Protocole

REMARQUE: Tous les animaux utilisés dans cette procédure sont traités conformément à l'Association pour la recherche en vision et déclaration d'ophtalmologie pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research ainsi que les lignes directrices établies par le comité de surveillance de l'animal à l'Université de Saint Louis.
NOTE: Tous les instruments et solutions chirurgicales sont stérilisés avant la chirurgie pour limiter l'infection microbienne de l'œil. Il convient de noter que, bien que les animaux font l'expérience de la douleur de cette procédure, nous ne comptons pas les analgésiques. La raison en est que tous les analgésiques sont anti-inflammatoires et puisque les réponses de transplantation de la cornée d'une inflammation, l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires pourrait compromettre notre capacité à déterminer les facteurs qui sont impliqués dans l'échec de la greffe de cornée.

1. Anesthésie

  1. Placez la souris donateurs et bénéficiaires sous anesthésie générale par injections IP de kétamine (86.98 mg / kg) et de xylazine (13,04 mg / kg).
  2. Gardez la souris receveuse sous anesthésie tout au long de la procédure qui prend généralement 30 minutes à une heure. Par conséquent, surveiller en permanence la souris pour des signes de reprise de conscience.
  3. Appliquer puralube pommade à l'œil qui ne sera pas subir une intervention chirurgicale après que l'animal est anesthésié pour prévenir la sécheresse.

2. La greffe de cornée

  1. Obtention du bouton cornéen du donneur.
    1. Une fois que l'animal est anesthésié complètement, réaliser une mydriase adéquate par administration d'un couple de gouttes pour les yeux de 1% de tropicamide et 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine.
    2. Placez la tête de l'animal donneur horizontalement sur une planche placée sur un support mobile robuste. Fixer la tête avec une bande de ruban à travers le goulot de sorte que l'oeil est dans une position horizontale tout au long de la totalité de l'opération.
    3. L'utilisation d'un trépan de 2 mm de diamètre, dont la pointe a été teint avec du bleu de méthyle, surtapisser le site de la greffe de cornée centrale.
    4. Avec une lame tranchante, pénétrer la cornée et injecter Healon dans la chambre antérieure de l'approfondir pour réduire le risque de dommages à l'endothélium des bailleurs de fonds et l'objectif sous-jacent.
    5. Exciser le greffon du donneur avec Vannas ciseaux et placer dans un plat contenant une solution saline équilibrée de Hanks jusqu'à utilisation.
    6. Après la greffe du donneur a été enlevé, euthanasier la souris donneuse par inhalation de CO 2.
  2. Préparation du lit de greffe.
    1. Répétez les mêmes étapes comme décrit dans 2.1.1 à 2.1.2 pour le destinataire.
    2. L'utilisation d'un diamètre de 1,5 mm trépan, décrire le site de la greffe de destinataire.
    3. Avec une lame tranchante, pénétrer la cornée et injecter Healon dans la chambre antérieure de l'approfondir pour réduire le risque de dommages à l'objectif sous-jacent.
    4. Retirez le bouton central de la cornée exposée du destinataire à l'aide Vannas ciseaux et jetez-le.
  3. Suturer lagreffe
    1. Placer la cornée du donneur au cours de la greffe lit dans la cornée du receveur. Assurez-vous que Healon adéquate est sous la cornée du donneur à protéger les cellules du donneur endothéliales des dommages causés par un contact direct avec l'objectif.
    2. Utilisation super fine microforceps à pointe, placer la première bouchée de 11-0 suture en nylon sur le côté des bailleurs de fonds, à travers le donateur avec 90% de profondeur de pleine épaisseur au côté du destinataire, puis attacher.
    3. Une fois que la cornée est ancré en place, effectuer des sutures interrompues midcardinal tels que la cornée a 8 à 10 points de suture au total et la cornée du donneur est bien aligné avec et fixé au destinataire lit de greffe de cornée.
  4. L'approfondissement de la chambre antérieure
    1. Approfondir la chambre antérieure par injection HBSS ou bulle d'air dans la chambre antérieure et vérifier doucement l'intégrité de la greffe de cornée pour une fuite avec une éponge de cellulose.
      NOTE: Si la chambre antérieure ne peut être réformé alors il ya une forte probabilité de cataract qui fera les évaluations futures de la cornée transplantée très difficile et aussi potentiellement conduire à des bailleurs de fonds de la cornée dysfonctionnement endothélial et l'échec ainsi greffe.
  5. L'évaluation finale
    1. Observer l'oeil pour déterminer que la pupille est ronde et la profondeur de la chambre antérieure est normal.
      NOTE: Si l'élève est pas rond, cela indique que pendant la suture de l'iris a été endommagé et donc la greffe est considéré comme un échec technique.
    2. Appliquer une pommade antibiotique pour les yeux. En option: Fermez la paupière avec une suture de soie 7-0.
    3. Observez souris jusqu'à ce qu'ils soient complètement éveillé et ensuite individuellement les loger pour un minimum de deux jours après la chirurgie.

3. Suture Removal

  1. Dans les cas où le couvercle suture est utilisé, anesthésier les souris comme décrit ci-dessus et retirer le couvercle de la suture à 48 h.
  2. Anesthésier les souris au jour 7 post-opératoire. Retirez le Sutures fixation de la greffe de cornée. Une fois les sutures sont enlevées et l'animal a pleinement éveillé, retourner dans sa cage.

4. l'évaluation clinique

  1. Examiner l'œil pour les indications de complications liées aux procédures qui comprennent, la cataracte (opacification du cristallin), hyphéma (sang dans la chambre antérieure), une chambre antérieure qui ne sont pas de la bonne profondeur, ou l'opacité importante de la cornée. Pensez à ceux qui démontrent ces complications comme «compromis» et les euthanasier par inhalation de CO 2.
    1. Effectuer tous les examens sur des souris non anesthésiées. Maintenez la souris avec retenue d'une part ainsi de la souris pour que l'autre main peut proptose l'œil afin de permettre une meilleure vue de l'œil. Une fois que les observations sont terminées, revenir à l'animal de sa cage.
  2. Vous avez déjà un observateur familier avec les groupes de traitement évaluer cornées transplantées des signes de greffe de cornée 2 à 3 fois par semaineles épisodes de rejet ou échec de la greffe de la cornée. Utilisez soit le microscope chirurgical ou un biomicroscope lampe à fente horizontale pour ces observations.
    1. Évaluer chaque cornée pour l'opacité en utilisant une échelle de 0 à 5. L'échelle est définie comme suit:
      1. Attribuez une note de 0 à ces cornées qui ne présentent aucun signe d'opacité.
      2. Attribuer une note de 1 à ces cornées présentant une opacité superficielle minime.
      3. Attribuer un score de 2 à cornées qui affichent opacité légère et profonde, mais l'élève sous-jacente et de l'iris sont encore discernable.
      4. Attribuer un score de 3 à cornée afficher stromale opacité dans laquelle les iris ne peuvent être vus en détail à l'exception des marges d'élèves.
      5. Attribuer un score de 4 à cornée afficher dense opacité stromale et si aucune des structures sous-jacentes peuvent être consultés.
      6. Attribuer un score de 5 à cornée afficher opacité complète et intensive œdème du stroma, avec pupille et l'iris totalement obscurci.
    2. Évaluer également tous cornée pour le degré d'infiltration des vaisseaux sanguins (néovascularisation) en utilisant une échelle de notation de 1 à 8. Pour ce faire, voir la cornée en tant que 4 quadrants égaux et déterminer la quantité de vaisseaux sanguins dans chacun de ces quadrants avec une marquer cette gamme de volonté de 0 (pas de navires) à 2 pour vascularisation extensive de ce quadrant. Ajouter les scores individuels de chaque quadrant de calculer le score final de la néovascularisation.
    3. Classer cornées comme aiguë rejetées si elles ont un score de 3 pour deux observations consécutives de temps les points jusqu'à 5 semaines.
    4. Classer les souris dont les cornées étaient claires à 5 semaines, mais développer une opacification parfois> 45 jours après la greffe, avec un score de 3 à deux points de temps consécutifs, comme ayant le rejet d'allogreffe de cornée tard terme subi. Utiliser les courbes de survie de Kaplan-Meier pour analyser la survie du greffon.

5. La manipulation du modèle

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  • Préparation des cellules individuelles de la rate.
    1. Pour préparer des cellules individuelles, premier euthanasier la souris donneuse. Ensuite, retirez la rate.
    2. Placer la rate dans un tamis cellulaire et perturber avec un piston de seringue d'une seringue de 3 ml.
    3. Laver les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de solution saline équilibrée de Hanks.
    4. Retirer 10 pl de suspension cellulaire et ajouter 10 ul de 0,4% de bleu trypan et mélanger. Ajoutez à cela hémocytomètre et compter les cellules dans la grille centrale. Le nombre de cellules dans le tube est le nombre de cellules x 10 4 x 2 (facteur de dilution dans le bleu trypan) x 10 (volume dans le tube).
  • L'injection dans la chambre antérieure.
    1. Anesthésier les souris comme décrit précédemment.
    2. Pratiquer des injections à l'aide d'un microscope à dissection. Pour chaque injection intracamérulaire, utiliser 10 6 cellules de la rate dans un volume de 0,005 ml et 0,25 ml d'un microlitre seringue munie d'une aiguille G 33.
      NOTE: D'autres manipulationsdu modèle peut être réalisé par le traitement des animaux avec des réactifs qui agissent comme des antagonistes ou agonistes de déterminer le rôle qu'un facteur particulier peut jouer après une chirurgie de la cornée allogreffe orthotopique.

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    Résultats

    Le modèle murin de greffe de la cornée a été utilisé pour plus de 20 ans à caractériser avec succès des mécanismes à la fois de l'allogreffe de cornée rejet 19-23 et la cornée allogreffe acceptation 13, 15,16,18, 24-27. Ce modèle a été utilisé pour établir l'importance de l'expression de FasL dans la cornée allogreffe acceptation, par le fait que les animaux qui manquent de FasL sont pas en mesure d'accepter les allogreffes de cornée 15. Il a également été utilisée pour démontrer que le ...

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    Discussion

    Le modèle murin de greffe de cornée décrite ici permet à l'enquêteur d'étudier le rejet d'allogreffe de cornée humaine dans un modèle qui permet de prédire quels sont les facteurs associés à la fois meilleur rejet 15,17,18,20, 26-30 et 21-25 acceptation de la cornée allogreffes. Contrairement à la transplantation de la cornée humaine, dans laquelle les patients reçoivent soit un traitement de stéroïde topique ou systémique pour traiter ou prévenir une ou l'autre de rejet 31,

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    Déclarations de divulgation

    Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

    Remerciements

    Les auteurs tiennent à remercier les nombreuses personnes qui ont travaillé sur cette technique et qui l’ont perfectionnée et qui ont été responsables de la génération de nombreux manuscrits à la fois dans ce laboratoire et dans d’autres. Ce travail a été soutenu par la subvention EY12707 (PMS) des National Institutes of Health et une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité au département d’ophtalmologie.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Microscope chirurgical ZeissRebuilt
    SeringueBD305122
    3 ml SeringueBD309657
    Seringue 10 mlBD309602
    Ciseaux VannusStortzE-3387
    11-0 SuturesAlcon717939M
    Tréphine 2,0 mmKatenaK 2-7520
    Trephine 1,5 mmKatenaK 2-7510
    Chlorhydrate de tricaïne 0,5 %AlconNDC 0065-0741-12
    HealonAbbottHealon OVD
    ForcepsFST11251-20
    7-0 SuturesAlcon8065
    2,5 % Phényléphrine HClAlconNDC 61314-342-02
    1 % TropicamideBausch & LombNDC-24208-585-59
    Seringue HamiltonHamilton7654-01
    Aiguille de calibre 33Hamilton90033
    Passoire cellulaire (100 &mu ; m nylon)BD Falcon352360
    HémocytomètreCardinal HealthB3175
    Trypan BlueSigmaT8154

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