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Cultures organotypique de tranche d'étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

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DOI :

10.3791/51835

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25 août 2014

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1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Stem Cell Institute, University of Connecticut, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Une technique d’étude des cellules NG2 et des oligodendrocytes à l’aide d’un système de culture en tranches du cerveau antérieur et du cervelet est décrite. Cette méthode permet d’examiner la dynamique de prolifération et de différenciation des cellules au sein de la lignée des oligodendrocytes où l’environnement extracellulaire peut être facilement manipulé tout en maintenant la cytoarchitecture tissulaire.

Résumé

Les cellules exprimant NG2 (polydendrocytes, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes) sont la quatrième grande population de cellules gliales dans le système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal elles prolifèrent activement et génèrent oligodendrocytes myélinisantes. Ces cellules ont souvent été étudiés dans des cultures primaires dissociées, co-cultures de neurones, et dans le tissu fixe. Utilisation de lignées de souris transgéniques nouvellement disponibles tranche systèmes de culture peuvent être utilisés pour étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans les deux régions de la matière grise et blanche du cerveau et le cervelet. Cultures tranches sont préparées à partir de souris postnatales et sont maintenues en culture pendant 1 mois. Ces rondelles peuvent être imagées à plusieurs reprises au cours de la période de culture cellulaire pour étudier le comportement et les interactions. Cette méthode permet la visualisation de la division cellulaire NG2 et les étapes menant à la différenciation des oligodendrocytes, tout en permettant une analyse détaillée de région dépendent cellules oligodendrocytes et NG2 hétérogénéité fonctionnelle. Ceci est une technique puissante qui peut être utilisé pour étudier les signaux intrinsèques et extrinsèques qui influent sur ​​ces cellules au cours du temps dans un environnement cellulaire qui ressemble étroitement à celle trouvée in vivo.

Introduction

Cultures tranche Organoytpic du système nerveux central se sont avérées extrêmement utiles pour l'étude de la biologie des neurones et des cellules gliales dans un système semiintact: 1 - 4. Ces cultures sont relativement simples à adopter et à conserver de nombreux avantages des cultures de cellules dissociées primaires telles que la manipulation de l'environnement extracellulaire et un accès facile pour l'imagerie des cellules vivantes à long terme répétées et des enregistrements électrophysiologiques 5 - 9. En outre, des cultures de tranches de tissu cytoarchitecture maintenir en 3 dimensions, la connectivité neuronale régionale, et la plupart des types cellulaires majeurs sont présents dans le système. Ces propriétés font de ces cultures un système unique et pratique pour étudier le comportement de cellules individuelles et de la physiologie des interactions cellulaires et environnementaux.

NG2 cellules sont une population de cellules gliales dans le système nerveux central des mammifères, qui continuent à proliférer et à produire myelinating oligodendrocytes pendant le développement embryonnaire et postnatal 10. Ils ont été largement étudiés dans des cultures primaires de cellules dissociées, et le développement récent des lignées de souris transgéniques avec expression spécifique des cellules NG2 des protéines fluorescentes a facilité la cartographie du destin in vivo et des enregistrements électrophysiologiques dans des préparations de tranches aiguës. Même avec ces études, on sait peu sur la dynamique temporelle de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes. Bien que la culture de cellules dissociées est largement utilisé pour l'installation par rapport à des manipulations pharmacologiques et génétiques, il n'est pas adapté pour interroger les différences fonctionnelles de ces cellules dans les différentes régions du cerveau en particulier quand il est souhaitable de maintenir le cadre de la micro-cellulaire. Cultures Slice offrent une alternative simple qui se prête à des manipulations pharmacologiques et ont été utilisées pour étudier la myélinisation des oligodendrocytes 11,12, celluleréponse parti- après lysolécithine (LPC) ou anticorps induit une démyélinisation 13,14, et l'induction de la remyélinisation par un traitement pharmacologique 15.

Une méthode pour enquêter et effectuer l'imagerie en direct et les tissus fixés (ou postfixation) analyse de NG2 la prolifération cellulaire et la différenciation des oligodendrocytes dans les cultures organotypique prises de fois le cerveau et le cervelet est décrit. Il s'agit d'une méthode puissante qui peut être utilisé pour étudier le sort cellulaire des cellules NG2 simples après la division 16 et de découvrir la région et la différence d'âge-dépendante du facteur de croissance induit la prolifération des cellules NG2 17. Cette technique relativement simple est largement accessible à approfondir cellule intrinsèque et / ou l'environnement mécanismes de régulation de la physiologie de ces cellules gliales et leur réponse à l'activité neuronale ou lésions de la myéline.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux suivent les directives et ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Connecticut.

NOTE: Pour ces expériences constitutifs NG2cre 18 (JAX # 008533) et inductibles NG2creER 16 (JAX # 008538) de souris transgéniques a traversé à Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP reporter 20 (JAX # 006148) lignes respectivement ont été utilisés à l'image des cellules NG2 et de leur progéniture. Pour l'image oligodendrocytes matures, PLPDsRed souris transgéniques 21 ont été utilisés. Pour la survie compatibles, les tranches peuvent être isolés à partir de souris jusqu'à 10 jours après la naissance à la fois du cerveau et le cervelet.

1 tranche Préparation

  1. Dans une hotte de culture, de placer des inserts de culture de tissu à six plaques à puits et ajouter 1 ml de milieu de culture de la tranche (recette dans la section des réactifs). Placer les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2 d'au moins 2 heures avant la dissection.
  2. Stériliser tous les outils et broyeur de tissus avec 70% d'éthanol.
  3. tampon de bulle de dissection (recette dans la section des réactifs) avec 95% O 2, 5% de CO 2 sur la glace pendant au moins 15 min avant le début de la dissection.
  4. Anesthésier souriceaux en les plaçant sur de la glace pendant 5-10 min selon des protocoles approuvés animaux. Déterminer la profondeur de l'anesthésie appropriée en confirmant que les souris ne répondent pas à la queue et pieds pincement.
  5. Décapiter les animaux à l'aide de ciseaux pointus, suivant des protocoles d'animaux. Enlever rapidement le crâne sur le cerveau et le cervelet en faisant d'abord une coupe sagittale suivie par incision latérale, en utilisant des outils stérilisés. Couper les nerfs crâniens de la surface ventrale du cerveau et du cervelet avec soin par laminage du tissu sur le côté.
  6. Passer tissu stérile dans une boîte de 35 mm contenant du tampon oxygéné de dissection glacée.
  7. En utilisant une lame de rasoir, couper le cervelet et le cerveau antérieur. Ensuite, faire une coupe mi-sagittal thropouah le cerveau et le cervelet, la séparation des hémisphères.
  8. Coupez les 300 coupes coronales et sagittales um d'épaisseur du cerveau et du cervelet avec un hachoir manuel de tissu. REMARQUE: Un hachoir manuel de tissu permet un traitement rapide de dissection à la culture incubation sans la nécessité d'intégration agarose. Un vibratome peut également être utilisé comme décrit précédemment 9.
  9. Transfert tranches séparées dans le tampon de dissection froide fraîchement barboter sur la glace.
  10. Utiliser une petite dissection ou pesant spatules pour séparer les sections individuelles et de les transférer à préincubée six plats et avec des inserts de culture.
  11. Retirez tout tampon de dissection excès de la surface de l'insert de culture en utilisant une pipette de transfert jetable ou une pointe P 200 de la pipette. Deux à trois cerveau antérieur ou trois tranches de cervelet peut être placé sur un insert de culture.
    REMARQUE: Pour obtenir des résultats cohérents avec les cultures du cerveau antérieur, il est idéal pour les tranches couvrant la partie antérieure d'un tiers de corps calleux(Figure 1A) afin d'étudier les deux régions grises et blanches matière dans la même tranche. Chaque animal donne généralement de six tranches de cerveau antérieur et les six tranches de cervelet.
  12. Placez les six plaques ainsi dans l'incubateur et remplacer le milieu de la tranche avec 1 ml de milieu de tranche 1 jour après la préparation de tranche, puis tous les deux jours jusqu'à ce que la tranche fixation.
  13. Selon l'expérience, utiliser des tranches après 5-7 jours de culture. Utilisez uniquement des tranches qui deviennent transparent après les quelques premiers jours et jeter ceux qui ont des zones opaques inégales. REMARQUE: les régions opaques dans les tranches sont visibles à l'œil nu et apparaissent comme un amas de cellules sombres en contraste de phase. Après la technique a été maîtrisé, morts tranches opaques sont rares, en moins de 1-5% des tranches.

2. imagerie time-lapse de la division cellulaire et NG2 Oligodendrocyte différenciation

REMARQUE: Pour effectuer laps de temps imagerie de NG2 la prolifération et la différenciation cellulaire, nous utilisons NG2cre: souris ZEG 16qui expriment l'EGFP dans les cellules NG2 et de leur progéniture (figure 1C-E). expression de rapporteur dans cette ligne est suffisamment robuste pour obtenir des images en direct des cellules GFP + dans les tranches immédiatement après la coupe pour une période de temps d'au moins quatre semaines. Les images les plus nettes sont obtenues après la période initiale de l'amincissement de la tranche, qui se produit au cours des 3-5 premiers jours de culture.

  1. Tout au long de l'expérience, garder les tranches dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et ne retirez que pour de brèves périodes de temps (moins de 15 min par tranche), en gardant le couvercle sur la plaque de six puits tandis que d'imagerie.
  2. En utilisant un microscope inversé à fluorescence équipé d'une caméra numérique, de capturer des images au premier point de temps à l'aide d'un objectif 10X. REMARQUE: premiers points de temps varient par l'expérience et peuvent être le jour où les coupes ont été préparés ou n'importe quel moment après le temps.
  3. Capturez des images à partir de plusieurs régions à un point de temps dans les deux zones de la matière grise et blanche de la tranche. Remarque èmee région imagée par des sites spécifiques au sein de la tranche et de la cartographie de la position de l'image sur un schéma qui peut être utilisée pour des séances de formation d'image ultérieures. Points de repère utiles peuvent inclure des bords des tranches et / ou l'orientation de faisceaux de matière blanche. L'image de quatre à huit endroits sur chaque tranche à chaque point de temps.
  4. Capturer les images subséquentes à un intervalle de 4-6 heures si l'examen de la division des cellules NG2 et la différenciation des oligodendrocytes, idéalement plus de 5-7 jours.
  5. Capturer une image finale de toutes les régions et de fixer les tranches immédiatement. Ajouter 1 ml de fixateur (PFA 4% avec 0,1 M de L-lysine 0,01 M métaperiodate de sodium) à la partie inférieure de l'insert de culture, puis ajouter 1 ml d'autre sur le dessus des tranches. Prenez soin de ne pas injecter le fixateur directement sur la tranche, car il peut se détacher de la membrane. Fixer le tissu pendant 30 minutes et procéder à l'immunohistochimie en utilisant des marqueurs spécifiques au stade de développement tel que décrit dans la section 4.
  6. Tranches lavage avec du phosphate de sodium 0,2 M tampon 3 x 10 m. Si nécessaires, des tranches de conserver à 4 ° C à 0,2 M tampon phosphate de sodium pendant 1-3 jours avant immunomarquage mais idéalement effectuer de coloration dans les 24 heures. Passez par immunohistochimie comme décrit ci-dessous dans la section 4 pour déterminer la proportion de cellules qui sont différenciées en oligodendrocytes (figure 2D-F).

3. destin cartographie de NG2 descendance de la cellule en utilisant des souris transgéniques inductible Reporter dans les cultures Slice

NOTE: Pour suivre le destin des cellules NG2 d'un point de temps particulière dans la culture, NG2creER inductibles: souris transgéniques YFP peuvent être utilisés.

  1. Induire une recombinaison Cre et expression du reporteur par l'ajout de 100 nM 4OHT dissous dans de l'éthanol au milieu de culture. REMARQUE: cellules positives Reporter devraient apparaître dans les 1-2 jours à une efficacité d'induction de ~ 20-25% YFP cellules NG2 + + / NG2 + et à ce point de temps seront tous des cellules au stade de cellules NG2 (Figure 2A-C)
  2. Fixer et laver la tranches, à différents points dans le temps après diverses manipulations (décrits dans les sections 2.5 et 2.6).

4 Slice immunohistochimie

  1. Couper les membranes avec les tranches attachées sur les inserts à l'aide d'un scalpel.
  2. Transfert tranches de puits individuels d'une solution saline 24 plaque contenant bien tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un ensemble de pinces à épiler, en prenant soin de ne pas perturber la composition de la tranche d'enlèvement de la membrane.
  3. Transférer les tranches sur une plaque à 24 puits avec une solution de blocage contenant 5% de sérum normal de chèvre (NGS) et 0,1% de Triton-X100 dans du PBS pendant 1 heure.
  4. Incuber les tranches d'anticorps primaire O / N à 5% NGS dans du PBS à 4 ° C. Pour identifier les cellules au stade de la cellule NG2, en utilisant des anticorps dirigés contre le récepteur PDGFRa et NG2. Pour identifier les oligodendrocytes différenciés, utiliser un anticorps à l'antigène polypose adénomateuse coli (APC; clone CC1).
  5. Sur la deuxième tranches de lavage de jour en PBS 3 x15 min, puis incuber dans Antibo secondairemeurt dans 5% NGS dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Laver les tranches dans du PBS 3 x15 min et monter sur des lames. Montage de tranches vers le haut et face à la membrane diapositive de sorte que la membrane ne sera pas entre l'objectif et le tissu.

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Résultats

Des exemples de données représentatives sont donnés ci-dessous qui ont été obtenus à partir de cultures de tranche de la fois le cerveau et le cervelet de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP et PLPDsRed lignées de souris transgéniques. Cellules NG2 peuvent être visualisés sur plusieurs jours dans du cerveau antérieur et le cervelet tranches (figure 1B-D, la vidéo 1) et le phénotype de ces cellules peut être déterminé qu'après la fixation et immunologique avec des anticorps NG2 et CC1 (figure 1E).

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Discussion

La myélinisation dans le système nerveux central est essentiel pour une communication efficace neuronale et la survie des axones 22. Cellules NG2 génèrent en permanence des oligodendrocytes myélinisantes à l'âge adulte, tout en maintenant une population résidente dans la plupart des régions du cerveau 16,23 - 25. Certains mécanismes génétiques et moléculaires qui régulent la différenciation de ces cellules ont été décrits, mais beaucoup reste à découvrir. Cultures organotypique sont un outil co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions de la National Multiple Sclerosis Society (RG4179 à A.N.), des National Institutes of Health (NIH R01NS073425 et R01NS074870 à A.N.) et de la National Science Foundation (A.N.). Nous remercions le Dr Frank Kirchhoff (Université de la Sarre, Homburg, Allemagne) pour la fourniture de souris transgéniques PLPDsRed. Nous remercions Youfen Sun pour son aide dans le maintien de la colonie de souris transgéniques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu de culture en tranches
Minimum EssentielInvitrogen1109050 %
Hank' s Solution saline équilibréeInvitrogen1417525 %
HEPESSigma-AldrichH-403425mM
L-GlutamineInvitrogen250301mM
InsulineSigma-AldrichI66341mg/L
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA-02780.4mM
Sérum de chevalHycloneSH30074.0325 %
Titrer à pH 7,22 avec du NaOH, filtrer avec un filtre sur le dessus de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius
Dissection Buffer
NaClSigma-AldrichS3014124mM
KClSigma-AldrichP54053.004mM
KH2PO4Sigma-AldrichP56551.25mM
MgSO4 (anhydre)Sigma-AldrichM75064.004mM
CaCl2 2H2OSigma-AldrichC79022mM
NaHCO3Sigma-AldrichS576126mM
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG702110mM
AcideascorbiqueSigma-AldrichA-02782.0mM
AdénosineSigma-AldrichA40360.075mM
Filtre avec filtre sur le bouchon de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius, oxygéner avec 95 %O2 5 %CO2 avant utilisation
Autres réactifs et fournitures
4-hydroxy tamoxifène (4OHT)Sigma-AldrichH7904100nM
Paraformaldéhyde (PFA)EM Sciences192004 %
L-LysineSigma-AldrichL-60270.1M
Métaperiodate de sodiumSigma-AldrichS-18780.01M
Anticorps anti NG2 de lapinChemicon (Millipore)AB53201:500
Anticorps anti CC1 de sourisCalbiochem (Millipore)OP801:200
Anticorps anti-Ki67 de sourisVision BiosystemsNCL-Ki67-MM11:300
Anticorps anti-NeuN de sourisChemicon (Millipore)MAB3771:500
Anticorps secondaires spécifiques à l’espèceJackson Immunoresearch
Sérum de chèvre normal (NGS)5 %
Triton X-1000.10 %
Milieu de montage avec inserts de membrane de culture millicellulaire DAPIVector LabsH-1200
0,45&mu ; FisherScientificPICM03050
Filtres à bouchon de bouteilleFisher Scientific09-740-25F
Éthanol
95 % O2 5 % CO2 mélange
Phosphate Saline tamponnée (PBS)
Stérile à six puits
Spatules de dissection (hippocampe) ou de pesée Hachoir
à tissus manuel ou automatique
Lames de
Pipettes de transfert jetables
Boîtes de Pétri stériles de 35 mm et 60 mm Stéréomicroscope
Phase inversée Microscope
Pare-agrumes à flux laminaire Incubateur
culture tissulaire
fluorescence inversée
gazeuxrasoir de Microcope à

Références

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