Article de méthode

Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/51840

⸱

20 novembre 2014

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afin d’explorer de manière exhaustive la diversité des glycanes liés à l’O, une nouvelle procédure d’élimination β réductrice en gel, combinée à la perméthylation et à une méthode de partage de phase rapide, est appliquée à l’analyse des glycanes liés à l’O directement libérés des glycoprotéines résolues par SDS-PAGE et pouvant faire l’objet d’une analyse glycomique ultérieure par spectrométrie de masse.

Résumé

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La séparation des protéines par SDS-PAGE, suivie d’une digestion protéolytique en gel des bandes de protéines résolues, a produit une analyse protéomique à haute résolution des échantillons biologiques. Des approches similaires, qui permettraient une analyse approfondie des glycanes transportés par les glycoprotéines résolues par SDS-PAGE, nécessitent des considérations particulières afin de maximiser la récupération et la sensibilité lors de l’utilisation de la spectrométrie de masse (MS) comme méthode de détection. L’un des principaux obstacles à surmonter pour obtenir des données de haute qualité est l’élimination des contaminants dérivés du gel qui interfèrent avec l’analyse MS. Le flux de travail d’échantillons présenté ici est robuste, efficace et élimine le besoin d’un nettoyage HPLC en ligne avant la MS. Les morceaux de gel contenant des protéines cibles sont lavés dans de l’acétonitrile, de l’eau et de l’acétate d’éthyle pour éliminer les contaminants, y compris les fragments d’acrylamide polymérique. Les glycanes liés à l’O sont libérés des protéines cibles par β-élimination réductrice dans le gel et récupérés par des procédures de nettoyage simples et robustes. L’un des avantages de ce flux de travail est qu’il améliore la sensibilité pour la détection et la caractérisation des glycanes sulfatés. Ces procédures produisent une séparation efficace des glycanes perméthylés sulfatés des glycanes perméthylés non sulfatés (sialylés et neutres) par une partition de phase rapide avant l’analyse MS, et améliorent ainsi les analyses glycomiques et sulfoglycomiques des glycoprotéines résolues par SDS-PAGE.

Introduction

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La glycosylation est une modification de post-traductionnelle des protéines essentielles, ce qui contribue à la physiologie organismal, la pathologie des tissus, et de la reconnaissance cellulaire 3.1. Malgré les importants progrès glycoscience analyse, la caractérisation de la diversité complète des glycanes sur une protéine spécifique reste une tâche extrêmement difficile, en particulier sur les protéines isolées à partir de sources biologiques primaires. Néanmoins, la microhétérogénéité de glycanes des glycoprotéines affecte fréquemment les interactions fonctionnelles avec d'autres protéines. Par conséquent, la caractérisation de la diversité glycane est essentielle pour comprendre la signification physiologique de cellulaire et tissulaire glycosylation 4,5. Afin de comprendre la contribution de la glycoprotéine glycosylation à la physiologie et la physiopathologie de tissu, robuste, sensible, et les techniques d'analyse glycomic complets sont devenus de plus en plus importante. Dans l'analyse protéomique, les identifications de protéines sont généralement obtenus par LC-MS/ Analyse des peptides tryptiques 6 MS. La digestion des protéines peut être réalisée en utilisant une protéine purifiée ou les protéines résolues par SDS-PAGE après digestion in-gel avec des protéases telles que la trypsine 7-9. Pré-enrichissement du mélange de protéines par SDS-PAGE et améliore la précision de la profondeur de la protéine ID. L'élaboration de stratégies analogues pour l'analyse de la glycoprotéine glycomic glycosylation se trouve à la pointe de glycoscience.

Les deux grandes classes de glycanes sont attachés à des squelettes de protéines, soit par N-lien ou O-lien. Glycanes N-liés sont liés à l'asparagine (Asn) des résidus trouvés dans le cadre d'un Séquon défini comme Asn-X-Ser / Thr / Cys (X est n'importe quel acide aminé excepté la proline), et peut être libéré par la digestion enzymatique avec la peptide N -glycanase (PNGaseF ou A), soit en solution, en gel, ou sur-blot 10-12. glycanes O-liés sont principalement liés à la serine (Ser) ou threonine (Thr) les résidus. Cependant, seule une enzyme a été identifié qui est capable de libérer glycanes O-liés de glycoprotéine et elle a une spécificité extrêmement limité glycane, en libérant seulement les glycanes O-liés plus simples. stratégies de déversement de produits chimiques demeurent la méthode de choix pour la libération complète de glycanes O-liés de glycoprotéines. Β-élimination réductrice ou non réductrice, ou hydrazinolyse sont des techniques chimiques de démoulage bien caractérisés et sont actuellement les méthodes les plus couramment utilisées pour libérer glycanes O-liés de glycoprotéines 13,14. Bien que la β-élimination réductrice a été utilisé pour libérer des glycanes O-liés de glycoprotéines séparées par SDS-PAGE, les approches antérieures doivent séparation par HPLC de 15 à 17 pour une analyse ultérieure.

Multidimensionnelle MS (MS n) analyse fournit actuellement la plus riche source de données structurelles pour la caractérisation des glycanes libérés de glycoprotéines isolées dans les montants que la plupart des sources biologiques. La profondeur de MScaractérisation structurale à base est grandement facilitée par permethylating les glycanes libérés avant leur analyse. Perméthylation ionisation augmente et tend à égaliser les réponses de signaux molaires dans un large éventail de structures de glycanes 18,19. En outre, perméthylation balises sans ambiguïté groupements oses terminaux et substitués avec des masses distinctes, renforçant ainsi élucidation de la structure 20-23. Par exemple, les acides glycanes sont généralement difficiles à détecter que les espèces non perméthylé par MS. Bien que les glycanes acides peuvent être détectés en mode d'ions négatifs par MS, il est impossible de détecter à la fois acides et neutres glycanes dans le même mode d'ions. Un avantage majeur de la perméthylation glycane est que tous les groupes hydroxyle libres (OH) sur substituants monosaccharide d'un glycane sera coiffée par un groupe méthyle (OCH 3 ou OMe), ainsi les charges d'un sialylées glycane sont neutralisés, ce qui les rend aussi détectable comme perméthylé neutre (Asielo) glycanes. Cependant, les hydroxyles de groupements sulfate sur sulfoglycans sont résistants à perméthylation, résultant de la rétention de charge anionique, qui supprime l'ionisation et diminue la sensibilité. Cette suppression empêche actuellement l'analyse glycomic complète des glycoprotéines très complexes tels que les mucines, qui portent une grande abondance de glycanes sulfatés 24-26.

Des rapports récents sur purification sulfaté glycanes ont utilisé facturés, la chromatographie en phase inverse pour purifier et glycanes perméthylés séparés avant analyse MALDI. Cette méthode repose sur la séparation complète de glycanes sulfatés et non sulfatés en utilisant différentes phases mobiles pour élution, que nous avons trouvé à être moins sévères que le partitionnement de phase organique. Par conséquent, de nouvelles techniques adaptées à la détection et à l'enrichissement de sulfoglycans sont présentés ici. Ces techniques permettent la récupération quantitative de glycanes sulfatés dans la phase aqueuse après l'eau: DCM (dichlorométhane)extraction, qui est habituellement effectuée à la fin des réactions d'perméthylation 27 glycane. Surtout, cette séparation robuste de sulfoglycans perméthylés partir d'un mélange de glycanes non sulfatés perméthylés enrichit en même temps que pour les espèces chargées tout en simplifiant MS 2 modèles de fragmentation. Un protocole complet pour une meilleure analyse des glycanes en gel O-liés sont également présentés. Le protocole amélioré améliore la récupération glycane, augmente l'information structurelle pouvant être obtenu par le biais de l'analyse MS n glycanes perméthylés, et améliore la sensibilité des analyses sulfoglycomic appliquées aux glycoprotéines essentielles isolés à partir de sources biologiques.

Ce protocole est destiné à l'analyse glycane O-lié de glycoprotéiques extraits entiers ou d'une glycoprotéine d'intérêt spécifique résolu par SDS-PAGE et est composé de trois procédures expérimentales; A) un gel de nettoyage, B) dans le gel β-élimination réductrice, et C) permethy glycanelation. L'objectif est d'obtenir des données complètes glycomic O-liés pour glycoprotéines récoltés à partir de sources primaires d'intérêt biologique (figure 1). Glycoprotéines séparées par SDS-PAGE sont visualisés par coloration et bandes d'intérêt sont excisées et la bande de gel résultant est découpé en petits morceaux. Les morceaux de gel sont décolorées et soumis à des lavages à l'acétate d'éthyle pour éliminer les contaminants de gel (Figure 2A). Libération de glycane est obtenu par en-gel β-élimination réductrice (figure 2B) et les glycanes libérés sont perméthylée. Aqueux-organique extraction perméthylation suivant répartit quantitativement les anioniques sulfatés glycanes loin de glycanes neutres non sulfatés (figure 2C). In-gel β-élimination réductrice couplé à une extraction aqueuse-organique permet la caractérisation des glycanes et sulfoglycans O-liés libérés de petites quantités d'une glycoprotéine séparés par SDS-PAGE. La vision stratégique est summarized sur la figure 1 et les détails sont présentés dans la figure 2. En outre, une partie des morceaux de gel décolorées et lavé peut être utilisé pour une protéine par des techniques protéomiques ID standards LC-MS / MS.

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Protocole

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NOTE: Les préoccupations de sécurité en laboratoire

Conformément aux meilleures pratiques de laboratoire standard, respectez les consignes suivantes. Conservez tous les solvants organiques dans des endroits appropriés. Gardez tous les déchets dans des conteneurs de déchets chimiques avec un étiquetage clair des compositions chimiques. Comme plusieurs réactifs utilisés dans ces protocoles sont potentiellement cancérigènes ou générer des gaz combustibles volatils, traiter tous les réactifs dans une hotte avec ventilation. Porter un équipement de protection individuelle comme des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lorsque l'on travaille avec des solvants organiques.

figure-protocol-1
Figure 1. Procédure de joints glycomique en-gel. (A) Les protéines d'intérêt sont séparées par SDS-PAGE, détectée par des procédures de coloration au bleu de Coomassie ou appropriés (argent), et excisées. Morceaux de gel excisés sont tranchésen petits cubes, décolorés, et on l'a lavé avec de l'acétate d'éthyle afin de réduire les contaminants qui interfèrent avec l'analyse MS ultérieure. Une partie de la tranche de gel peut être réservé pour la digestion tryptique en gel et caractérisation protéomique ultérieure par LC-MS / MS. (B) glycanes O-liés sont libérés des glycoprotéines résolues dans le gel par β-élimination réductrice. Il est essentiel également dessalage et le retrait borate par azéotrope avec du méthanol. (C) les glycanes libérés par β-élimination réductrice O-liés sont perméthylé et ensuite divisée en phases aqueuse et organique. Sulfoglycans sont quantitativement récupérées dans le (aqueuse) phase supérieure tandis que les glycanes neutres et sialylées partition dans le (DCM) couche inférieure.

figure-protocol-2
Figure organigramme 2. Détail de glycomique en-gel. Chaque expérital étape représentée sur la figure 1 est représenté individuellement. (A) décoloration de gel et extraction EtOAc, (b) ordonner en gel β-élimination réductrice pour la libération des glycanes O-lié, et (C) et la phase perméthylation partition. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

1. Gel excision et élimination des contaminants Gel dérivés

  1. Avant de commencer la procédure, préparer les produits chimiques et réactifs énumérés dans la liste des matériaux.
  2. Résoudre les protéines sur gel SDS-PAGE en utilisant des systèmes de tampon Tris-Glycine standard. Stain protéines soit avec du bleu de Coomassie ou coloration à l'argent résolu. En général, la récupération des glycanes O-liés de l'argent Les gels colorés est d'environ 80-90% de la valorisation atteint de Coomassie des gels colorés.
  3. Après l'électrophorèse, le gel placer sur une plaque de verre et accises til région d'intérêt en utilisant un scalpel propre ou une lame de rasoir.
  4. Pour augmenter le rendement de O-glycanes, transférer la bande de gel d'intérêt sur une autre plaque de verre et couper le morceau de gel excisée en cubes d'environ 2 mm. Évitez de faire des morceaux de gel de moins de 1 mm cubes car la récupération glycane est réduite. Transférez les petits morceaux de gel dans un tube de verre vis supérieure (13 x 100 mm) avec une microspatule en acier inoxydable.
  5. Ajouter 1 ml de mM bicarbonate 25 d'ammonium (AMBIC, NH 4 HCO 3) sur le tube de l'échantillon, hermétiquement le tube de verre avec un haut bouchon à vis de téflon, et mélanger délicatement en tapotant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 min. Ne pas employer une agitation vigoureuse pour éviter de déchirer les morceaux de gel.
  6. Retirez délicatement AMBIC du tube de verre en utilisant soit une pipette en verre Pasteur ou une pipette équipée d'un embout en plastique extra-longue. Évitez fracassant et le transfert des petits morceaux de gel tout en enlevant la solution AMBIC.
  7. Ajouter 1 ml d'acétonitrile (ACN) pour latube de verre, bouchon, et mélanger délicatement en tapotant le tube avant de le laisser reposer pendant 10 min. Faire en sorte que les morceaux de gel sont complètement recouvertes de solvant. Si nécessaire, pousser des morceaux de gel hors de la paroi du tube et en solvant avec la pointe de la pipette.
  8. Introduire à la pipette hors ACN du tube de verre et répétez les étapes 1.5 à 1.7 jusqu'à ce que la couleur bleu clair est éliminé. Répéter un minimum de cinq lavages successifs AMBIC / ACN si nécessaire. Pour l'argent des gels colorés, utiliser un kit de déteindre. Passez à l'étape suivante lorsque le morceau de gel se transforme en uniforme blanc dans ACN.
  9. Introduire à la pipette tout liquide du tube de verre, reboucher le tube, ajouter 1 ml de AMBIC et laisser reposer pendant 5 min.
  10. Retirer AMBIC et ajouter 2 ml d'acétate d'éthyle (EtOAc) pour le tube de verre. Recap tube avec bouchon de téflon et placer à 4 ° C pendant la nuit avec agitation de fin sur la fin ou encore effectuer trois lavages EtOAc à la température ambiante pendant 30 minutes chacun. Plus le lavage de l'EtOAc, la plus efficace l'élimination des contaminants.
  11. Supprimerle dernier de l'EtOAc et laver effectue trois lavages avec chacune 2 ml d'H 2 O. L'élimination complète de EtOAc assurera une réaction réductrice β-élimination robuste.
  12. Pipeter de H 2 O et déshydrater le gel par lavage une fois avec 1 ml d'ACN.
    REMARQUE: Après séchage, les gels déshydratés sont prêts à en gel β-élimination. Morceaux de gel déshydratés peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  13. Arrêter le processus de lavage à une étape quelconque et stocker les morceaux de gel à 4 ° C pendant une nuit, quel que soit le tampon ou la solution est appliquée sur le gel (AMBIC, ACN, H 2 O). Redémarrez la préparation des échantillons à tout moment dans les 2 prochains jours.
  14. Utiliser une partie des morceaux de gel décoloré et déshydratés pour la protéine ID par des approches protéomiques standard.

2. En-gel O-glycane de presse par réductrice β-élimination

  1. Préparer une solution stock de 1 M d'hydroxyde de sodium (NaOH) en utilisant 50% de NaOH ou magasin NaOH solide et à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      Prendre 5,2 ml de NaOH à 50% (soit 4 g de NaOH solide) et ajuster le volume à 100 ml pour faire une solution de NaOH. Diluer la solution mère à 1 M de NaOH à 100 mM de NaOH, ce qui peut être stocké à 4 ° C jusqu'à 6 mois sans perte d'efficacité dans les réactions β-élimination réductrice.
  • Assurez-borohydrure de sodium 2 M (NaBH4) dans NaOH 100 mM. Dissoudre 38 mg de NaBH 4 dans 0,5 ml de NaOH 100 mM. En général, en utilisant 0,5 à 1,0 ml de la solution de borohydrure de chaque échantillon. Faire varier le volume de la solution de réaction sur la quantité de morceaux de gel séché préparé à l'étape 1. Attendre pour utiliser 0,5 ml de solution de borohydrure de 1-2 morceaux de gel excisés (étape 1.3).
  • Ajouter 500 ul de NaOH 100 mM pour les morceaux de gel déshydratés et laisser reposer pendant 3-5 min sur la glace afin d'équilibrer le gel sur les conditions de base qui améliorent la récupération glycane.
  • Ajouter 500 ul de 2 M NaBH4 dans NaOH 100 mM, résultant en des concentrations finales de 1 M NaBH
  • Pendant la première heure de l'incubation, mélanger délicatement le tube toutes les 15 min. Évitez forte agitation, car il peut fragmenter les morceaux de gel. Effectuer la réaction dans un incubateur / four bien équilibrée ou dans un bloc de chauffage. Faire en sorte que les morceaux de gel sont recouverts d'une solution de réaction.
  • Arrêter la réaction en retirant le tube d'échantillon à partir de l'incubateur ou bloc chauffant et en le plaçant sur de la glace.
    REMARQUE: Après avoir laissé la réaction β-élimination se dérouler pendant 18 heures, le procédé de dessalage doit être effectuée dans la même journée.

    • 3. dessalage sur échange de cations chromatographie

    1. Tout en maintenant le tube à échantillon sur de la glace pour empêcher la formation d'une chaleur excessive, ajouter lentement 10% d'acide acétique (AcOH), goutte à goutte afin de neutraliser la base. Vortex doucement le tube de l'échantillon entre les ajouts de AcOH. Veillez à ajouter de l'acide lentement et goutte à goutte comme la additisur de l'acide va produire un "volcan" de bulles. Centrifuger le tube pour éliminer les bulles et empêcher débordement, si nécessaire.
      1. Afin d'éliminer la grande quantité de sodium dans le mélange de réaction, passer le mélange réactionnel à travers une colonne d'échange de cations de petite taille (Dowex ou résine AG-50W-X8, forme H +).
      2. Laver la résine échangeuse de cations avec du NaOH et du HCl 1 M 1 avant l'utilisation afin d'éliminer les contaminants qui interfèrent avec l'analyse MS, même si la résine est de qualité analytique.
      3. Faire tremper la résine dans NaOH 1 M et éliminer la solution par décantation. Ajouter de l'eau déminéralisée, éliminer l'eau, puis ajouter 1 M HCl.
    2. Répétez ces étapes jusqu'à ce que la solution ci-dessus la résine est incolore. Laver la résine nettoyée avec de l'eau déminéralisée et en magasin de 5% AcOH à 4 ° C.
    3. Pour faire une petite colonne de verre, aux rayures et briser la pointe d'une pipette Pasteur en verre avec un coupe céramique de sorte que le cône de la pointe de la pipette est d'environ 1 cm de long. Démêler un tampon de laine de verre et pousser vers la pointe formant un support pour le lit de résine. Fixer la colonne de pipette avec une pince à linge ou au dessus d'un tube à essai en verre.
    4. Laver la pipette vide avec 1 ml de methanol (MeOH) et de 3 ml d'AcOH à 5%. Swirl H + Dowex AG50 ou échange de cations suspension de résine stockées dans 5% de AcOH et de transférer suffisamment de la bouillie pour produire un volume de lit de 1 ml dans la colonne de pipette Pasteur.
    5. Rincer la colonne avec cinq volumes de 5% AcOH. Vérifier le débit à travers l'apparition de particules de résine et ne pas utiliser la colonne si la résine est détecté.
    6. Placez colonne sur un nouveau tube vis plateau en verre (16 x 125 mm) et de l'échantillon de charge. Recueillir l'écoulement à travers les glycanes et éluer avec au moins trois volumes de 5% de AcOH dans le même tube.
    7. Couvrir le tube avec du parafilm et faire de petits trous avec une aiguille. Placer le tube de l'échantillon à -80 ° C ou sur de la glace sèche. Une fois congelés, sécher l'échantillon par lyophilisation. Stocker la matière séchée à -20 °C jusqu'à utilisation.

    4. Suppression borate

    1. Préparer AcOH à 10% dans du MeOH. Prenez 10 ml d'acide acétique glacial et ajuster le volume à 100 ml avec du méthanol. Conserver ce réactif dans un flacon en verre avec bouchon de téflon pour un maximum de 6 mois.
    2. Ajouter 300 ul de 10% AcOH dans MeOH pour le tube de l'échantillon lyophilisé séché et vortex. Retirer le triméthyl borate obtenu par evaporation sous un courant de N2.
      Remarque: Le mélange de sels de borate avec du methanol dans des conditions acides produit le borate de triméthyle qui est un composé volatil.
    3. À sec sous courant de N2 à 37 ° C. Après séchage, on ajoute une autre partie aliquote de AcOH dans MeOH comme décrit dans l'étape 4.2. Sécher le liquide pendant 5 min sous azote (N 2) courant à 37 ° C.
      1. Répétez la remise en suspension et séchage au moins 3 fois. Stocker la matière séchée à -20 ° C jusqu'à utilisation.

    5. C18 nettoyage

    1. Équilibrer une colonne à cartouche C18(Taille 1 ml, 100 mg de résine) en utilisant trois volumes de ACN et cinq volumes de 5% AcOH. Accélérer le passage des solutions d'équilibration par application d'une pression d'air positive doux.
    2. Ajouter 500 ul de 5% de AcOH dans le tube d'échantillon dessalé et libre-borate et dissoudre par vortex.
    3. Chargez échantillon remis en suspension dans la colonne C18 équilibrée et recueillir l'écoulement à travers un tube en verre vis d'assemblage (13 x 100 mm). Eluer O-glycanes avec 3 ml de 5% de AcOH dans le même tube.
    4. PARAFILM le tube, faire de petits trous avec une petite aiguille ou utiliser le protège-PTFE bordée lâchement fermé pour couvrir le tube, et congeler l'échantillon à -80 ° C ou sur de la glace sèche. Éliminer le solvant par lyophilisation. Conserver l'échantillon séché à -20 ° C jusqu'à utilisation.

    6. Préparation de base pour perméthylation

    NOTE: Afin d'atteindre perméthylation robuste, préparer NaOH lisier frais. Toute la verrerie utilisée pour les réactions de perméthylation devrait être largement nettoyé.

    1. Pour préparer le réactif de base pour perméthylation, ajouter 400 ul de NaOH à 50% dans un tube à vis de haut verre propre (13 x 100 mm). Ajouter 800 ul de MeOH anhydre et vortex.
    2. Ajouter 4 ml de sulfoxyde de diméthyle anhydre (DMSO) et pour générer des vortex se forme un précipité blanc.
    3. Centrifuger à 600 g pendant 1 min pour sédimenter le précipité. Introduire à la pipette le surnageant et le jeter. Ajouter une période supplémentaire de 4 ml de DMSO anhydre à la pastille. Vortex.
    4. Répétez l'étape 6.2 et 6.3 au moins trois fois de plus ou jusqu'à ce qu'il ne se forme un précipité blanc.
    5. Dissoudre la base pastille dans 3 ml de DMSO anhydre et mélanger délicatement à la pipette va-et-vient avec une pipette Pasteur propre.
    6. Utilisez la base immédiatement pour la réaction de perméthylation suite car il ne peut pas être stockée.

    7. perméthylation de glycanes libérés

    1. Ajouter 200 ul de DMSO anhydre à l'échantillon C18 purifié et vortex ou sonicat pour remettre en suspension.
    2. Ajouter 300 ul de la resuspsuspension de base limitée à l'échantillon et ajouter immédiatement 100 pi d'iodométhane (IEDM). Scellez le tube avec bouchon de téflon et vigoureusement mélanger pendant 5 min par vortex.
    3. Pour arrêter la réaction de perméthylation, ajouter 2 ml de 5% AcOH sur glace et vortex. Pipette solution de haut en bas 5 fois afin de réduire le volume restant de MeI par évaporation.
      NOTE: Le AcOH neutralise la solution et l'élimination du Mel augmente l'efficacité de l'extraction de glycanes sulfatés dans la phase aqueuse au cours de la phase partition.
    4. Ajouter 2 ml de dichlorométhane (DCM) et le tourbillon. Centrifuger à 600 g pendant 1 min à température ambiante pour séparer les phases aqueuse et organique.
    5. Transférer la couche supérieure (phase aqueuse qui contient la majorité des glycanes sulfatés perméthylés) dans un nouveau tube de verre (13 x 100 mm).
    6. Ajouter 2 ml d'H 2 O à la phase organique et vortex. Centrifugeuse à 600 g pendant 1 min afin de séparer les phases aqueuses et organiques et de combiner cette deuxième phase aqueuse avec le sapinphase aqueuse st (étape 7.5).
    7. Répétez l'étape 7.6 et 7,5 fois plus de trois, mais il n'y a aucune nécessité d'économiser les phases aqueuses obtenues à partir des partitions suivantes.
    8. Retirer la couche finale supérieure (phase aqueuse) autant que possible à partir de la couche inférieure (phase organique) et transférer la couche inférieure (phase organique) dans un nouveau tube de verre séparé en utilisant propre pipette Pasteur.
    9. Sécher la phase organique sous le N flux 2 à 42 ° C.
    10. Couvrir le tube avec du parafilm et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.

    8. C18 nettoyage des perméthylés sulfatées O-glycanes de la phase aqueuse

    1. Equilibrer une colonne de cartouche de C18 avec trois volumes de ACN et cinq volumes de 5% AcOH.
    2. Charger les phases aqueuses recueillies et combinées à partir des étapes 7.5 et 7.6 sur la colonne.
    3. Laver la colonne avec 10 ml de H 2 O pour le dessalage.
    4. Éluer la perméthylé sulfaté O-glycanes dans un nouveau tube de verre avec 2 mlde 50% d'ACN. Utilisez une élution supplémentaire avec 85% d'ACN pour améliorer la récupération de perméthylé sulfatés O-glycanes sur les grandes oligosaccharides.
    5. Éluats sec sous courant d'azote à 42 ° C.
    6. Stocker la matière séchée à -20 ° C jusqu'à 6 mois avant l'analyse MS.

    9. spectrométrie de masse de perméthylés O-glycanes

    1. Analyse perméthylés O-glycanes par perfusion directe dans un spectromètre de masse appropriée à l'aide d'une source de nanoélectronébulisation à une vitesse d'écoulement de la seringue de 0,40-0,60 ul / min à 210 ° C la température capillaire. Pour fragmentation par CID dans MS / MS et MS n d'un instrument de piège à ions, appliquer 30-40% de l'énergie de collision.
    2. Pour le mode ions négatifs, reconstituer perméthylé O-glycanes sulfatés dans 50 ul d'un mélange méthanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM d'acétate d'ammonium aqueux (16: 3: 3: 2 en volume). Pour le mode d'ions positifs, reconstituer perméthylée / sialylées O-glycanes neutres dans 50 pi de 1 mM sodium hydroxyde dans un mélange méthanol / eau (1: 1).
    3. Utilisez la cartographie ionique total (TIM) et analyse de perte de neutre (balayage NL) fonctionnalité de la version de logiciel Xcalibur 2.0 pour l'analyse MSN à caractériser les structures O-glycane individuels 13,19.

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    Résultats

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    Effet de Ethyl Acetate Traitement Avant In-gel réducteur β-élimination

    Un spectre de masse représentatif d'échantillons de glycane O-liés perméthylés libérés par bovine mucine à l'aide de gel de β-élimination réductrice est représenté sur la Figure 3. Le lavage à l'EtOAc des morceaux de gel élimine efficacement SDS et polyacryliques contaminants qui interfèrent avec l'analyse MS ultérieure 27.

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    La combinaison de la β-élimination réductrice en gel avec l’extraction organique aqueuse améliore la sensibilité et la profondeur des données structurales qui peuvent être acquises pour caractériser les glycanes liés à l’O sulfatés et non sulfatés récoltés à partir de petites quantités de glycoprotéines de type mucine résolues à partir d’autres protéines par SDS-PAGE. Les principales avancées des approches techniques présentées dans cette étude sont les suivantes : a) élimination facile des contaminants dérivés du gel pa...

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    Déclarations de divulgation

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

    Remerciements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ce travail a été soutenu par la subvention P01HL107151 du NHLBI/NIH. Les auteurs remercient également le NIGMS/NIH pour le soutien et l’accès à l’instrumentation qu’ils ont fournis grâce à des subventions P41GM103490.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Eau, eau déminéraliséeSigma-Aldrich  ;270733-4LCHROMASOLV, pour l’acide acétique HPLC
    , GlacialFisherA38-500Certifié ACS &ge ; 99,7 % p/p
    MéthanolSigma-Aldrich  ;34860-4L-RCHROMASOLV, pour HPLC, &ge ; 99.9 %
    Bicarbonate d’ammoniumFluka09830-500GBioUltra, &ge ; 99,5 % (T), étape 1
    AcétonitrileSigma-Aldrich  ;34998-4LCHROMASOLV Plus, pour HPLC, &ge ; 99,9 %, Etape 1
    Acétate d’éthyleFluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, Etape 1
    Borohydrure de sodiumAldrich213462-25GReagentPlus, 99 %, Etape 2
    IodométhaneSigma-Aldrich  ;289566-100GReagentPlus, 99,5 %,  ; Étape 6. Conserver à 4 ° ; C jusqu’à l’utilisation. Laisser reposer à température ambiante avant utilisation.
    Solution d’hydroxyde de sodium, 50 % p/pFisherSS254-1, étape 6
    Diméthylsulfoxyde anhydreSigma-Aldrich.276855-1LAnhydre, &ge ; 99,9 %, Étape 6
    Méthanol anhydreSigma-Aldrich  ;322415-100MLAnhydre, 99,8 %, Étape 6
    DichlorométhaneSigma-Aldrich  ;34856-4LCHROMASOL® ;, pour HPLC, &ge ; 99,8 %, contient de l’amylène comme stabilisant, Étape 7
    Dowex 50WX8 forme d’hydrogèneforme d’hydrogène 100-200  ; mailleSigma-Aldrich  ;217506-500GStep 3
    AG 50W-X8 Résine  ;Bio-Rad142-1441Étape 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Colonne d’extraction en phase solide, PP, Octadécyle (C18) Phase inverseJT BakerJT-7020-01Étape 5 et 8
    7,5 % Mini-PROTEAN TGX Gel préfabriqué  ;Bio-RadÉtape 1
    Teinture de Coomassie Bio-Safe  ;Bio-Rad161-0786G-250, Étape 1
    Kit de coloration d’argent pour spectrométrie de massePierce24600Étape 1
    Kit d’oligosaccharides (maltotroiose, Dp3 : R474140)Supelco  ;47265
    Kit d’oligosaccharides (maltotétraose, Dp4 : R474135)Supelco  ;47265
    Pipettes Pasteur jetables, verre, pointe courteVWR14673-010Laver avant utilisation
    PYREX 13 x 100 mm Tubes de culture filetés jetables à fond rondCorning99447-13Laver avant utilisation
    PYREX 16 x 125 mm Tubes de culture filetés jetables à fond rondCorning99447-16Laver avant utilisation
    Capuchons/fermetures phénoliques avec revêtement en caoutchouc recouvert de PTFEKimble45066C-13Laver avant utilisation
    Capuchons/fermetures phénoliques avec doublure en caoutchouc PTFEKimble45066C-15Laver avant utilisation
    Seringue HPLC HamiltonHAMILTON81265volume 500  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22 G
    Seringue HPLC HamiltonHAMILTON81165volume 250  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22 G
    Seringue HPLC HamiltonHAMILTON81065volume 100  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22s G
    Hamilton Seringue HPLCHAMILTON80965volume 50  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22s G
    Hamilton Seringues calibréesHAMILTON80300volume 10  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 26s G
    Boîte de Pétri Verre 100 mm x 15mmGSC INTERNATIONAL INC1500-4Laver avant utilisation, Étape 1
    Lames chirurgicales Bard-ParkerFisher371310Étape 1
    Module de chauffage/agitation Reacti-ThermPierce18870Étape 1, 4 et 7
    Blocs chauffantsFisher125DÉtape 2
    Fibre de verre Pyrex laine borosilicate pore taille 8  ; &mu ; mAldrichCLS3950Étape 3
    Coupe-silice fondueCoupe-tubealltech3194Étape 3
    Vortex multitubes  ;VWR444-7063Étape 6
    Lyophiliseur 25EL FreezemobileVirtis25EL
    CentrifugeuseVWRClinical 50
    LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific
    certifiée

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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    Glycanes O li sb ta limination r ductrices paration par SDS PAGElavage de fragments de gelperm thylation des glycanesanalyse par partage de phased tection par spectrom trie de massecaract risation des glycanes sulfat slimination des contaminantspurification sur colonne C18

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