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Article de méthode

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

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DOI :

10.3791/51857

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28 octobre 2014

 , 
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Dans cet article

Résumé

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Résumé

Une variété de processus cellulaires, à la fois physiologiques et physiopathologiques, nécessitent ou sont régis par le calcium, notamment l’exocytose, la fonction mitochondriale, la mort cellulaire, le métabolisme cellulaire et la migration cellulaire, pour n’en citer que quelques-uns. Le calcium cytosolique est normalement maintenu à de faibles concentrations nanomolaires ; on le trouve plutôt à des concentrations micromolaires à millimolaires élevées dans le réticulum endoplasmique, la matrice mitochondriale et le compartiment extracellulaire. Lors de la stimulation, une augmentation transitoire du calcium cytosolique sert à signaler les événements en aval. La détection des changements dans le calcium cytosolique est normalement effectuée à l’aide d’une imagerie de cellules vivantes configurée avec des colorants de liaison au calcium qui présentent soit une augmentation de l’intensité de la fluorescence, soit un décalage de la longueur d’onde d’émission lors de la liaison du calcium. Cependant, un dispositif d’imagerie de cellules vivantes n’est pas librement accessible à tous les chercheurs. Des méthodes de détection alternatives ont été optimisées pour les cellules immunologiques avec la cytométrie en flux et pour les cellules adhérentes non immunologiques avec un lecteur de microplaques à fluorescence. Ici, nous décrivons une méthode simple et optimisée pour détecter les changements dans les cellules épithéliales avec la cytométrie en flux à l’aide d’un colorant de liaison calcique à longueur d’onde. Les cellules épithéliales adhérentes du tubule proximal rénal, qui sont normalement difficiles à charger avec des colorants, ont été chargées avec un colorant de liaison au calcium perméable aux cellules fluorescentes en présence de probénécide, mis en suspension et les signaux calciques ont été surveillés avant et après l’ajout de thapsigargin, de tunicamycine et d’ionomycine.

Introduction

Le calcium est un second messager important de responsable de la transmission de signaux physiopathologiques 1 et physiologique cellulaire. Les concentrations de calcium cytosolique sont maintenus bas grâce à l'activité des pompes et des échangeurs de calcium de calcium. Le sarcoplasmique / endoplasmique ATPase du réticulum calcium (SERCA) remplit le réticulum endoplasmique (RE) magasin de calcium dans le cadre d'un système de «pompe de fuite" alors que le calcium ATPase de la membrane plasmique (PMCA) expulse calcium dans le compartiment extracellulaire, à la fois dans les mœurs dépendant de l'ATP 2. Messagers physiologiques, telles que des hormones ou des neurotransmetteurs, transmettent leurs signaux à G récepteurs couplés aux protéines, l'activation de la phospholipase C, qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) dans la membrane plasmique à générer diacylglycérol et l'inositol triphosphate (IP3) 3. Bien diacylglycérol reste dans la membrane plasmique, IP3 diffuse dans le cytosol et se lie à un récepteur d'IP3s (IP3Rs), qui sont activés ligand canaux calciques, qui se trouvent dans la membrane du RE et le calcium est libéré du magasin ER luminale a abouti à une augmentation de la concentration en calcium cytosolique 4. Une autre voie pour le calcium pour atteindre le cytosol est à travers les canaux calciques et des échangeurs présents dans la membrane plasmique. Diaphonie entre ces deux compartiments ont été décrites: la libération de calcium de calcium induite (CICR) où le calcium extracellulaire induit la libération de calcium à partir de ER magasins 5 et magasin exploité entrée de calcium (SOCE) où la vidange des magasins à l'urgence est détectée par la STIM et provoque l'ouverture de Orai les canaux de calcium dans la membrane plasmique afin de promouvoir le remplissage des magasins ER 6.

Dans des conditions physiopathologiques, la réponse calcique cellulaire est l'augmentation de calcium cytosolique déréglementés et en l'absence de stimulateurs physiologiques 1. La réponse du calcium peut être affectée à un certain nombre de façons: calcium prolongésignal retardé élimination du calcium du cytosol, l'épuisement des réserves de calcium ou des changements localisés de calcium. En outre, les mitochondries ont un rôle central dans la mémoire tampon et la libération de calcium 7. Prolongé et / ou supramaximal augmentation de calcium cytosolique entraîne la mort cellulaire. En fait, le calcium est le plus souvent impliqué dans la réponse physiopathologique cellulaire et est un événement clé dans un large éventail de maladies, comme les maladies neurodégénératives, les maladies cardiaques, le cancer, les maladies osseuses et les maladies du rein, qui sont principalement associée à la mort cellulaire et la perte ou l'altération des organes ou de tissus fonction 8-10. En outre, la perturbation des signaux du calcium a été liée à l'adaptation cellulaire et des changements dans les fonctions cellulaires et des réponses.

Traditionnellement, les signaux calciques sont mesurés avec un indicateur de calcium fluorescent chargé négativement qui est chargé dans les cellules sous forme d'un ester d'acétoxyméthyle cellule perméable (AM). Une fois clivée par esteras cellulaireses, les indicateurs fluorescents restent dans le compartiment intracellulaire et augmentent l'intensité de fluorescence lorsque le calcium est lié. L'indicateur de calcium le plus connu et utilisé est le quotientométrique Fura-2 développé par Roger Tsien et ses collègues 11. indicateurs de calcium ayant des affinités différentes pour le calcium permettent à différents pools de calcium à surveiller. Les méthodes de détection comprennent l'imagerie des cellules vivantes, fluorescence lecteur de microplaques et la cytométrie de flux. La cinétique relativement rapide de signaux calciques (généralement au bout de quelques secondes à quelques minutes) fait Imagerie de cellules vivantes la meilleure méthode pour gagner le plus d'informations sur les caractéristiques du signal de calcium. Mis à part la cinétique rapide de signaux calciques (quelques millisecondes), imagerie de cellules vivantes est une meilleure méthode pour étudier la compartimentation cellulaire de la signalisation calcique dans une seule cellule 12. Les concentrations de calcium absolues peuvent être calculées par la détermination de la fluorescence minimale et maximale du calcium indicator par addition d'un chélateur de calcium et perméabilisation des cellules, respectivement, comme décrit par Grynkiewicz et al., 11.

L'utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer des signaux de calcium a été développé dans les années 1980 dans des cellules immunologiques où la possibilité de mesurer des paramètres tels que l'intégrité de la membrane et la séparation de la population de cellules, et l'exigence de cellules en suspension combinée avec le développement de la longueur d'onde unique indicateurs de calcium fait cytométrie de flux une méthode idéale et convenientdetection 13-15. Dans les cellules adhérentes, imagerie des cellules vivantes fournit le plus d'informations sur la signalisation calcique, surtout la cinétique, mais nécessite une installation complexe comprenant un microscope à fluorescence, un système de perfusion, l'entretien de l'environnement cellulaire, telles que la température, et un logiciel de microscope spécialisé pour l'acquisition et l'analyse des données. Des méthodes alternatives comme un lecteur de microplaques à fluorescence ou pharmacolmoyens giques grâce à l'utilisation de chélateurs de calcium sont incomparables en termes d'information acquise. La cytométrie en flux est de plus en plus largement utilisés pour surveiller calcium cytosolique dans les cellules adhérentes si, dans la majorité des études, ne finissent point les mesures sont effectuées. En utilisant le procédé développé initialement par Gergely et al., Dans les cellules B immunologiques 16, les variations de concentration de calcium libre cytosolique par cytométrie en flux avec une cinétique en temps réel et le contrôle de l'intensité de fluorescence dans des cellules individuelles à partir d'une population d'échantillon ont été mesurés avec succès dans des cellules épithéliales cancéreuses et les hybrides de cellules souches du cancer 17. Cette méthode est en outre adapté pour une utilisation dans des cellules épithéliales adhérentes, qui sont difficiles à charger avec des indicateurs de calcium 18.

Ici, en utilisant une lignée de cellules épithéliales immortalisées adhérente dérivée du segment S1 du rein de rat tubule proximal (CL.2 WKPT-0293) 19, nous décrivons un m simplifié optimisééthode pour la mesure de l'évolution de la concentration en calcium cytosolique par cytométrie de flux. Depuis de nombreuses cellules épithéliales possèdent un certain nombre de transporteurs organiques pour les composés anioniques, le chargement des cellules avec un indicateur de calcium peut se révéler être un défi. Pour éviter que l'efflux de calcium, les indicateurs de probénécide, l'inhibiteur prototype de transporteurs d'anions organiques et développé à l'origine pour diminuer l'excrétion rénale de la pénicilline 20, est appliquée simultanément dans le milieu d'incubation. Les cellules sont maintenues dans des monocouches de chargement indicateur de calcium, mis en suspension et des signaux de calcium peuvent être détectés immédiatement après l'addition du composé.

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Protocole

1. Préparation des réactifs et des solutions

  1. Préparer une solution de Hank équilibrée en sel modifié (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, sans rouge de phénol). Conserver à 4 ° C.
  2. Ajouter 1,5 M de CaCl2 2 M et l'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,2) des solutions de réserve avec de l'eau distillée.
  3. Préparer une solution 250 mM d'achat d'actions de probénécide. Pour la forme de l'acide libre (souvent désigné comme insoluble dans l'eau), dissoudre la poudre dans le probénécide 1 N NaOH, remplir aux trois quarts du volume final avec de l'eau distillée et titrer lentement à pH 7,4 avec HCl 1. Conserver à 4 ° C.
  4. Dissoudre membrane perméable calcium fluorescent colorant de liaison dans diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à une concentration stock de 1 mM. Conserver à -20 ° C dans l'obscurité.
  5. Avant chaque expérience, fraîchement préparer H contenant le probénécide,BSS flux (FSP) en combinant un tampon modifié avec du HBSS (en concentrations finales) 1,5 mM de CaCl2, 10 mM d'HEPES, pH 7,2, 5% de sérum bovin fœtal, 2 mM de probénécide de, et 5,55 mM de glucose. Chaud à 37 ° C.

2. Culture Cellulaire

  1. Plate cellules 2,5 x 10 5 rénaux proximaux des tubules (WKPT-0293 CL.2) par puits d'une boîte 6 de la plaque ou bien 35 mm dans un milieu de culture standard et se développent pendant 2 jours pour atteindre un confluence d'environ 70%.

3. Calcium Dye Chargement

  1. Pour chaque plat bien ou, mélanger milieu de culture de 1 ml contenant 5% de sérum de veau fœtal, 4 cellules uM perméable colorant de liaison de calcium et 2 mM de probénécide.
  2. Remplacer le milieu de culture avec 1 ml de mélange chargement de colorant dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium pour empêcher le blanchiment de l'indicateur fluorescent.

4. Préparation de CeLLS pour cytométrie en flux

  1. 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-chaud (EDTA), solution à 37 ° C.
  2. Solution de colorant de chargement de calcium Aspirer chaque puits et ajouter 1 ml de trypsine long de la paroi du puits.
  3. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que toutes les cellules sont décollées.
  4. les cellules de transfert à un tube de 1,5 ml et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 10 000 g pendant 1 min.
  5. Aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot.
  6. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de PHF et remettre en suspension par pipetage de haut en bas.
  7. Pellet les cellules par centrifugation à 10000 g pendant 1 min.
  8. Répétez les étapes 4.6. et 4.7. encore deux fois.
  9. Remettre en suspension les cellules dans un volume final de 500 ul de tampon de PHF et en utilisant les cellules à l'intérieur de l'expérimentation 1 heure.
  10. Facultatif: cellules de comptage pour déterminer la concentration de cellules et utilisent 5 x 10 4 - 1 x 10 5 cellules par mesure.

5. Débit CytOmeter Setup

  1. Lancer le cytomètre en flux, ouvrez le tiroir fluidique et appuyer sur l'interrupteur à bascule valve de ventilation pour augmenter la pression d'air du réservoir de liquide de gaine.
  2. "Premier" l'instrument pour éliminer les bulles d'air éventuelles résidant à l'intérieur des chambres à air et la chambre d'écoulement.
  3. Dans le logiciel de cytométrie de flux, d'ouvrir deux fenêtres points de l'intrigue.
    1. Le premier tracé de points nécessite la lumière diffusée vers l'avant (FSC) pour le paramètre X et la lumière de côté dispersé (SSC) pour le paramètre Y pour contrôler la qualité des cellules dans l'échantillon par leur taille et leur granularité, respectivement.
    2. Le deuxième tracé de points de mesure l'intensité de fluorescence du colorant lié au calcium. Sélectionnez le canal de détection de fluorescence appropriée pour le paramètre Y en utilisant une échelle logarithmique et le temps en secondes pour le paramètre X sur une échelle linéaire.
  4. Réglez le taux de «haute» de flux.

6. cytométrie en flux Mesure

  1. Effectuer les mesures à température ambiante. Dans un tube de cytométrie de flux de l'échantillon (11,5 x 75 mm), ajouter du tampon de PHF 480 ul.
  2. Ajouter 20 ul suspension de cellules et de vortex brièvement pour mélanger.
  3. Déplacer le bras de support de tube vers le côté et positionner le tube à échantillon sur le tube d'injection d'échantillon jusqu'à ce que un joint étanche est formé. Remettre le bras de support de tube à sa position centrée originale.
  4. Optimisation de mesure en réglant le canal de fluorescence de telle sorte que l'intensité moyenne de la fluorescence de l'échantillon est d'environ 10 2 sur l'axe des y. Enregistrer et utiliser pour des expériences ultérieures.
  5. Pour commencer une expérience, répétez les étapes 6.1 à 6.3.
  6. Enregistrez fluorescence de base pour 50 sec.
  7. Pause mesure, retirer le tube d'échantillon, ajouter composé d'intérêt, vortex brièvement et revenir au tube d'injection d'échantillon. Cette étape ne devrait pas prendre plus de 15 secondes.
  8. Reprendre la mesure et continuer pour un total de 204,8 sec.
  9. Utilisez un i de calciumonophore, tel que l'ionomycine (10 uM), et d'un chélateur du calcium, tel que l'éthylèneglycol tétraacétique (EGTA), MnCl 2 ou CoCl 2 (2 mM), des contrôles, respectivement positive et négative.

Analyse 7. données

  1. Analyser les données en utilisant un logiciel de cytométrie en flux dédié pour l'analyse en ligne, tels que WinMDI (Multiple Document Interface Windows pour cytométrie en flux), un logiciel gratuit développé par Joe Trotter à l'Institut Scripps, Cytométrie en flux Core.
  2. Ouvrez un tracé de points avec les paramètres de la SSC et FSC.
  3. Sélectionnez la région de cellules pour l'analyse à l'aide de l'outil "des régions" (clic droit sur ​​l'image) d'exclure les cellules mortes ou les débris cellulaires trouvé dans le coin inférieur gauche de l'analyse des données (Figure 1).
  4. Analyse Quadrant (Figure 2)
    1. Ouvrir un diagramme de densité en fonction du temps sur l'axe des x et l'intensité de fluorescence sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Nousenvoyer la même région de déclenchement comme dans 7.3.
    3. Quantifier les données en utilisant l'outil "Quadrant".
    4. Régler les séparateurs quadrants de telle sorte que la ligne verticale est placé au moment de l'addition du composé et de la ligne horizontale est placée au centre de la fluorescence de ligne de base chez les témoins. Assurez-vous que le positionnement des séparateurs de quadrant est égale dans tous les échantillons.
    5. Le pourcentage de cellules dans chaque quadrant est affichée dans chaque coin (figure 2). Comparer le quadrant supérieur droit (UR) entre les échantillons.
  5. analyse de l'histogramme (figure 3)
    1. Ouvrir les données de commande dans une fenêtre de l'histogramme de l'intensité de fluorescence sur l'axe des x et des événements sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Pour une vue d'ensemble pictural, ajouter les données de test pour être comparé à l'intrigue comme parcelles de superposition de commande (allez dans Fichier → Ouvrir Fichier → → Sélectionnez le fichier Overlay).
    3. Pour l'analyse quantitative, seul histogramme gagnerDow doivent être utilisés. Porte le population de cellules à l'aide de la région R1 de l'étape 7.3.
    4. Dans le témoin non traité, utilisez la fonction de marqueur («marqueurs») pour marquer la zone d'analyse à partir de la mi-chemin entre le minimum et le maximum de fluorescence du pic de contrôle et se terminant à l'intensité de la fluorescence maximale. Le pourcentage de cellules dans cette zone est calculée.
    5. Récupérer des données à partir de la fenêtre des statistiques. Répétez l'opération pour les autres fichiers de données en utilisant la même zone marquée pour l'analyse.
  6. analyse de l'intensité de fluorescence (Figure 4)
    1. Ouverture d'un tracé de points dans le temps sur l'axe des x et l'intensité de fluorescence sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Activer "Mode cinétique» et «Overlay ligne Kinetics". Une ligne bleue apparaît dans le tracé de points représentant l'intensité moyenne de fluorescence.
    3. Quantifier l'afflux de calcium par rapport en créant des régions rectangulaires multiples. Chaque région doit avoir awidth d'environ "50", ce qui équivaut à "10 secondes". Définir jusqu'à 15 zones rectangulaires.
    4. Récupérer quantification de la fenêtre des statistiques et copiez-les dans une feuille de calcul.
    5. Utilisez les données de Y-moyen pour analyse. Calculer la moyenne des R2 à R6, qui est équivalente à 20 à 50 sec. Ceci est la valeur de référence.
    6. Choisissez un intervalle de temps approprié pour l'analyse de l'afflux de calcium (dépend de début, la durée et l'intensité).
    7. Calculer les signaux de calcium de chaque région à l'intérieur de cet intervalle de temps par rapport à la valeur moyenne de référence, qui est, le signal de fluorescence avant l'addition de composé, qui est fixé à 100%. Déterminer la moyenne et l'écart type des régions poster plus composé; ce moyen est le signal de calcium provoquée par le composé.

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Résultats

Pour augmenter le calcium cytosolique, deux composés pharmacologiques ont été appliquées aux cellules des tubules rénaux proximaux (WKPT-0293 CL.2) chargés de colorant de liaison cellulaire calcium perméable, Fluo-3-AM. Les échantillons de contrôle non traités ont été chargées avec un colorant de liaison de calcium en présence de probénécide et ont été mélangés mais sans l'addition de tous les composés. Thapsigargine (TG) est un inhibiteur classique de la pompe de SERCA conduisant à une fuite hors de l'ER et entraînant ...

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Discussion

Le calcium est un événement clé dans de nombreux processus cellulaires qui agissent comme une seconde molécule de signalisation de messager et également en tant que moyen pour la communication entre le RE et les mitochondries. La capacité de mesurer l'évolution des concentrations libres de calcium cytosolique est une technique utile qui peut appliquer à tous les domaines de la biologie cellulaire. Il existe différentes méthodes pour détecter les signaux de calcium cytosolique. Classiquement, des signaux d'un ind...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche dans les laboratoires est financé par la Fondation Fritz-Bender, Munich, Allemagne (TD) et l'Université de Witten / Herdecke subvention de recherche interne (W.-KL). Nous tenons à remercier le Professeur Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut de Physiologie, Physiopathologie et toxicologie, Université de Witten / Herdecke) pour des suggestions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fluo-3, AMInvitrogenF-1241  ;Perméable aux cellules
ProbenecidSigma-AldrichP-8761Insoluble dans l’eau, dissous dans 1 N NaOH
0,05 % Trypsine-EDTA (1X)Invitrogen25300-062
IonomycineSigma-AldrichI9657
ThapsigarginTocris Bioscience1138
TunicamycineSigma-AldrichT7765
FACSCalibur Cytomètre en Flux + CELLQuest softwareBecton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)Joe Trotter, The Scripps InstituteVeuillez noter qu’il s’agit d’une ancienne application 16 bits qui lit les fichiers conformes à la norme FCS 2.0 mais ne reconnaît pas les données numériques FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 Lignée cellulaire de tubule proximal de rat Biophysique, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)
Mis à disposition par le Dr Ulrich Hopfer (Département de physiologie et

Références

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