Article de méthode

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

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DOI :

10.3791/51860

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21 août 2014

 , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology Graduate Program, The Ohio State University, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Heart Center, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

La capacité d’isoler les cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC) est essentielle pour comprendre les mécanismes de développement, de maintenance et de maladie des valves. Nous décrivons ici l’isolement des VEC à partir de souris Tie2-GFP embryonnaires et adultes à l’aide de FACS qui permettra de réaliser des études déterminant la contribution des VEC dans les processus de développement et de maladie.

Résumé

Les structures valvulaires normales sont constituées de couches stratifiées de matrice extracellulaire (MEC) spécialisée entrecoupée de cellules interstitielles valvulaires (CIV) et entourées d’une monocouche de cellules endothéliales valvulaires (VEC). Les VEC jouent un rôle essentiel dans l’établissement des structures valvulaires au cours du développement embryonnaire et sont importantes pour le maintien de l’intégrité et de la fonction des valves tout au long de la vie. Contrairement à un endothélium continu à la surface des feuillets valvulaires sains, la perturbation VEC est couramment observée dans les valves défectueuses et est associée à des processus pathologiques qui favorisent la maladie et le dysfonctionnement valvulaires. Malgré leur pertinence clinique, les études ciblées déterminant la contribution des VEC au développement et aux processus pathologiques sont limitées. L’isolement des VEC à partir de modèles animaux permettrait une expérimentation spécifique aux cellules. Des VEC ont été isolés à partir de modèles adultes de grands animaux, mais en raison de la petite taille de leur population, de leur fragilité et de l’absence de marqueurs spécifiques, aucun cas d’isolement de VEC chez des embryons ou des modèles de petits animaux adultes n’a été signalé. Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet d’isoler directement les VEC de souris aux stades embryonnaire et adulte. En utilisant le modèle rapporteur Tie2-GFP qui marque toutes les cellules endothéliales avec la protéine fluorescente verte (GFP), nous avons réussi à isoler des cellules GFP positives (et négatives) des régions des valves semi-lunaires et auriculo-ventriculaires en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les VEC isolés positifs à la GFP sont enrichis en marqueurs endothéliaux, y compris CD31 et le facteur de von Willebrand (vWF), et conservent l’expression des cellules endothéliales lorsqu’ils sont cultivés ; tandis que les cellules GFP négatives présentent des profils moléculaires et des formes cellulaires compatibles avec les phénotypes VIC. La capacité d’isoler des VEC murins embryonnaires et adultes permet de mener des études moléculaires et fonctionnelles auparavant inaccessibles sur une population spécifique de cellules valvulaires, ce qui améliorera considérablement notre compréhension du développement des valves et des mécanismes de la maladie.

Introduction

La vanne mature est composé de trois couches stratifiées de la matrice extracellulaire spécialisée (ECM) intercalées avec des cellules interstitielles de soupape (CIE) et encapsulé par une couche unique de cellules endotheliales de la valve cardiaque (CVE) 1. Le rôle de la MEC est de fournir toutes les propriétés biomécaniques nécessaires pour résister à des changements constants de force de hémodynamique au cours du cycle cardiaque. Changement de l'ECM de soupape dans la soupape d'adulte est étroitement régulée par CIE qui sont en grande partie de repos et des fibroblastes comme en l'absence de maladie. En plus de la population VIC, des cellules endotheliales de la valve cardiaque (CVE) forment un endothelium continu sur la surface des valvules 2. Bien que l'importance de l'ECM et CIE pour la structure et la fonction de clapet ont été décrits par nous et les autres, le rôle de CVE est moins bien connue. Cependant, cette population relativement petite de la cellule est essentielle pour la formation de l'embryon dans la soupape et est décrit comme étant des dysfonctionnements dans la vannemaladie.

Coeur formation de soupape dans l'embryon commence quand un sous-ensemble de cellules endotheliales dans les régions de canal et la sortie des voies auriculo-ventriculaires endotheliales subissent une transformation mésenchymateuse (EMT) et des renflements de forme connue en tant que coussins endocardiques 1,3. Les cellules mésenchymateuses nouvellement transformées au sein de ces structures se différencient ensuite en CIV et forment les vannes matures. Une fois EMT est terminée, les cellules endothéliales qui entourent les coussins, appelés CVE, forment une couche de cellules endothéliales continu qui protège la vanne mûr contre les blessures. En outre, CVE sentent l'environnement hémodynamique et ont été montrés à moléculaire communiquer avec CIV sous-jacents à réguler l'homéostasie 1,3 ECM. Dans valvules, la monocouche CVE est perturbé en association avec des changements anormaux dans l'organisation de l'ECM et de la biomécanique modifiés 4,5. En outre, des études dans des modèles de souris suggèrent que le dysfonctionnement CVE est la cause sous-jacente de la vanne dalad ie 1,6-9. Comme CVE jouent un rôle important dans le développement de la vanne, la maintenance et la maladie, il est important que nous définissons pleinement leurs phénotypes temporelles afin de faire progresser le domaine et comprendre les mécanismes de la maladie.

Les travaux antérieurs de plusieurs laboratoires a réussi à isoler CVE de porcins et ovins modèles 10-12. En raison de la grande taille de ces vannes, à travers isolations pistonnage et / ou digestion enzymatique, suivi d'un nombre de différentes méthodes d'isolement, y compris la séparation des cellules par billes magnétiques et l'expansion clonale cellule unique a été efficace pour générer des populations pures de 11 à 13. Cependant, ces modèles peuvent être restrictives en raison de l'annotation incomplète des porcins et d'ovins génomes limitant la disponibilité des outils moléculaires, en plus des coûts élevés. Par conséquent expérimentation de porc et CVE ovins après l'isolement peut être restrictive. Des modèles de souris sont préférables en raison des nombreuses possibilités de manipula génétiquetion et les outils moléculaires dans l'embryon et de l'adulte, mais à ce jour, aucun isolat CVE dans de petits modèles animaux ont été rapportés. Cela est probablement dû à la difficulté de travailler avec des échantillons de tissu de petites qui comprennent une population de cellules qui n'ont pas actuellement minorité identité unique de marqueurs spécifiques VEC, empêchant de ce fait des procédés d'isolation à base d'anticorps.

Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode pour l'isolement direct de CVE murins à des stades embryonnaires et adultes. Ce protocole prend avantage de souris Tie-2-GFP, qui expriment la GFP dans tous les types de cellules endotheliales et ont été largement utilisés pour étudier les populations de cellules endotheliales 14. Toutefois, la nouveauté de la présente étude est que ces souris, pour la première fois, ont été utilisées pour isoler les cellules endothéliales de soupapes. Par dissection soigneuse du tissu valvulaire et une série de neuf digestions enzymatiques suivies par tri FACS, CVE peuvent être isolés et utilisés pour diverses techniques expérimentalescompris l'extraction d'ARN et de la culture, directement après le tri.

Protocole

1 Préparation de l'équipement et Solutions

  1. Stériliser les outils de dissection - ciseaux de tissus fins à extraire les cœurs adultes et deux pinces fines pour la dissection de la région valvulaire - à l'autoclave dans un bac de l'appareil visé. Pulvériser outils avec 70% d'éthanol (EtOH) avant la dissection.
  2. Préparer les solutions immédiatement avant l'expérience et stériliser les solutions en les faisant passer à travers un filtre stérile de 0,2 pm. Conserver les solutions sur la glace jusqu'à utilisation.
    1. Tampon de dissociation stérile (15 ml au total / échantillon). Mélanger 1,2 ml de collagénase IV, 300 pi de 2,5% de trypsine et 150 sérum de poussin ul. Amener le volume à 15 ml avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
    2. Tri tampon stérile (12 ml de total). Mélanger l'acide 25 ul de 0,5 M éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 12 pi de DNase I (RNase). Amener le volume à 12 ml avec de l'HBSS.
    3. CVE Culture, des Médias. Mix Les gro endothélialeswth médias selon les instructions du fabricant (voir matériau tableur) en ajoutant les composants aliquotée du kit à 500 ml d'EBM2 médias.
    4. GFP négative culture des médias (médias de cellules non-endothéliales). Mélanger 445 ml de milieu 199 1x avec 5 ml de pénicilline / streptomycine (stylo / angine) (1% concentration finale) et 50 ml de FBS (10% de concentration finale).

2 Dissection de la région valvulaire de souris adultes et les embryons de E14.5

  • Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés et exécutés conformément aux directives recherche de l'Hôpital Institut IACUC de la Nationwide Children.
  • Souris Tie-2-GFP ont été achetés auprès de Jackson Laboratories (numéro 003658) et 14 ont été maintenues génotypes homozygotes sur un FVB / N arrière-plan, et assurant ainsi que tous GFP hors ressort expresse dans les cellules endothéliales Tie-2-positifs.
  • Pour tri FACS, préparer un appariés pour l'âge samp négativele ne contenant pas de GFP tel que C57 / BL6 grille pour définir des paramètres pour la GFP tri FACS. NOTE: Ce protocole et les résultats représentatifs sont basés sur l'utilisation de trois, souris adultes-quatre mois ou une portée au jour embryonnaire (E) 14.5.
  1. Les souris adultes: Immédiatement après le sacrifice de CO 2 anoxie, utiliser des ciseaux de dissection d'ouvrir doucement la cavité thoracique et exposer le cœur et les poumons. Une fois exposée, saisir le coeur avec des pinces sur les grandes artères et le retirer du corps. Retirer le tissu pulmonaire si intact, et placer des coeurs dans HBSS froid à rincer. Retirez le ventricule et retirez les oreillettes de quitter le canal atrio-ventriculaire «anneau» et les régions de l'aorte intacte. Faire une entaille sur le côté du canal atrio-ventriculaire d'ouvrir le «anneau» et exposer les structures valvulaires. Retirez le myocarde et les régions de l'aorte proximale par taquiner doucement avec une pince. Identifier les feuillets de la valve en blanc, tissu dense sur le myocarde rose. Deta doucementCH L'cordages tendineux des valves auriculo-ventriculaires et enlever autant du myocarde reste possible. Soyez prudent de ne pas tirer ou gratter les feuillets de la valve pendant ce processus depuis CVE peuvent être délogés. Placez régions valvulaires taillés dans un tube de 1,5 ml Eppendorf contenant 1 ml de HBSS et garder sur la glace. REMARQUE: dissection minutieuse est essentielle pour éliminer les cellules endothéliales non valvulaires qui pourraient contaminer l'échantillon.
  2. Embryons: Sacrifice souris femelles 14,0 jours après prise de copulation est observée (le matin de prise de copulation = 0,5 jours).
    1. Immédiatement après le sacrifice, disséquer l'utérus (contenant des embryons) et laver à l'HBSS froid. Disséquer embryons individuels de l'utérus et enlever la vésicule ombilicale embryonnaire entourant chaque embryon. Retirer le cœur de chacun des embryons et suivez l'étape 2.1. (NOTE: pressant doucement l'embryon avec une pince juste en dessous des appendices supérieurs devraient contribuer à exposer le cœur et faciliter leur retrait.)
3. Cellule de dissociation et préparation pour FACS

  1. En utilisant des pointes de pipettes stériles, retirer HBSS du tube Eppendorf contenant les régions valvulaires.
  2. Remplacer avec 1 ml de tampon de dissociation et 4 pi DNase I.
  3. Faire tourner les tubes à 37 ° C pendant 7 min.
  4. Pipette de haut en bas 3 fois, puis laissez l'échantillon se contenter de 15 sec. Récupérer le surnageant (contenant les cellules dissociées) dans un tube conique de 15 ml.
  5. Pour arrêter la réaction de la collagénase, ajouter 125 ul de sérum de cheval sur le tube de collecte. Gardez tube de prélèvement sur la glace.
  6. Étapes de dissociation répétition (3.2 à 3.5) à neuf reprises pour recueillir des neuf fractions de surnageant.
  7. Passer le recueil fractionné à travers un filtre de nylon de 70 um dans un nouveau tube de collecte pour assurer une suspension cellulaire unique en éliminant tout débris et des touffes.
  8. Faites tourner la suspension à 400 g pendant 5 min à granulés les cellules.
  9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon de tri etgarder sur la glace jusqu'à ce que FACS.

4. FACS tri GFP CVE positif

  1. Réglez portes avant et en diffusion latérale à exclure les débris et de capturer des cellules individuelles; exclure les doublets en utilisant discrimination doublet déclenchement. Enregistrer l'échantillon de contrôle négatif et définir les paramètres de grille afin de comparer et définir précisément la population de cellules GFP-positives dans l'échantillon Tie-2-GFP.
  2. Analyser les cellules GFP-positives par FACS et affiner les paramètres de grille.
  3. Trier l'échantillon et Tie-2-GFP recueillir les cellules positives pour la GFP et GFP-négatif. Si les cellules seront utilisés pour l'extraction de l'ARN, en quelque sorte directement dans le tampon de tri. Pour les cellules en culture après FACS, collecter des cellules positives pour la GFP dans un tube stérile contenant 1 ml de médias VEC avec 1 ml de FBS, et de recueillir des cellules GFP négatifs en 1 ml de milieu non-endothéliales avec 1 ml de FBS. Utiliser cette combinaison support / 50% de sérum de 50% afin d'améliorer la viabilité des cellules. Garder sur la glace jusqu'à ce que l'analyse post-FACS.

5. Poster FACS analytis

  1. Extraction de l'ARN:
    1. Immédiatement après FACS, les cellules positives et négatives centrifugeuse GFP à 1500 g pendant 8 min.
    2. Pipette avec précaution le surnageant (tampon de tri) et jeter.
    3. Reprendre le culot cellulaire (pastille n'est pas visible pour les tailles d'échantillons recommandées ici) dans 200 ul Trizol.
    4. Congeler à -80 ° C ou commencer l'extraction phénol-chloroforme standard pour isoler ARNm total comme décrit précédemment par notre laboratoire 15.
    5. Utilisation de 50 à 200 ng d'ARN de synthèse d'ADNc en utilisant la Mastermix selon les instructions du fabricant.
    6. ADNc Sous réserve de l'amplification de la PCR quantitative en utilisant des sondes IDT Primetime qPCR contre des marqueurs de cellules endothéliales de la souris (CD31, facteur de von Willebrand (FvW)), marqueurs soupape de cellules interstitielles (α-actine musculaire lisse (α-SMA), Periostin (Postn)), des myocytes marqueurs (Mhc6, Mhc7) et GAPDH.
  2. La culture murin CVE:
    1. Après collecte et tri FACS de cellules (étape 4.3), les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min.
    2. Pipette avec précaution le surnageant (tri tampon + médias) et le jeter.
    3. Remettre en suspension le culot de cellules GFP-positive dans 1 ml de milieu VEC et le culot de la GFP-négatif dans 1 ml de média non-endothéliales.
    4. Plaque chaque échantillon dans un puits d'une lame de matière plastique et la chambre croître jusqu'à confluence. Culture pendant environ 1 semaine pour les cellules GFP négatives pour devenir confluentes et plus de 2 semaines pour les cellules GFP-positives à devenir confluentes (à partir d'un échantillon de 3 souris adultes). Changer de support tous les deux jours.
  3. La coloration par immunofluorescence:
    1. Retirez le support de cellules et de fixer dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant 30 min à température ambiante. Laver trois fois les cellules fixées pendant 5 minutes chacun dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Retirer les puits de la chambre de bloc de coulisseau et de sérum bovin à 5% d'albumine / 1x PBS pendant 1 heure à température ambiante.
    3. Incuberdiapositives O / N à 4 ° C avec des anticorps primaires (CD31, 1: 1000 ou l'actine musculaire lisse α (α-SMA), 1: 100). Laver 3 fois pendant 5 minutes dans du PBS.
    4. Diluer l'anticorps secondaire (Alexa Fluor 568-chèvre anti-rat) 1: 400 dans du PBS, ajouter des lames, et incuber 1 heure à température ambiante. Diapositives rinçage 3x pendant 5 min dans du PBS.
    5. Monter dans Vectashield contenant DAPI et incuber 1 h à 4 ° C avant de consulter.

Résultats

Les cellules Tie-2-GFP co-localisent avec des marqueurs de cellules endothéliales dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes.

Afin de confirmer la spécificité de l'expression de Tie2-GFP dans les CVE de souris embryonnaires et adultes, l'immunofluorescence a été réalisée pour déterminer la co-localisation avec le marqueur des cellules endothéliales, CD31 dans des coupes de tissus préparés à partir de E14.5 et de 3 mois adulte Tie2-GFP souris utilisant des méthodes antérieurement publiés par notre laboratoire 16. Comme le montre la Figure 1, CVE co-expriment la GFP (Figure 1 A, B, E, F) et CD31 (Figure 1 C, D, E, F) à la fois des adultes (figure 1 B, D, F) et embryonnaire ( Figure 1 A, C, E) étapes, donc de valider notre modèle pour l'isolement CVE ultérieure.

Analyse FACS identifié populations de cellules GFP-positives et GFP-négatif distinctes dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes isolés à partir de souris Tie-2-GFP.

Sauvage type souris C57 / BL6 ont été utilisés pour définir les paramètres de la GFP et environ 2% de cellules à un seul clapet de souris Tie-2-GFP montrent un enrichissement significatif dans les cellules GFP-positives par analyse FACS dans les deux échantillons embryonnaires et adultes (Figure 2). Basé sur des études de co-localisation de la figure 1, ces cellules sont comme des CVE et donnent un rendement moyen de 61 800 cellules totales (échantillons varient de 39,000-77,000 cellules / échantillon) dans des échantillons d'adultes (n = 3), et 8928 cellules (8,015- 11 000 cellules / litière) d'une portée d'embryons E14.5.

L'analyse par PCR confirme enrichissement de marqueurs de cellules endothéliales dans les cellules GFP-positives et des marqueurs des cellules interstitielles de soupape dans les cellules GFP-négatifs isolés à partir de souris Tie-2-GFP.

Gene analyse de l'expression des populations de cellules positives et négatives GFP par qPCR FACS suivants montrent des profils moléculaires distincts. Par rapport à la GFP populations de cellules isolées à partir d'embryons négatif Tie-2-GFP et adults, les cellules positives à la GFP sont enrichies pour l'expression de marqueurs de cellules endothéliales CD31 et vWF, (figure 3). En outre, l'expression des marqueurs de myocytes (Myh6, Myh7) dans ces populations de cellules est très faible, ce qui démontre une contamination minimale de cellules non-endothéliales. En revanche, les cellules GFP négatives isolées à partir de souris adultes Tie-2-GFP et les embryons de E14.5 sont enrichies pour vanne cellules interstitielles (VIC), marqueurs de cellules positives α-sma et Periostin (POSTN) relatives à la GFP. L'enrichissement de ces marqueurs est plus élevée dans les cellules GFP isolées à partir d'échantillons négatifs E14.5 chez les adultes due au phénotype quiescent de CIE adultes et par conséquent une faible expression des marqueurs activés.

des cellules GFP-positives isolées à partir de souris adultes Tie2-GFP peuvent être cultivées in vitro.

La capacité de la culture cellules GFP positifs et négatifs GFP isolées à partir des échantillons d'adultes a été examinée de based sur la morphologie des cellules et la coloration immunohistochimique. En utilisant les protocoles précédemment décrits par 17 nous nous montrons dans la figure 4 que les cellules positives à la GFP apparaissent tour à morphologie (figure 4A) et de co-exprimer la GFP avec le marqueur de cellules endotheliales CD31 après deux semaines en culture (Figure 4C). En revanche, les cellules non-endothéliales sont négatifs pour la GFP, en affichant une morphologie analogue à mésenchymateuses (figure 4B) et d'exprimer le marqueur VIC α-SMA au bout de neuf jours (Figure 4D).

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Figure 1: des cellules Tie-2-GFP-positives co-localisent avec CD31 dans les valves cardiaques embryonnaires et adultes. Immunofluorescence pour afficher association de (Tie2-) expression de la GFP (A, B) avec le marqueur de cellules endotheliales, CD31 (C, D) dans les septal folioles de la valve mitrale à E14.5 (A, C, E) et adulte (B, D, F) étapes. La région de la vanne est mise en évidence dans A, C, E. (E, F) des images fusionnées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: CVE Tie-2-GFP-positives peuvent être identifiés par FACS. Comparativement aux témoins C57 / BL6 appariés selon l'âge (A, C), vannes isolées à partir d'embryons Tie-2-GFP (B) et les adultes (D) contiennent une GFP distincte population de cellules positives, comme indiqué dans le vert. événements GFP-négatives, en rouge ont été collectées en tant que témoin. Les chiffres entre (B) et (D) indiquent la moyenne% de la GFP-pcellules ositive du nombre total d'événements triés par FACS (n = 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3: les cellules GFP-positives sont enrichies pour des marqueurs de cellules endothéliales alors que les cellules GFP-négatives expriment des gènes associés à des cellules interstitielles de soupape. Représentatif qPCR de marqueurs de cellules endothéliales (CD31, facteur de von Willebrand (vWF)) et adultes (Myh6) et fœtales ( Myh7) des marqueurs de myocytes dans les cellules GFP-positives isolées à partir de régions valvulaires du E14.5 (A) et adulte (B) de souris Tie-2-GFP. Remarque enrichissement de marqueurs de cellules endothéliales et de très faibles niveaux de gènes associés à des myocytes. (C, D) Plier changes dans l'expression des marqueurs des cellules interstitielles de valve α-sma et Postn dans les cellules GFP-négatif isolés à partir de E14.5 (C) et adulte (D) souris Tie-2-GFP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4 cellules Tie-2-GFP-positives maintenir l'expression des marqueurs des cellules endothéliales in vitro. FACS suite, GFP positive (A, C) et négatif (B, D) des populations de cellules de souris adultes ont été cultivées jusqu'à confluence et soumis à éliminer l'imagerie de contraste (A, B) et immunomarquage fluorescent (C, D). des cellules GFP-positives expriment CD31 (en rouge) (C) après10 jours de culture. En revanche, l'expression de GFP n'a pas été détecté dans la population de cellules négatives, une coloration positive pour laquelle α-SMA, un marqueur de la CIE activés (D).

Discussion

Nous décrivons ici pour la première fois, une nouvelle méthode pour l'isolement des CVE murines embryonnaires et adultes de souris Tie-2-GFP. Bien que cette lignée de souris a été largement utilisé pour l'isolement des populations de cellules endothéliales, ce rapport est le premier montrant isolement sélectif des CVE. En raison de la fragilité de la population CVE, nous avons développé un protocole rigoureux qui permet l'isolement d'une cellule unique de la GFP positive (GFP et négatif) des cellules de valves cardiaques de souris embryonnaires et adultes. Par rapport à l'édition originale en utilisant des embryons ou des organes entiers de Tie-2-GFP souris 14, nous avons optimisé les étapes de la collagénase et dissection basé sur la faible abondance de cette population de cellules endothéliales fragile pour isoler une population sélectionnée de cellules.

Isolements CVE ont déjà été observés que dans les grands modèles animaux avec des outils génétiques et biomoléculaires limitées. Ces outils sont bien établis chez la souris et, par conséquent, la abilité d'isoler CVE murins permet un ensemble élargi de modèles expérimentaux d'être utilisés pour la recherche d'une valve cardiaque. Par conséquent, un avantage important de cette approche est que les CVE peuvent être isolés dans le temps à partir de souris de type sauvage, et des modèles de maladies de la vanne et des blessures. Un deuxième avantage est que les CVE peuvent être isolés et analysés presque immédiatement après la dissection, la préservation des profils d'expression qui reflètent la situation in vivo de façon plus précise. De plus, ce protocole d'isolement est suffisant pour éliminer la culture de cellules pour l'expansion du nombre et donc des changements phénotypiques potentiels induits par l'environnement in vitro sont empêchés.

Malgré les nouveautés et les avantages de ce protocole expérimental, nous reconnaissons que les restrictions existent encore. Tout d'abord, la taille de la population à l'intérieur des vannes de souris VEC est très faible et, par conséquent, de multiples portées embryonnaires temporisés sont nécessaires afin de produire l'ARN suffisante pour l'analyse de l'expression génique. Bien this peuvent être surmontés en utilisant plusieurs éleveurs, cela pourrait avoir un impact sur l'application de certains outils d'analyse post-isolement. Cette limitation a été un défi particulier pour l'établissement de cultures confluentes de CVE GFP-positives afin d'effectuer des analyses plus poussées des phénotypes CVE y compris les profils moléculaires et des tests fonctionnels. Par conséquent, nous reconnaissons que tous les difficultés ont été surmontées par notre approche mais c'est un domaine d'intérêt que nous nous efforçons de surmonter.

Cette approche de l'isolement des régions CVE valvulaires introduit la possibilité de contamination de Tie-GFP cellules endothéliales -positif, non valvulaires de l'endocarde, ou des structures vasculaires dans le myocarde ventriculaire. À ce jour, distinction moléculaire des CVE des autres populations de cellules endothéliales cardiaques n'ont pas été identifiés. Toutefois, une région activatrice du gène NFATc1 a été identifié et montré un étiquetage spécifique des CVE qui ne le font passubir EMT, et aucune autre population de cellules endothéliales dans le coeur 18. En tant que modèle Cre (NFATc1 encre) est disponible, les études futures pourraient utiliser la spécificité de cette ligne afin de minimiser les risques de contamination. En plus des cellules positives pour Tie-2-GFP non-valvulaires, il existe toujours la possibilité de contamination de myocytes à l'endroit où les feuillets de la valve se fixent à la région annulaire de la septal et des parois murales myocarde. En données non présentées ici, nous avons d'abord commencé des études d'isoler CVE des régions valvulaires disséqués en utilisant des billes d'anticorps conjugué revêtues d'anti-GFP et anti-CD31. Bien que cette approche a réussi à isoler les cellules endothéliales, nous avons connu l'agglutination cellulaire significative de types de cellules adjacentes, non-endothéliales et donc CIV et les cellules myocardiques contaminé notre échantillon expérimental. Cela a pu être évité en utilisant une analyse FACS comme paramètres ont été définis pour isoler seulement suspension cellulaire uniques et l'analyse par PCR pour détecter l'expression de gènes spécifiques des myocytes est contrôlée pour cette limitation (figure 3). Bien que notre contamination peut être considéré comme un minimum, il reste une complexité expérimentale potentiel qui pourrait être évité à l'avenir avec la double sélection de la GFP et des marqueurs de surface spécifiques des cellules endothéliales.

En utilisant ce protocole, nous avons réussi à isoler les CVE de souris et ont donné des exemples de la façon dont cette approche peut être utilisée pour l'isolation de l'ARN et de la culture de cellules de populations de cellules positives et négatives GFP GFP embryonnaires et adultes. Toutefois, cette approche n'est pas limitée à ces applications et peut être utilisé pour une grande variété d'approches moléculaires, cellulaires et fonctionnels. En outre, le fond Tie-2-GFP peuvent être élevés avec des modèles génétiques de souris qui permettront d'études comparatives des populations CVE santé et la maladie. Le développement de cette nouvelle méthodologie, pour la première fois, permettre des études cibléesl'examen de la contribution des CVE dans le développement de la vanne et de l'entretien et pourrait révéler des mécanismes précédemment méconnus de la maladie de la valve dépendante de l'endothélium.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Comprehensive Cancer Center analytique cytométrie de base installation Ohio State University, en particulier Katrina Moore, de l'assistance technique à l'analyse FACS. En outre, nous reconnaissons le Dr William Pu et son groupe pour leurs connaissances scientifiques. Ce travail a été soutenu par le NIH HL091878 (JL) et le Centre de cardiologie à l'Hôpital pour enfants de Nationwide.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 568 Chèvre Anti-Rat IgG (H+L)Life TechnologiesA-11077
70 &mu ; m passoire cellulaire en nylonBD Falcon352350
2,5 % TrypsineInvitrogen LT15090-046
Albumine sérique bovine (BSA), fraction V, traitée par choc thermiqueFisher ScientificBP1600-100
CD31 anticorps anti-souris pour ratBD Pharmingen553370
Sérum de pouletInvitrogen LT16110-082
Collagénase IVInvitrogen LT17104-019Préparé selon les instructions du fabricant
DNase I, sans RNase (10 000 unités)Roche4716728001
EBM-2LonzaCC3156Pour média VEC
EDTA, 0,5 M Solution  ;Hoefer03-500-506
EGM2 SingleQuot, BulletkitLonzaCC-4176Pour milieu VEC
Sérum de veau fœtal (FBS), Hyclone inactivé par la chaleurSH3007103IH
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025-092
Sérum de chevalInvitrogen LT16050-130
Four d’hybridationVWR230301V
Medium 199 1XCorning cellgro10-060-CV
Paraformaldéhyde 16 % Solution EM gradeMicroscopie électronique Sciences15710
Pen/StrepMP-BiomedICN1670049
Permanox lame de chambre stérile avec couvercleThermo-Scientific177429
Saline tamponnée au phosphate, 1XCorning cellgro21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR AssayIntegrated DNA TechnologiesActa2 (&alpha ;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
SuperScript VILO MastermixInvitrogen LT11755050
[en-tête]
Tie2-GFP sourisJackson Laboratories3658
Pince à tissus #5 11 cmDumont14096
TrizolAmbion15596018
&alpha ;-SMA anticorps anti-souris  ;Sigma-AldrichA2547
VECTASHIELD HardSet Support de montage avec DAPIVector LaboratoriesH-1500

Références

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