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Article de méthode

Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

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DOI :

10.3791/51879

⸱

29 janvier 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons les procédures pour l'étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d'eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l'extraction de l'acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l'achèvement préalable de génotypage.

Résumé

Analyse à haute résolution de la morphologie et la fonction des neurones de mammifères nécessite souvent le génotypage des animaux individuels, suivie par l'analyse des cultures primaires de neurones. Nous décrivons un ensemble de procédures pour: l'étiquetage souriceaux nouveau-nés pour être génotypés, le génotypage rapide, et l'établissement de cultures à faible densité de neurones du cerveau de ces souris. Souris individuels sont repérés par le tatouage, ce qui permet une identification à long terme durable à l'âge adulte. Génotypage par le protocole décrit est rapide et efficace, et permet l'extraction automatisée des acides nucléiques avec une bonne fiabilité. Ce est utile dans des circonstances où le temps suffisant pour le génotypage conventionnelle ne est pas disponible, par exemple, chez les souris qui souffrent de létalité néonatale. Cultures de neurones primaires sont générés à faible densité, qui permet des expériences d'imagerie à haute résolution spatiale. Cette méthode de culture nécessite la préparation de couches nourricières gliales avant le placage neuronale. Le pPROTOCOLE est appliquée dans sa totalité à un modèle de souris de la dystonie trouble du mouvement DYT1 (souris knock-in-torsinA AE), et les cultures neuronales sont préparées à partir de l'hippocampe, le cortex cérébral et le striatum de ces souris. Ce protocole peut être appliqué à des souris avec d'autres mutations génétiques, ainsi que pour d'autres espèces d'animaux. En outre, les composants individuels du protocole peut être utilisé pour les sous-projets isolés. Ainsi ce protocole aura de larges applications, non seulement en neurosciences, mais aussi dans d'autres domaines des sciences biologiques et médicales.

Introduction

des modèles de rongeurs de maladies génétiques se sont révélés utiles dans l'établissement des fonctions physiologiques normales de protéines et d'acides nucléiques, ainsi que les conséquences pathophysiologiques de défauts de ceux-ci. Des exemples comprennent les souris déficientes pour des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires clés, ainsi que des modèles murins de maladies telles que la maladie d'Alzheimer. Cependant, certaines manipulations génétiques peuvent conduire à létalité néonatale peu ou quelques jours après la naissance. Dans ces cas, des cultures de cellules primaires sont un outil important parce que les cellules vivantes peuvent être obtenus auprès des chiots embryonnaires ou néonatales avant la mort, ils peuvent être conservés pendant au moins quelques semaines in vitro, et pendant ce temps le développement neuronal début peuvent être suivies par expériences biochimiques, morphologiques et fonctionnelles. Pour les cultures primaires, il peut être bénéfique à l'assiette les neurones à faible densité; ce qui permet de visualiser le soma individuel, dendrites, arbres axonales et le nerf termisignaux à haute résolution spatiale. Toutefois, la survie et la différenciation des neurones à faible densité nécessite généralement qu'ils sont étalées sur une couche nourricière gliale, co-cultivées avec des cellules gliales en l'absence de contact physique avec eux, ou cultivées dans du milieu conditionné par des cellules gliales 1.

L'établissement de faible densité des cultures de neurones sur des couches nourricières gliales peut dépendre rapide et fiable génotypage préalable - dans un peu d'heures à la différence de quelques jours. La vitesse est particulièrement importante lorsque le génotype neuronal doit être adaptée à celle d'une couche d'alimentation gliale préparé à l'avance. A titre d'exemple plus pratique, il peut être nécessaire de décider lequel des chiots qui génotype à utiliser dans des cultures de production, afin d'optimiser l'efficacité d'une expérience.

Ici, nous démontrons le protocole de travail qui a été utilisé pour le génotypage de la souris rapide, simplifiée et fiable dans les publications précédentes 2-6. Queues de souris etun kit disponible dans le commerce sont utilisés. Ce protocole comprend une seule étape d'extraction d'acides nucléiques à partir du tissu, et ne nécessite ni une étape de purification des acides nucléiques, ni l'utilisation d'un tampon de terminaison («stop solution"). La fiabilité de cette méthode de génotypage est illustré en présentant les résultats d'une série d'essais lorsque des différences sont introduites par rapport à la quantité de départ des échantillons, l'âge de l'animal et la longueur des amplicons PCR. Ce kit offre les avantages de l'extraction et la fiabilité automatisé.

Par souci d'être complet, l'utilisation du tatouage d'identification à long terme des souris génotypés est également démontrée. Le tatouage est réalisé par application d'une encre de tatouage dans le derme de la peau (sous l'épiderme) 7. Un procédé est décrit pour le tatouage les coussinets des pattes de souris nouveau-nés ou de vieux un jour, bien que les tatouages ​​peuvent être appliqués à d'autres parties du corps, telles que les queues et les orteils, et animals de tous âges. En outre, les procédures seront montrées pour le placage et la culture de neurones de souris à une faible densité, sur la base de la préparation optimisée des différents types de couches nourricières gliales 2,8.

On utilise un modèle de souris génétique du trouble neurologique héréditaire DYT1 dystonie - un trouble du mouvement autosomique dominante causée par une mutation dans le gène de TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La protéine codée, torsinA, fait partie des "ATPases associées à diverses activités cellulaires" (AAA +) de la famille des protéines, dont les membres accomplissent généralement des fonctions de chaperon, en aidant à: dépliement des protéines, la protéine complexe de démontage, le trafic membranaire, et la fusion des vésicules 10-13. Les résultats de mutation dans une délétion en cadre d'un codon pour l'acide glutamique, et peuvent conduire à la manifestation de «l'apparition précoce de la dystonie généralisée isolé» 14,15. Cependant, la voieophysiological mécanismes responsables de cette maladie sont encore mal compris. Dans un modèle de souris knock-in, l'allèle mutant est Tor1a tm2Wtd, mentionné ci-après comme Tor1a AE. Hétérozygote AE-torsinA souris knock-in sont des patients humains viables et génétiquement imitent avec DYT1 dystonie, alors homozygote souris knock-in meurent après la naissance 16,17, avec la latence à mort postnatale touchés par bagage génétique 18. La mort précoce de souris knock-in homozygote nécessite que tant l'analyse génotypique des animaux et l'établissement de cultures de neurones sont achevées rapidement. Comme autre exemple de génotypage, TFAP2A (facteur de transcription AP-2α, la protéine de liaison d'activation activateur 2α) sera utilisée. La protéine codée par ce gène est important dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la survie et l'apoptose 19.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Iowa.

1. identification à long terme des souris en utilisant tatouage les coussinets

  1. Immobiliser une patte avec le coussinet (surface plantaire) face à l'expérimentateur. Maintenez la patte avec le pouce et l'index. Veillez à ne pas pincer la patte.
    NOTE: Stable immobilisation est important de veiller à ce que le pigment de tatouage est placé dans le derme de la coussinet, et est donc permanent 7.
  2. Badigeonner le coussinet avec 70% d'éthanol sur une éponge ou un tampon de gaze.
  3. Appliquer de l'huile de la peau pour un applicateur de coton-tige, et appuyez doucement la pointe contre la surface de la tablette de la patte à plusieurs reprises. Utilisez seulement une petite quantité d'huile de la peau; lorsqu'il est présent en grandes quantités, elle permet d'éviter le pigment de tatouage d'atteindre la peau.
  4. Tremper les pointes des aiguilles de tatouage dans l'encre de tatouage juste avantau tatouage. Utilisez propre, aseptique et aiguilles de tatouage pointus, à diminuer la douleur et la possibilité de l'infection, et aussi pour augmenter l'efficacité de tatouage.
  5. Bien que la surface de coussinet est couvert avec l'huile de la peau, appuyez sur les pointes d'aiguilles de tatouage verticalement et légèrement contre la peau dans le centre du pavé de la patte, et injecter l'encre plusieurs fois. Voir la Table des Matières / Equipement pour informations sur le système de tatouage électrique.
  6. Vaporiser éthanol à 70% sur une éponge de gaze, appuyez doucement contre la patte pour enlever le pigment de tatouage supplémentaire sur la surface de la peau, et d'inspecter la qualité de tatouage. Vérifiez que le milieu de coussinet a une tache ronde sombre qui diffère de la pigmentation de la peau normale. Si le tatouage ne est pas sombre ou assez grand pour le visionnement facile, répétez les étapes de tatouage antérieures.

2. Les souris nouveau-nés génotypage utilisant un kit de génotypage PCR rapide

  1. Désinfecter l'extrémité distale d'une queue de souris avec 70% d'éthanol, couper 5 mm ou moins de la queueincliner et de le transférer dans un tube d'une bande de 8 tubes du type utilisé pour la PCR. Utilisez une lame de rasoir de non-utilisé pour chaque chiot à éviter la contamination croisée entre les spécimens. Sinon, utilisez une paire de ciseaux, mais dans ce cas, avec soin et enlever complètement le tissu restant sur les lames en utilisant 70% d'éthanol. Vérifiez saignement. En cas de saignement, appliquer une pression sur la partie de coupe de la queue avec une éponge de gaze jusqu'à ce saignement se est arrêté.
  2. Ajouter 200 pi de solution d'extraction de l'ADN à chaque tube PCR contenant un spécimen. Voir la Table des Matières / Equipement pour sa composition et des informations sur le kit.
  3. Placer la bande tubulaire dans un cycleur thermique de PCR, et démarrer l'extraction d'ADN en utilisant le programme suivant: 1 cycle à 55 ° C pendant 10 min, 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, et maintien à 4 ° C.
    NOTE: Ce est le même cycleur thermique PCR qui est ensuite utilisé pour la PCR.
  4. Après l'extraction d'ADN est terminée, retirez la bande de tube de l'un cycleur thermiquee inverser 5 fois.
  5. Transfert 4 pi de la solution (extrait d'ADN) de chaque échantillon à un non utilisés tubes d'une bande 8 tube, et mélanger avec: 10 pi de 2X PCR Ready Mix II, 2 pi de mélange de l'avant et marche arrière amorces (recommandé au 0,5 uM; voir le tableau des matériaux / équipement pour les séquences), et 4 pi de sans nucléase H 2 O, pour chaque spécimen. Centrifuger brièvement (par exemple, 3 sec) à l'aide d'une centrifugeuse de table. Gardez les tubes sur la glace en tout temps, sauf lors de la manipulation.
  6. Effectuer le cyclage thermique. Voir Table des Matières / Equipement pour le programme thermique.
  7. Détecter les produits d'ADN amplifiés. Charger la solution de réaction totale de la PCR (20 ul) directement dans un puits de gel d'agarose. Charger les marqueurs de poids moléculaire dans un puits séparé. Appliquer un champ électrique.
  8. Acquérir les images de fluorescence des bandes sous une lumière ultraviolette.

3. Culture primaire de cerveau de souris Neurons sur gliales Feeder couche

REMARQUE: Les procédures de dissection du cerveau et de la dissociation de la cellule (3,1) sont communs à toutes les procédures ultérieures. Les procédures de cultures gliales de la souris (3,2), cultures de cellules gliales de rat (3,3), et des cultures de neurones de souris (3,4) sont décrits séparément par la suite.

  1. Dissection du cerveau et cellulaire Dissocaiation
    1. Sacrifiez une souris ou rat chiot par décapitation, retirez rapidement le cerveau, et le placer dans une solution de Hanks (voir le tableau 1 pour la composition) + 20% de sérum de veau fœtal (FBS) dans une boîte de 35 mm (conservé dans la glace).
    2. Couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères. Retirer la région d'intérêt (par exemple, le cortex cérébral, le striatum et hippocampe) de chaque hémisphère de cerveau. Retirez les méninges et les principaux vaisseaux sanguins de la surface. Couper la région du cerveau en 4-10 fines tranches à l'aide d'une lame chirurgicale.
    3. Rincer les tranches de cerveau dans un tube à centrifugation de 15 ml, une fois espritLa solution de + 20% de FBS, puis 3 fois avec de l'Hanks h la solution de Hanks (ie sans sérum) (le tout à 4 ° C). Pour rincer, ajouter 5-10 ml de solution, laisser le cerveau tranches se déposent au fond du tube, aspirer la solution par le haut, et ajouter une solution fraîche. Terminez la procédure de rinçage par aspiration de la solution.
    4. Filtre à 2 ml de la solution de digestion contenant de la trypsine (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube contenant les tranches de cerveau. Laissez le trypsinisation dérouler pendant 13 min à température ambiante.
    5. Neutraliser la solution de trypsine première par aspiration la plus grande partie, puis en ajoutant 7 à 10 ml d'une solution de Hanks + 20% de FBS (4 ° C).
    6. Rincer les tranches de cerveau, deux fois avec une solution de Hanks + 20% de FBS, puis trois fois avec la solution de Hanks (sans sérum) (le tout à 4 ° C). Terminez la procédure de rinçage par l'aspiration du solution.
    7. Filtre à 2 ml de la solution de dissociation (voir le tableau 1 pour la composition) en utilisant une seringue de 3 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement dans le tube avec les tranches de cerveau.
    8. Mécaniquement dissocier les cellules par trituration doucement 10-20 fois, jusqu'à ce que les morceaux de tissu visibles disparaissent. Utilisez une pipette Pasteur polie au feu coton branché et éviter de faire des bulles lors de la trituration.
    9. Attendre 3 min pour les petites pièces se installer.
    10. Transférer la majorité de la solution (~ 1,5 ml, ce qui laisse une solution en bas) à un tube de 15 ml de centrifugation qui contient 3 ml de solution de Hanks solution de FBS + 20% (4 ° C), en utilisant le coton branché, au feu polie pipette Pasteur. Ne pas transférer toute la solution parce que l'inclusion de tout sédiment au fond se traduit généralement par la détérioration de la culture.
    11. Centrifugeuse pour 13 min à ~ 185 g (~ 1100 rpm) à 4 ° C.
    12. Aspirer délicatement le surnageant,ajouter 1 ml de pré-chauffé milieu d'étalement (37 ° C) de la pastille, et remettre en suspension en pipetant doucement plusieurs fois en utilisant le coton branché, polie au feu pipette Pasteur.
      REMARQUE: Trois types de milieux d'étalement différents sont utilisés à différentes fins de culture: placage moyen 1 pour les cellules gliales de la souris, le placage moyen 2 pour les neurones de souris, et le placage à moyen 3 de neurones de rat et de cellules gliales (voir le tableau 1 pour des compositions) .
    13. Sortez 10 ul de la suspension cellulaire, mélanger avec 10 pi de solution de bleu de trypan 0,4%, et de mesurer la densité de cellules vivantes, en utilisant soit un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé.
  2. Cultures souris gliales
    1. Laver les lamelles pour aider à établir des cultures saines de cellules de souris.
      1. Plonger des lamelles de verre (rond, diamètre 12 mm) dans de l'acide nitrique à 70% dans une boîte de Pétri en verre. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium, et le placer sur une orbitale agitateur O / N.
      2. Rincer le coversli de verreps dans la boîte de Pétri au moins trois fois à l'eau distillée. Plongez-les dans de l'eau distillée. Placer le plat sur un agitateur orbital O / N.
      3. Sécher les lamelles sur un papier filtre Whatman 150 mm dans le cabinet de sécurité biologique.
      4. Autoclave les lamelles.
      5. Placez les lamelles dans 24 puits boîte de culture.
    2. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    3. Obtenir les cellules du cerveau des souriceaux, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: L'utilisation du cortex cérébral est typique pour préparer la couche souris gliale d'alimentation. Toutefois, d'autres régions du cerveau, telles que l'hippocampe et le striatum, travailleront après ajustement approprié de la densité cellulaire en raison de différents nombres et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    4. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage moyen 1 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml). Pour pré-réchauffement des milieux de culture, placer la solution dans l'incubateur de culture (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, àlaisser les valeurs de température et de pH se stabilise.
    5. Transférer la suspension cellulaire à un flacon de culture T25 non couché, en utilisant le coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans l'incubateur de culture.
    6. A un jour in vitro (DIV), rincer les cellules en culture dans le flacon T25 à deux reprises avec une moyenne de placage (4 ° C). Placer le ballon de nouveau dans l'incubateur. Effectuer rinçage par aspiration du milieu dans le flacon complètement avec une pipette Pasteur, en ajoutant environ 5 ml de milieu frais et en inclinant doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant.
    7. À 6-9 DIV, (ce est à dire, un jour avant la trypsine et le placage sur des lamelles, dans les étapes 3.2.8-3.2.13), placer 100 pi du matériau de revêtement avec des protéines de la matrice extracellulaire (voir le tableau des matériaux / équipement pour les commentaires sur le matériau de revêtement) sur les lamelles de verre dans une boîte de culture, et placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
    8. A 7-10 DIV, lorsque les cellules sont 20-40% de confluence (spatialement continue), Trypsiniser eux.
      1. Rincer la fiole une fois, tout en aspirant la solution dans le ballon et l'ajout de ~ 13 ml d'une solution de Hanks (4 ° C), incliner doucement le flacon plusieurs fois en un mouvement tourbillonnant, et aspirer la solution totalement.
      2. Ajouter 40 ul de solution de DNase (concentration finale de 750 unités / ml) à 4 ml de solution de trypsine-EDTA, passer la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 um, et ajouter le filtrat directement aux cellules dans le flacon.
      3. Laissez le trypsinisation procéder pour 13 min à 37 ° C dans l'incubateur.
      4. Neutraliser la solution de trypsine par addition de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) dans le ballon.
      5. Transférer les cellules trypsinisées dans un tube de 15 ml par centrifugation en utilisant un cycle de 5 à 10 ml pipette, ajouter ~ 4 ml d'une solution de Hanks + 20% FBS (4 ° C), centrifuger à ~ 185 g et 4 ° C pendant 13 min et aspirer le surnageant.
    9. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de la pré-warmeune moyenne d placage.
    10. Mesure de la densité des cellules selon l'étape 03.01.13.
    11. Aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre et la plaque ~ 50 ul des cellules gliales remises en suspension sur des lamelles.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    12. Placer la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur.
    13. 20-60 min plus tard, ajouter 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1 dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur. Remarque: Bien que le moyen de plaquage est ajouté, il sera utile d'utiliser une autre pipette à appuyer sur la périphérie de la lamelle (où il n'y a pas de cellules étalées), de sorte que la lamelle couvre-objet ne sera pas flotter dans le milieu.
    14. A une DIV de la couche d'alimentation gliale (par exemple, sur la lamelle de verre), remplacer le milieu par 1 ml de pré-chauffé placage moyen 1, en ​​aspirant la totalité de la solution dans un puits et en remplissant ensuite avec du milieu frais.
    15. À 2-3 DIV de la couche d'alimentation gliale lorsque le cells sont de 80 à 100% de confluence, ajouter un inhibiteur mitotique (10 ul d'un mélange de 5-fluoro-2'-désoxyuridine + uridine; des concentrations finales de 81,2 et 204,8 uM, respectivement) dans chaque puits, pour inhiber la replication de l'ADN et donc à supprimer la prolifération cellules gliales.
    16. A 9.7 DIV, lorsque les cellules sont confluentes à 90 à 100% (2/1 h avant l'étalement des neurones sur la couche d'alimentation des cellules gliales), remplacer le milieu de culture préchauffé avec placage moyen-2 (37 ° C).
      REMARQUE: Les neurones sont étalées sur le même jour, en utilisant l'étape 3.4.
  3. Cultures Rat gliales
    1. Manteau de un flacon de culture T25 avec le même matériau de revêtement.
      NOTE: Ceci est nécessaire pour le retrait ultérieur de cellules non-adhérentes à l'étape 3.3.5.
      1. Ajouter 2,0 ml de la matière de revêtement dans le ballon, et placer le ballon dans un incubateur de culture.
      2. Après 3/2 heure, aspirer le matériau de revêtement complètement, de telle sorte que la surface du ballon devient sec.
    2. Obtenir les cellulesdes ratons, selon l'étape 3.1.
      REMARQUE: La région CA3-CA1 de l'hippocampe est utilisé pour préparer la couche d'alimentation gliales de rat. Toutefois, d'autres régions du cerveau, comme le cortex cérébral et le striatum, travailleront après ajustement des différences de densité cellulaire due à différents numéros et les rendements des cellules provenant de différentes régions.
    3. Ajouter ~ 4 ml de pré-chauffé placage à moyen 3 de la suspension cellulaire finale (~ 1 ml).
    4. Transférer la suspension cellulaire dans le flacon de culture T25 revêtu, à l'aide de coton-branché, polie au feu pipette Pasteur. Placer la fiole dans un incubateur de culture (5% de CO 2 95% de O 2, 37 ° C).
    5. À 2-3 DIV, lorsque les cellules sont 20 à 40% de confluence, retirez non adhérente ou faiblement cellules adhérentes, en fermant le couvercle bien en agitant vigoureusement ~ 10 fois, aspiration de la solution, et en ajoutant 4-5 ml de plaquage moyen 3 (à 4 ° C). Répétez cette procédure une fois. Examiner les cellules cultivées à travers tout l'étage du flacon (par exemple,en utilisant un microscope à contraste de phase) pour confirmer que ceux qui apparaissent neuronale (par exemple, ceux pour lesquels le bord extérieur du corps de la cellule apparaît phase claire) sont complètement enlevés. Répétez la procédure aussi souvent que nécessaire pour supprimer ces cellules, puis retourner le ballon à l'incubateur.
      NOTE: La force et le nombre total de «shakes» requises peuvent différer entre les expérimentateurs individuels. La chose importante est de ne pas garder le nombre total de shakes à un numéro de série, mais pour confirmer que les cellules analogues à des neurones sont éliminés.
    6. À 6-8 DIV, lorsque les cellules sont de 90 à 100% de confluence, les passage des cellules gliales en les trypsinisation comme à l'étape 3.2.8.
    7. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), ajouter 10 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), transférer les cellules trypsinisées dans un flacon T75 non revêtu, et la culture eux l'incubateur.
      REMARQUE: les cellules gliales de rat seront repiquées deux fois; En revanche, les cellules gliales de la souris are des passages qu'une seule fois, car ils deviennent insalubres après de multiples passages. Les cellules gliales de rat seront soumises à des passages dans des flacons T75 qui ne sont pas revêtues avec ne importe quel matériau de revêtement. Le revêtement permet aux cellules gliales de rat de grandir trop vite et donnent de nombreuses cellules ciliées (cellules épendymaires putatifs), qui se détérioreront la condition de culture neuronale plus tard.
    8. À 17-19 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 11 jours après repiquage, et un jour avant traitement à la trypsine et placage sur des lamelles par étapes 3.3.9-3.3.14), placer 100 ul de la matière de revêtement sur ​​des lamelles de verre non lavés ( rond, diamètre 12 mm) dans une boîte de culture, et de placer la boîte de culture dans l'incubateur de culture.
      NOTE: Pour les cultures gliales de rat, une différence n'a pas été remarqué dans les résultats de la culture avec ou sans se laver les lamelles.
    9. À 18-20 DIV de culture dans un flacon gliale (par exemple, 12 jours après repiquage), préparer la couche d'alimentation gliale par trypsinisation des cellules en culture, selon la rep 3.2.8.
    10. Pendant la centrifugation, aspirer le matériau de revêtement complètement des lamelles de verre.
    11. Après centrifugation, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C), et mesurer la densité de cellules, selon l'étape 03.01.13.
    12. Ajuster la densité des cellules gliales à 10 4 cellules / ml en direct, et la plaque 100 pl de la suspension de cellules gliales sur les lamelles de verre revêtues.
      NOTE: Ces cellules vont établir la couche d'alimentation gliale.
    13. Placez la boîte de culture avec des lamelles dans l'incubateur pour les 20-60 min.
    14. Ajouter 1 ml de milieu d'étalement-3 (4 ° C) dans chaque puits, et placez le plat dans l'incubateur.
    15. A 4.3 DIV de la couche d'alimentation gliale, lorsque les cellules sur la lamelle sont de 40 à 80% de confluence, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (voir le tableau 1 pour la composition) qui contient la cytosine β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentration finale de 4 pM) pour arrêter la prolifération des cellules gliales. Plate neurones à 9.7 DIV de la couche d'alimentation lorsque les cellules gliales sont 60 à 80% de confluence, en utilisant l'étape 3.4.
  4. Cultures souris neuronaux
    1. Souriceaux nouveau-nés d'étiquettes et de génotype selon les étapes 1 et 2.
    2. Utilisez les souriceaux pour l'étape 3.1.
    3. Ajuster la densité de la suspension des cellules vivantes à 2,0 x 10 ~ 5 cellules / ml en utilisant préchauffé placage moyen 2 pour le placage sur les cellules gliales de la souris, ou à l'aide de placage moyen 3 pour le placage sur des cellules gliales de rat.
    4. Plaque les cellules sur la couche nourricière gliale, en ajoutant doucement la suspension de cellules dans le milieu de culture de chaque puits. Remarque: Le volume de la suspension cellulaire à ajouter est déterminée par le nombre cible de cellules dans un puits de culture. Par exemple, plaque de ~ 60 pi de suspension de cellules pour atteindre 12 000 cellules / puits.
    5. Notez qu'aucune modification de solutions sont nécessaires après que les neurones sont étalées. Soyez prudent pour éviter l'évaporation de la solution dans les puits au cours de la culture, en humidifiant l'intérieur of l'incubateur de culture.

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Résultats

Comme exemple de l'application de ce protocole, des résultats représentatifs sont présentés pour l'étiquetage des souris par le tatouage, le génotypage fiable dans diverses conditions expérimentales, et l'établissement de cultures de neurones primaires sur des couches nourricières gliales.

Tatouage

Les nouveau-nés ont été marqués sur les coussinets en utilisant un système de tatouage ('nouveau-né' de la figure 1). Les étiquettes ...

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Discussion

Le protocole présenté ici inclut des procédures pour le tatouage d'étiqueter / identifier les souris, pour le génotypage des souris de conseils de la queue, et pour la culture de neurones du cerveau de la souris à faible densité. Dans une série d'expériences utilisant 6-8 chiots, ces procédures exigent généralement ~ 0,5 h, ~ 4 h et ~ 2 heures, respectivement, à un total de 6-7 heures. Cela rend pratique pour une seule expérimentateur pour terminer toutes les procédures nécessaires à partir du moment de la naiss...

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Déclarations de divulgation

L’auteur (Zhengmin Huang) est le président d’EZ BioResearch LLC qui produit les réactifs décrits dans cet article.

Remerciements

Les auteurs remercient les chercheurs de l’Université de l’Iowa, les Drs Luis Tecedor, Ines Martins et Beverly Davidson pour leurs instructions et leurs commentaires utiles concernant les cultures striatales, ainsi que les Drs Kara Gordon, Nicole Bode et Pedro Gonzalez-Alegre pour l’aide et les discussions sur le génotypage. Nous remercions également le Dr Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) pour ses commentaires utiles concernant le tatouage, et le Dr Shutaro Katsurabayashi (Université de Fukuoka) pour ses commentaires utiles concernant la culture de la souris. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association, du ministère de la Défense (prix du programme de recherche médicale évalué par les pairs W81XWH-14-1-0301), de la Fondation de recherche médicale sur la dystonie, de la Fondation Edward Mallinckrodt, Jr., de la National Science Foundation et de la Fondation Whitehall (N.C.H.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
REAGENTS - Machine de
Nettoyantanimaux Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3Il est utilisé pour nettoyer les aiguilles et le support après le tatouage.
Machine à sécherl’agent d’identification et de marquage des animaux, Inc.NDAR4Il est utilisé pour sécher les aiguilles et le support après le nettoyage.
Tatouage néonatal pigment noirIdentification and Marking Systems, Inc.NBP01
Applicateur de préparation cutanéeSystèmes d’identification et de marquage des animaux, Inc.Coton-tigeNSPA1
Solution de préparation de la peauAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01Ce réactif délivre une fine couche d’huile qui améliore l’efficacité du tatouage et empêche la décoloration du tatouage, en (information du fournisseur) : 1) en empêchant la peau non tatouée d’être colorée temporairement, permettant ainsi d’évaluer facilement la qualité d’un tatouage de coussinet de patte avant que le chiot ne soit renvoyé dans sa cage d’origine &ndash ; La surface de la peau tachée peut être confondue avec la peau tatouée, 2) réduire les dommages cutanés pendant le tatouage &ndash ; L’adoucissement de la peau et la lubrification de l’aiguille aideront l’aiguille à pénétrer dans la peau sans causer de dommages à la peau, et 3) empêcher l’oxygène moléculaire de pénétrer dans la peau, réduisant ainsi les réponses inflammatoires aux espèces réactives de l’oxygène qui peuvent être générées.
RÉACTIFS - génotypage
EZ Fast Tissue/Tail PCR Kit (format tube bandelette)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Un colorant rouge de chargement pour l’électrophorèse est inclus dans la solution 2X PCR Ready Mix.
Solution de lyse tissulaire AEZ BioResearch LLCG2001-100Préparez la solution d’extraction d’ADN en mélangeant 20 & micro ; l de la solution de lyse tissulaire A et 180 µ ; l de la solution de lyse tissulaire B par échantillon.
Solution de lyse tissulaire BEZ BioResearch LLCG2001-100Préparez la solution d’extraction d’ADN en mélangeant 20 & micro ; l de la solution de lyse tissulaire A et 180 µ ; l de la solution de lyse tissulaire B par échantillon.
Acide acétique, glacialVWRBDH 3092
Agarose teneur optimisée, biologie moléculaire rpiA20090-500  ;Nous utilisons des gels d’agarose à 2 % dans un tampon TAE contenant le colorant de gel d’ADN SYBR Safe (dilué 10 000 fois) ou le bromure d’éthidium (0,5 & micro ; g/ml de volume de gel).
Bromure d’éthidiumSigma-AldrichE7637-1G
Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté (EDTA)FisherBP120-500
Pointes de pipette filtrées, sans aérosol, 0,1-10 & micro ; lDot Scientific IncUG104-96RS  ;Utilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.
pointes de pipette filtrées, pointes filtrantes de qualité supérieure, 0,5-20 et micro ; lDot Scientific IncUG2020-RSUtilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.
pointes de pipette filtrées, pointes filtrantes haut de gamme, 1-200 & micro ; lDot Scientific IncUG2812-RSUtilisez des pointes de pipette stériles et exemptes d’ADN, de RNase et de DNase. Pour toutes les étapes impliquant de l’ADN, utilisez des pointes de pipette filtrées pour éviter la contamination croisée.
Marqueur de poids moléculaire, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Nous utilisons l’un de ces trois marqueurs de poids moléculaire.
Marqueur de poids moléculaire, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Marqueur de poids moléculaire, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
Tubes PCR, bandes de 8 tubes avec capuchons supérieurs en forme de dôme fixés individuellement, naturel, 0,2 ml  ;USA Scientific1402-2900Utilisez des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase. Une bande de 8 tubes est plus facile à manipuler et à regrouper les échantillons que les tubes individuels.
Tubes PCR, Ultraflux Individual  ;rpi145660Utiliser des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase.
Tube microcentrifuge Seal-Rite 0,5 ml, naturelUSA Scientific1605-0000Utilisez des tubes stériles et exempts d’ADN, de RNase et de DNase.
SYBR Coloration sûre du gel d’ADN * Concentration 10 000x dans DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Amorces pour amplifier le gène Tor1a dans &Delta ; E-torsinA knock-in mices5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (avant) et 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (marche arrière) (référence 18). Ces amorces ont été utilisées à une concentration finale de 1,0 ng/µ ; l (~0,16 et micro ; M) (référence 2).
Amorces pour l’amplification du gène Tfap2a chez les souris5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (avant), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (inverse) pour l’amplicon de 498 pb, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avant), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (inverse) pour l’amplicon de 983 pb, et 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avant), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) pour l’amplicon de 1990-bp. Ces apprêts sont utilisés à 0,5 µ ;M.
RÉACTIFS - culture
5-Fluoro-2&prime ;-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGVoir la section des commentaires de l’uridine pour plus d’informations.
Supplément B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
Boîtes de culture cellulaire 35 boîtes de 10 mm,falcon353001
de culture tissulaire traitées, T25, Traité pour culture tissulaire, à col incliné, bouchon à bouchon, 25 cm2 Surface de croissance, 70 mlBD falcon353082
Fioles de culture cellulaire, T75, traitées pour culture tissulaire, col incliné, capuchon ventilé, 75 cm2 surface de croissance, 250 mlBD falcon353136
tube conique, polypropylène, 15 mlBD falcon352095
Countess lames de chambreGIBCO-InvitrogenC10312
Chlorhydrate de cytosine &bêta ;-D-Arabinofuranoside (chlorhydrate d’Ara-C)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydre, SigmaUltra, 99.5 % (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Plat, verre de Petri 100 x 15 mmPyrex3160-101
Eau distilléeGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KULa solution mère est préparée à 1 500 unités/20 & l = 75 000 unités/ml dans l’eau distillée.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), teneur élevée en glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, unité de filtration rapide PES de 500 ml
, 250 ml, membrane de 50 mm de diamètre, 0,2 & micro ; m Pore SizeNalgene568-0020
Unité de filtration PES rapide, 500 ml, membrane de 90 mm de diamètre, 0,2 & micro ; m Pore SizeNalgene569-0020
Sérum fœtal bovin (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Lamelle en verre, 12 mm Ronde, épaisseur 0,09&ndash ; 0,12 mm, n° 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Sels équilibrés de HanksSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, &ge ; 99.5 % (titrage)Sigma-AldrichH3375-250G
Acide chlorhydrique, 37 %, réactif A.C.SSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulineSigma-AldrichI5500-250 mg
Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO4&bull ;( 7H2O), BioUltra, &ge ; 99,5 % (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237Il s’agit du matériau de revêtement pour les lamelles et les flacons. 1) Pour le préparer, décongelez la solution Matrigel Basement Membrane Matrix sur de la glace, ce qui prend généralement ~1 jour. À l’aide d’une pipette pré-refroidie, aliquote la solution décongelée dans des flacons T25 pré-refroidis sur de la glace et conservez les flacons à -20 °C. Pour préparer la solution de travail du Matrigel, décongelez le Matrigel aliquotté dans un ballon sur de la glace, diluez-le 50 fois en ajoutant une solution MEM pré-refroidie et maintenez la solution diluée à 4 °C. Il est important de pré-refroidir tous les articles de culture et les milieux qui entrent en contact avec Matrigel, sauf pendant et après l’enrobage des lamelles, afin d’éviter qu’il ne forme prématurément un gel. 2) Pour enduire les lamelles en verre ou les flacons de culture avec du Matrigel, appliquez la solution de Matrigel sur la surface. Avant de plaquer les cellules, il est important de sécher complètement la surface. À cette fin, il peut être utile d’aspirer Matrigel pendant la centrifugation cellulaire immédiatement avant de plaquer les cellules et de laisser suffisamment de temps pour le séchage.
Milieu essentiel minimum (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
Prolongateur de sérum MITO+, 5 mlBD Biosciences355006
Plaques multipuits, Plaque 24 puits traitée par culture tissulaireBD falcon353047
Plaques multipuits, Plaque 6 puits traitée par culture tissulaireBD falcon353046
Milieu neurobasal-A (1X), liquideGIBCO-Invitrogen10888-022
Acide nitriqueVWRbdh 3044
NS (Supplément neuronal) 21  ;préparée en laboratoireSource : référence 69
Pipettes Pasteur, 5 ¾ ; ”   ;Fisher13-678-6AUtilisez ce 5 ¾ ; ” Pipette Pasteur pour la trituration cellulaire. Polissez au feu la pointe au préalable pour lisser la surface de coupe et réduire le diamètre intérieur à 50-80 % de l’original. Une pointe trop petite perturbera les cellules et réduira la viabilité cellulaire, mais une pointe trop grande diminuera l’efficacité de la trituration.
Pipettes Pasteur, 9"   ;Fisher13-678-6B
Chlorure de potassium (KCl), SigmaUltra, &ge ; 99.0 %Sigma-AldrichP9333-500G
Pipette sérologique, 2 mlBD falcon357507
Pipette sérologique, 5 ml  ;BD falcon357543
Pipette sérologique, 10 mlBD falcon357551
Pipette sérologique, 25 mlBD falcon357525
Pipette sérologique, 50 ml  ;BD falcon357550
Bicarbonate de sodium (NaHCO3, Hydrogénocarbonate de sodium), SigmaUltra, &ge ; 99,5 %Sigma-AldrichS6297-250G
Chlorure de sodium (NaCl), SigmaUltra, &ge ; 99,5 %Sigma-AldrichS7653-250G
Hydroxyde de sodium (NaOH), granulés, 99,998 % à base d’oligo-métauxSigma-Aldrich480878-250G
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté (Na2HPO4&bull ;( 7H2O)), &ge ; 99,99 %, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Saccharose, SigmaUltra, &ge ; 99.5 % (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
, stérile, 0.2 & micro ; mSeringueCorning 431219
, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, plasma bovinCalbiochem616420
Coloration au bleu trypan, 0,4 %GIBCO-InvitrogenT10282Ceci est utilisé pour compter les cellules vivantes/mortes. Renouvelez une ancienne solution de bleu de trypan si elle est réutilisée plusieurs fois ( par exemple plusieurs fois par semaine pendant plusieurs semaines), car elle formera des précipités et entraînera des lectures erronées de la densité cellulaire.
Trypsine de type XISigma-AldrichT1005-5G
Solution de trypsine-EDTA, 0,25 %GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GLa solution mère est préparée à raison de 50 mg de 5-fluoro-2'-désoxyuridine et de 125 mg d’uridine dans 25 ml de DMEM (8,12 et 20,48 mM, respectivement).
RÉACTIFS - immunocytochimie
Anticorps polyclonaux de lapin anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Anticorps monoclonaux de souris cocktail anti-GFAPMerck MilliporeNE1015
ÉQUIPEMENT - tatouage
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NÉO– ; 9Ce système de tatouage de rongeurs nouveau-nés est un système électrique qui fonctionne en déplaçant rapidement des aiguilles de tatouage à 1 ou 3 points verticalement dans la peau. Activez la machine à tatouer une fois pendant environ 0,5 seconde, tandis que les pointes des aiguilles de tatouage sont maintenues perpendiculaires à la surface de la peau. Nous préférons le tatouage à trois aiguilles pour maximiser la zone tatouée, mais le tatouage à une aiguille est efficace sur les zones plus étroites, par exemple les orteils, ou si un contrôle mécanique fin est nécessaire, par exemple lorsque des numéros sont tatoués. Deux cycles de tatouage à la vitesse la plus lente (en réglant « 1 » sur 3 étapes) sont généralement suffisants pour produire un tatouage visible et durable des coussinets des pattes.
EQUIPEMENT - génotypage
Système d’électrophorèse, horizontal, Wide Mini– ; Sous-cellule GTBIO– ; RAD170– ; 4405Les paramètres typiques de l’électrophorèse sont l’intensité du champ électrique à 6 V/cm et la durée de 25 min pour un gel de 10 cm.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUNos réactions PCR pour le gène Tor1a dans Δ ; Les souris knock-in E-torsinA sont les suivantes : 1 cycle de dénaturation à 94 ° ; C pendant 3 min, 35 cycles de dénaturation à 94 ° ; C pendant 30 sec, recuit à 58 ° ; C pendant 30 sec, extension à 72 ° ; C pendant 2 min. S’ensuit l’extension finale à 72 ° ; C pendant 10 min, et maintien à 4 ° ;C.
Alimentation, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
ÉQUIPEMENT - culture
Compteur de cellules automatisé, ComtesseGIBCO-InvitrogenC10310Ce compteur de cellules automatisé mesure séparément les densités de cellules vivantes et mortes (non colorées et colorées au bleu de trypan, respectivement). Il est important de connaître la plage optimale de mesures de densité : le compteur que nous utilisons a la plus grande précision dans la plage de 1 x 105 à 4 x 106 cellules/ml. Si les valeurs de densité cellulaire mesurées se situent en dehors de la plage recommandée, ajustez le volume de remise en suspension en conséquence.
Armoire de sécurité biologique, Classe II, Type A2NUAIRENU-425-400Cette hotte est utilisée pour toutes les procédures de culture cellulaire, à l’exception de la dissection cérébrale.
Incubateur CO2, AutoFlow, Humidité Contrôlée Chemise d’eauNUAIRE NUAIRENU-4850
Banc Propre HorizontalNUAIRENU-201-330Ce banc propre est utilisé pour la dissection cérébrale (étapes 3.1.1 et 3.1.2 de « Dissection cérébrale et dissociation cellulaire) ».
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeuseFisher46910 (centrifugeuse)/46922 (rotor)
tatouage pour Animal . de type sauvage cellulaire BD Filtre à seringue cellulaire

Références

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

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