Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Résumé

Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l'analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales.

Résumé

Les méthodes de détection et de surveiller mitochondriales composants extérieurs de protéines membranaires dans les tissus animaux sont essentiels pour étudier la physiologie mitochondriale et la physiopathologie. Ce protocole décrit une technique où les mitochondries isolées à partir de tissus de rongeurs sont immunomarquées et analysées par cytométrie en flux. Les mitochondries sont isolées à partir de moelle épinière de rongeurs et soumis à une étape d'enrichissement rapide de manière à éliminer la myéline, un contaminant majeur des fractions mitochondriales préparés à partir de tissu nerveux. Mitochondries isolées sont ensuite marquées avec un anticorps de choix et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence. Analyse par cytométrie en flux vérifie la pureté relative de préparations mitochondriales par coloration avec un colorant spécifique des mitochondries, suivie de la détection et la quantification de la protéine immuno-. Cette technique est rapide, quantifiable et à haut débit, ce qui permet l'analyse de centaines de milliers de mitochondries par échantillon. Il est applicable à évaluer roman proteins à la surface mitochondriale dans des conditions physiologiques normales, ainsi que les protéines qui peuvent devenir mislocalized à cet organite pendant pathologie. Fait important, cette méthode peut être couplé à des colorants fluorescents indicateurs de rendre compte de certaines activités de sous-populations mitochondriales et pour les mitochondries est possible à partir du système nerveux central (cerveau et moelle épinière), ainsi que le foie.

Introduction

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui subissent de multiples séries de fission et de fusion, sont transportés vers les sites de forte demande d'énergie et répondre rapidement aux stimuli physiologiques ^1. Comme il est de plus en plus reconnu que les mitochondries dans différents tissus, même différents compartiments cellulaires, ont des profils fonctionnels distincts, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour identifier ces sous-ensembles mitochondriales distinctes.

Microscopie fournit un moyen par lequel les mitochondries individuels peuvent être visualisés et la présence d'une protéine ou à des mitochondries peut être déterminée par immunofluorescence ^2. Cependant, l'analyse quantitative par cette méthode demande beaucoup de travail et est plus appropriée pour des expériences utilisant des lignées cellulaires immortalisées ou primaires. L'étude des mitochondries individu provenant de tissus est beaucoup plus difficile et la plupart des méthodes ne permettent pas d'identifier facilement les sous-ensembles mitochondriales en même temps que l'évaation de la fonction mitochondriale ^3.

Afin de remédier à cet obstacle, une nouvelle méthode pour immunolabel mitochondries isolées de tissus de rongeurs et par la suite analysées par cytométrie de flux a été développé. Ceci permet la détection rapide et la quantification des protéines localisées sur la membrane externe des mitochondries, ce qui par rapport à l'analyse par microscopie, est beaucoup moins de travail et permet l'analyse de milliers de mitochondries dans un seul échantillon. Cet essai peut être appliqué pour contrôler le sort et la quantité relative des mitochondries des protéines de la membrane externe qui sont censés être constitutivement présent à la mitochondrie, le recrutement de protéines de la surface mitochondriale, ou la détection de protéines mislocalized vers les mitochondries dans des conditions pathologiques. En outre, l'incorporation de colorants indicateurs fluorescents conventionnels permet l'évaluation simultanée de certains aspects de la fonction mitochondriale dans des mitochondries distinctesous-populations.

Protocole

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées en stricte conformité à un protocole (N08001CVsr) approuvé par le du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Commission institutionnelle du Centre de Recherche pour la protection des animaux qui est conforme aux normes nationales telles que définies par le Canadien Conseil de protection des animaux (CCPA).

Préparer tous les réactifs nécessaires pour effectuer ce protocole (tableau 1). Tous les autres détails concernant l'équipement, les fournitures et fournisseurs peuvent être trouvés dans la liste des matériaux.

Tableau 1 Compositions tampons.

1 Collection de Rat moelle épinière

1. Profondément anesthésier le rat (Sprague Dawley) avec 4% isoflorane. Vérifiez anesthésie par un manque de réflexe sur le pincement de ee patte. Euthanasier le rat par décapitation par guillotine. Cette méthode d'euthanasie est préférée à d'autres, ce qui pourrait fausser la moelle épinière.
2. Couper la peau du dos pour exposer la colonne vertébrale. Couper la colonne vertébrale avec des ciseaux d'os juste au-dessus de l'os iliaque. Visualiser l'ouverture de la colonne vertébrale.
3. Insérer une seringue de 10 ml, avec une pointe de 200 ul de pipette (lié par l'intermédiaire de fusion légèrement supérieur à la flamme), rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans la colonne vertébrale.
4. Rincer la moelle épinière par l'application d'une quantité moyenne de pression sur le piston.
5. Si du sang est présent sur la moelle épinière, rincer avec du PBS avant de passer à l'étape suivante.
   NOTE: Cette méthode a également été validé pour le cerveau et le foie. Si y compris ces tissus, de recueillir la moitié du cerveau de rat euthanasié et un morceau de foie poids égal à la moelle épinière. Toutes les autres étapes restent identiques.

2 Isolement de la moelle épinière Mitochondria (Adapté de Vande Velde et al. ⁴⁾

1. Recueillir l'ensemble de la moelle épinière et le lieu intact dans 5 ml homogénéiseur en verre avec 5 volumes (~ 3,25 ml) Homogénéisation tampons (HB). Pour une récupération optimale des mitochondries isolées, effectuer toutes les étapes sur la glace ou dans une chambre froide. Homogénéiser le tissu à la main jusqu'à ce que plus de gros morceaux de tissu restent, à environ huit coups. Placez homogénat en deux (2 ml) ou trois (1,7 ml) microtubes. Centrifugeuse de 1300 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse.
2. Récupérer le surnageant et le placer dans un tube d'ultracentrifugation de 5 ml. Ajouter 750 pi (~ 0,5 volumes) HB au microtube contenant des pastilles et remettre en suspension le culot doucement. Répéter les étapes centrifugation et remise en suspension deux fois de plus. Piscine tous les surnageants (S1a et S1b) dans le même tube d'ultracentrifugation 5 ml ci-dessus. Cette étape sert à éliminer les petits débris.
3. Centrifugeuse regroupé S1 en utilisant une ultracentrifugation équipé d'une pourriture à godets oscillantsou et centrifuger à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
4. Gardez surnageant (S2) pour un traitement ultérieur si la fraction cytosolique est d'intérêt (par exemple pour l'analyse Western blot). Remettre en suspension le culot (P2), la fraction mitochondriale brute, dans 4 ml de HB + 50 mM de KCl. Centrifuger 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants. Jeter le surnageant et remettre délicatement le culot (P3) dans 800 ul HB.
   REMARQUE: Les mitochondries sont lavées avec mM KCl + HB 50 pour éliminer tous les contaminants associés mitochondries non spécifiques.
5. Dans un nouveau tube de 5 ml ultracentrifugation, ajouter exactement 800 ul d'extrait concentré (P3).
6. Pour ajouter ce tube, 200 pl d'iodixanol (milieu à gradient de densité), créant de ce fait une concentration finale de 12% iodixanol. Mélanger le contenu du tube en douceur, mais en profondeur par pipetage avec un P1000. L'addition d'iodixanol première, et pastille, puis remis en suspension (P3) peut être préférable pour faciliter un mélange complet. Centrifuger dans un ultracentrifuge équipé d'un godet rotor oscillant à 17 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
7. REMARQUE: foie ne contient pas de myéline et donc cette étape n'est pas nécessaire si ce n'est que le foie est en cours de traitement. Cependant, si le foie est en cours en même temps que les mitochondries du système nerveux central, il est recommandé de traiter tous les tissus également.
8. Aspirer la couche de myéline dans la partie supérieure du tube et retirez soigneusement et jeter le surnageant. Pellet peut être lâche. Reprendre le culot dans 4 ml HB. Centrifugeuse à nouveau à 17 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 4 ml HB. Répétez la centrifugation et éliminer le surnageant.
9. Reprendre le culot final (P7) à 100-200 pi HB et transférer dans un tube de 1,7 ml à centrifuger. Cet échantillon contient des mitochondries isolées.
10. Passez à la quantification des protéines. Diluer les échantillons et la courbe standard dans 2% de dodécyl sulfate de sodium (SDS) pour assurer une solubilisation suffisante des mitochondries during protéine quantification.

3 immunomarquage des mitochondries isolées de cytométrie en flux

1. Pour chaque mélange de coloration à tester, une pipette 25 pg de mitochondries isolées dans un tube à centrifuger de 1,7 ml. Inclure un échantillon non coloré dans chaque expérience; et pour chaque anticorps, n'oubliez pas d'inclure un échantillon pour le contrôle isotypique approprié.
2. Centrifuger à 17 000 g pendant 2 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse.
3. Retirer le surnageant et remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 ul de tampon de mitochondries (M Buffer) additionné de 10% de BSA acide gras libre pendant 15 min à 4 ° C (étape de blocage).
   REMARQUE: Lors de l'étiquetage, effectuer des incubations dans un réfrigérateur à 4 ° C.
4. Ajouter anticorps primaire (de lapin anti-Mfn2, 20 ug par ml) au tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
   NOTE: Déterminer la concentration optimale de chaque anticorps empiriquement par titrage. En raison de la variabilité de la concentration et / ou la purity, différents lots d'un même anticorps à partir du même fabricant, peuvent conduire à des résultats différents; donc titrage est nécessaire pour chaque nouveau lot d'anticorps.
5. Laver anticorps primaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre délicatement le culot dans 200 ul de tampon M. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul M tampon.
6. Ajouter l'anticorps secondaire (anti-lapin d'âne IgG phycoérythrine (PE), 0,5 pg par ml) à tube et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 ° C, à l'abri de la lumière.
7. Laver anticorps secondaire non lié: Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Enlever le surnageant et remettre le culot dans 200 pi M tampon. Centrifugeuse à 17.000 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul M tampon.
8. Pour assurer événements sont en fait des mitochondries, taches isolé mitochondries avec unemitochondries colorant fluorescent spécifique pendant 15 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Si une coloration d'autres paramètres fonctionnels (potentiel transmembranaire mitochondrial ou de production de superoxyde) est souhaitée, passez à l'étape 4 Si non, passez à l'étape 5 pour l'acquisition.
   NOTE: Il est important de vérifier que le spectre d'émission de l'anticorps secondaire est compatible avec celle des colorants fonctionnels. Par exemple, si la vérification de la pureté mitochondrial avec un colorant commercial avec des propriétés spectrales similaires à potentiel transmembranaire avec FITC et tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM), un anticorps secondaire serait viable allophycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Ajouter des contrôles de compensations, à savoir, un échantillon immuno-ou teinté avec un fluorophore unique, le cas échéant.
9. Transférer dans un tube approprié pour le débit de chargement cytomètre. (Pour faciliter la petite taille de l'échantillon, un tube de microtitration est placé à l'intérieur 3 ml cytomètre en flux tube.) Conserver les échantillons sur la glace et procéder immédiatement àcytomètre en flux pour l'acquisition.

4 Dosage mitochondrial potentiel transmembranaire mitochondrial et production de superoxyde par cytométrie en flux

1. Vérifiez que les mitochondries isolées ont un potentiel transmembranaire intacte par coloration avec 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) ^5, à l'étape 3.8, pendant 15 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Pour comparaison du potentiel transmembranaire entre les échantillons et les populations, l'utilisation des concentrations inférieures / non-extinction de TMRM (1 à 30 nM), peut être plus approprié ^6.
   1. En tant que témoin pour TMRM coloration, teinture mitochondries isolées avec 100 nM TMRM en présence de 100 uM carbonyl cyanide m-chloro phényl hydrazine (CCCP), un découpleur mitochondrial qui dépolariser les mitochondries. La concentration de CCCP nécessaire pour dépolariser les mitochondries peut être moindre si des concentrations plus faibles de colorant sont utilisés.
2. Vérifiez que les mitochondries isolées produisent dismutase mitochondriale par staining avec un indicateur approprié de la superoxyde mitochondriale ^7, également à l'étape 3.8, pour 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière.
   1. En tant que contrôle pour la production de superoxyde mitochondriale, de la teinture des mitochondries isolées de colorant en présence de 10 pM antimycine A, un inhibiteur de complexe III de la chaîne respiratoire qui va augmenter la production de superoxyde mitochondriale.

5 Acquisition et analyse de immunomarquées mitochondries isolées par cytométrie en flux

1. Instrument mis en place: des tensions de commutation de linéaire en mode Connectez-vous pour faciliter l'analyse des mitochondries isolées et les tensions prévues (FSC: 450; SSC: 250). Veiller à ce que les événements sont collectés dans des FSC mode A (zone), ainsi que FSC-W (largeur) et FSC-H (hauteur), pour être en mesure d'exclure doublets (c'est à dire, deux événements, en passant par le détecteur en même temps ) dans la collecte de post-analyse des données. Définissez le nombre d'événements à collecter à 100.000. Acquérir des contrôles de compensation, Le cas échéant.
2. L'acquisition des données: Avant l'acquisition des données, éviter vortex échantillons. Au lieu de mélanger en tapotant doucement tube. Initialement, les événements à collecter une faible pression, au cours de déclenchement. Porte sur la population totale. Ajuster les tensions d'histogrammes en conséquence, habituellement au sommet de l'échantillon non coloré correspond à la deuxième décennie (10 ^2). Une fois les portes sont établis, et les échantillons sont en cours de traitement, la pression peut être réglé à sa grande.
3. Analyse: Visualisez doublets en traçant FSC-W en fonction de FSC. Identifier les maillots et les doublets. Porte sur maillots. Sélectionnez la population mitochondriale par gating sur les événements qui sont colorées positivement avec un colorant mitochondrial sélectif.
4. Déterminer l'étiquetage de fond du contrôle isotypique. Utilisation de l'échantillon témoin d'isotype, déterminer le pourcentage de la population mitochondriale marquage des anticorps dirigés contre Mfn2.

Résultats

Les mitochondries dérivées de la moelle épinière chez le rat peuvent être immunomarquées avec un anticorps cible à Mitofusin2 (Mfn2), une protéine impliquée dans la fusion de la membrane externe des mitochondries ^8. Suite à l'isolation et l'étiquetage avec un anticorps spécifique Mfn2 et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence, les mitochondries sont traitées par cytométrie de flux (figure 1). Suite à l'acquisition de données, les échantillons sont analysés en utilisant la cytométrie ...

Discussion

Il est de plus en plus évident que les mitochondries sont des acteurs clés dans les deux physiologie normale et la maladie. Bien immuno peut déterminer quelles protéines se trouvent dans les mitochondries ou à la surface des mitochondries dans un certain état, cette méthode des rapports sur la moyenne de l'ensemble de la population. Cette méthode ne peut pas donner d'informations sur l'abondance relative des sous-populations ou sous-ensembles mitochondriales. Bien qu'il ait été supposé précédemment que t...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rats	Charles River	Code de souche 400	Des rats mâles ou femelles adultes (9 semaines à 18 semaines) peuvent être utilisés pour le protocole d’isolement. Le poids des rats dépend du sexe et de l’âge (les mâles entre 300 et 500 g et les femelles entre 200 et 350 g) sont généralement utilisés.
Homogénéisateur de dénonciation	Kontes Glass Co.  ;	885450-0022	Duall 22
Microcentrifugeuse	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultra-Clear Ultra-Centrifugeuse	Beckman Coulter	344057	Transparent, à paroi mince.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor et godets  ;   ;	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, gradient de densité moyen
Sans acides gras Sérum bovin Albumine	Sigma	A8806	Doit être exempt d’acides gras pour les mitochondries
Succinate de sodium dibasique hexahydraté  ;   ;	Sigma	S9637
Anticorps anti-mitofusine de lapin	Sigma	M6319
IgG	de lapin Jackson Immuno Research  ;	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Tube de titrage micro	Bio-Rad	223-9391	Pour l’acquisition d’échantillons par cytométrie en flux  ;
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM : Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM : Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ ; M : Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycine A	Sigma	A8874
LSR II cytomètre en flux	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Logiciel utilisé pour l’analyse
Kit de dosage des protéines BCA  ;   ;	Le test Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford n’est pas recommandé car il n’est pas compatible avec des concentrations élevées de SDS