Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Summary

Décrit ici est un procédé pour détecter et quantifier les protéines de la membrane externe des mitochondries par immunomarquage des mitochondries isolées à partir de tissus et l'analyse par cytométrie en flux rongeur. Cette méthode peut être étendue à évaluer les aspects fonctionnels des sous-populations mitochondriales.

Abstract

Les méthodes de détection et de surveiller mitochondriales composants extérieurs de protéines membranaires dans les tissus animaux sont essentiels pour étudier la physiologie mitochondriale et la physiopathologie. Ce protocole décrit une technique où les mitochondries isolées à partir de tissus de rongeurs sont immunomarquées et analysées par cytométrie en flux. Les mitochondries sont isolées à partir de moelle épinière de rongeurs et soumis à une étape d'enrichissement rapide de manière à éliminer la myéline, un contaminant majeur des fractions mitochondriales préparés à partir de tissu nerveux. Mitochondries isolées sont ensuite marquées avec un anticorps de choix et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence. Analyse par cytométrie en flux vérifie la pureté relative de préparations mitochondriales par coloration avec un colorant spécifique des mitochondries, suivie de la détection et la quantification de la protéine immuno-. Cette technique est rapide, quantifiable et à haut débit, ce qui permet l'analyse de centaines de milliers de mitochondries par échantillon. Il est applicable à évaluer roman proteins à la surface mitochondriale dans des conditions physiologiques normales, ainsi que les protéines qui peuvent devenir mislocalized à cet organite pendant pathologie. Fait important, cette méthode peut être couplé à des colorants fluorescents indicateurs de rendre compte de certaines activités de sous-populations mitochondriales et pour les mitochondries est possible à partir du système nerveux central (cerveau et moelle épinière), ainsi que le foie.

Introduction

Les mitochondries sont des organites très dynamiques qui subissent de multiples séries de fission et de fusion, sont transportés vers les sites de forte demande d'énergie et répondre rapidement aux stimuli physiologiques ^1. Comme il est de plus en plus reconnu que les mitochondries dans différents tissus, même différents compartiments cellulaires, ont des profils fonctionnels distincts, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour identifier ces sous-ensembles mitochondriales distinctes.

Microscopie fournit un moyen par lequel les mitochondries individuels peuvent être visualisés et la présence d'une protéine ou à des mi....

Protocol

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées en stricte conformité à un protocole (N08001CVsr) approuvé par le du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Commission institutionnelle du Centre de Recherche pour la protection des animaux qui est conforme aux normes nationales telles que définies par le Canadien Conseil de protection des animaux (CCPA).

Préparer tous les réactifs nécessaires pour effectuer ce protocole (tableau 1). Tous les autres détails concernant l'équipement, les fournitures et fournisseurs peuvent être trouvés dans la liste des matériaux.

Results

Les mitochondries dérivées de la moelle épinière chez le rat peuvent être immunomarquées avec un anticorps cible à Mitofusin2 (Mfn2), une protéine impliquée dans la fusion de la membrane externe des mitochondries ^8. Suite à l'isolation et l'étiquetage avec un anticorps spécifique Mfn2 et un anticorps secondaire conjugué à fluorescence, les mitochondries sont traitées par cytométrie de flux (figure 1). Suite à l'acquisition de données, les échantillons sont analysés en utilisant la cytométrie .......

Discussion

Il est de plus en plus évident que les mitochondries sont des acteurs clés dans les deux physiologie normale et la maladie. Bien immuno peut déterminer quelles protéines se trouvent dans les mitochondries ou à la surface des mitochondries dans un certain état, cette méthode des rapports sur la moyenne de l'ensemble de la population. Cette méthode ne peut pas donner d'informations sur l'abondance relative des sous-populations ou sous-ensembles mitochondriales. Bien qu'il ait été supposé précédemment que t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Charles River	Code de souche 400	Des rats mâles ou femelles adultes (9 semaines à 18 semaines) peuvent être utilisés pour le protocole d’isolement. Le poids des rats dépend du sexe et de l’âge (les mâles entre 300 et 500 g et les femelles entre 200 et 350 g) sont généralement utilisés.
Homogénéisateur de dénonciation	Kontes Glass Co.  ;	885450-0022	Duall 22
Microcentrifugeuse	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultra-Clear Ultra-Centrifugeuse	Beckman Coulter	344057	Transparent, à paroi mince.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor et godets  ;   ;	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, gradient de densité moyen
Sans acides gras Sérum bovin Albumine	Sigma	A8806	Doit être exempt d’acides gras pour les mitochondries
Succinate de sodium dibasique hexahydraté  ;   ;	Sigma	S9637
Anticorps anti-mitofusine de lapin	Sigma	M6319
IgG	de lapin Jackson Immuno Research  ;	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Tube de titrage micro	Bio-Rad	223-9391	Pour l’acquisition d’échantillons par cytométrie en flux  ;
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM : Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM : Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP	Sigma	C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ ; M : Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycine A	Sigma	A8874
LSR II cytomètre en flux	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Logiciel utilisé pour l’analyse
Kit de dosage des protéines BCA  ;   ;	Le test Pierce/Thermo Scientific	23225	Bradford n’est pas recommandé car il n’est pas compatible avec des concentrations élevées de SDS