Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour l'analyse des protéines

Summary

Une nouvelle approche est décrite pour la construction de la langue électronique (eT), qui simplifie considérablement la conception et la production de matériaux de détection, et permet à l’eT de générer des profils d’évolution continue et des paysages pour les échantillons en liquide. L’eT obtenu est efficace pour l’analyse des protéines courantes telles que la discrimination.

Abstract

Dans le protocole actuel, une approche combinatoire a été développée pour simplifier la conception et la production de matériaux de détection pour la construction de langues électroniques (eT) pour l’analyse des protéines. En mélangeant un petit nombre de molécules simples et facilement accessibles avec des propriétés physicochimiques différentes, utilisées comme blocs de construction (BB), dans des proportions variables et contrôlées et en permettant aux mélanges de s’auto-assembler sur la surface dorée d’un prisme, un ensemble de surfaces combinatoires présentant des propriétés appropriées pour la détection des protéines a été créé. De cette façon, un grand nombre de récepteurs à réaction croisée peuvent être obtenus rapidement et efficacement. En combinant un tel réseau de récepteurs combinatoires à réaction croisée (CoCRR) avec un système de détection optique tel que l’imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), l’eT obtenu peut surveiller les événements de liaison en temps réel et générer des modèles de reconnaissance continue, y compris un profil d’évolution continue 2D (CEP) et un paysage d’évolution continue (CEL) 3D pour les échantillons dans liquide. Un tel système eT est efficace pour la discrimination des protéines purifiées courantes.

Introduction

Méthodes de détection des protéines précises et rapides sont très importants dans le diagnostic médical et de la protéomique. Puces à protéines de détection classiques, tels que les biopuces, sont basés sur le principe de la reconnaissance "clé lock-et-" et nécessitent des récepteurs spécifiques tels que les aptamères, des anticorps ou mimétiques.

Au cours des dernières années, la détection différentielle inspiré par le olfaction humaine et gustation a émergé comme une alternative ^1. Ce nez / langue électronique (fr / eT) approche est basée sur la liaison d'analytes à un réseau de récepteurs à réaction croisée (SDRC), qui n'ont pas besoin d'être très spécifique ou sélective pour les molécules cibles différentielle permet donc de surmonter le laborieux processus de développement de récepteurs hautement sélectifs. Il s'agit de la réponse combinée de tous les récepteurs qui crée un motif distinct pour chaque échantillon, comme une empreinte digitale, permettant son identification.

Les deux principaux défis pour le développement des electronic nez / langue pour la détection de la protéine efficace sont la production d'éléments de détection qui ont la capacité de faire la distinction entre les analytes structurellement similaires et le système de transduction approprié pour l'événement de liaison. Jusqu'à présent, les études ont rapporté diverses approches du développement du tableau ^2. Par exemple, dans une étude d'une identification basée sur la baie de protéines a été développé en utilisant CRC qui préparés à partir des dérivés tétra-carboxyphenylporphyrin par couplage de groupes carboxyle de différents acides aminés ou de dipeptides à fournir des récepteurs différentiels possédant un noyau hydrophobe de l'affinité pour les protéines et les périphéries chargées distinctes pour transmettre liaison différentielle. En utilisant ce système, les différentes protéines et des mélanges de protéines ont été identifiées par la mesure de l'extinction de fluorescence des récepteurs de l'interaction avec les analytes ^3,4. Dans une autre étude, une bibliothèque de 29 CRC qui tripeptide contenant et fragments d'acide boronique synthétisé d'une manière combinatoire sur un hexasubstil'ar- échafaudage de benzène a été mis au point pour détecter les protéines avec une détection colorimétrique indicateur d'absorption de ^5,6. Avec une telle conception, chaque récepteur différentiel a montré une capacité de liaison de protéines sur la base de la variance dans les bras et les peptides, les acides boroniques ont aidé à la différenciation de protéines à partir de glycoprotéines. Plus récemment, un tableau composé de différents cationiques fonctionnalisés nanoparticules d'or conjugués avec un poly anionique polymère fluorescente (p-phénylèneéthynylène) (PPE) a été créé pour détecter et identifier les protéines ^7. La liaison de concurrence entre les analytes de protéines et trempé complexes de nanoparticules / or EPI fluorescence régénérées, la production de modèles de reconnaissance distinctes pour les protéines. Dans cette étude, les interactions protéines-nanoparticules fonctionnalisées ont été réglées en faisant varier les propriétés physico-chimiques des groupes terminaux de nanoparticules. En outre, il a été montré que cette approche est efficace pour l'analyse des protéines dans un milieu complexe et riche en protéines telleque le sérum humain à des concentrations physiologiquement pertinents, montrant ainsi le potentiel de eT dans le profilage des échantillons réels pour diagnostiquer des états pathologiques ^8.

Bien que très prometteur, ces systèmes ont des limites inhérentes. Ils nécessitent la conception et la synthèse du 5 au 29 CRC qui avec des structures très compliquées. En outre, contrairement au système olfactif qui est remis à zéro après chaque mesure, de la protéine de détection nécessite la préparation d'une matrice par exemple. Enfin, le suivi des événements de liaison en temps réel sont extrêmement difficiles.

Dans ce contexte, une approche combinatoire a été proposée en utilisant un petit nombre de molécules simples et facilement accessibles avec différentes propriétés physico-chimiques (hydrophile, hydrophobe, chargé positivement, chargé négativement, neutre, etc.) En tant que blocs de construction (BBS) ^9. En mélangeant les BB en variant et des proportions contrôlées et en permettant aux mélanges à s'auto-assembler sur la surface d'or d'unprisme, un réseau de surfaces combinatoires comportant des propriétés appropriées pour la protéine de liaison a été créé. Notamment, les monocouches auto-assemblées sur ce système permettent le réglage facile d'une gamme de propriétés de surface de manière très divergente, ce qui permet divers récepteurs à réaction croisée combinatoires (CoCRRs) pour être rapidement et efficacement produite. Protéine de détection a été effectuée en utilisant un système de détection optique, la surface d'imagerie par résonance de plasmon (SPRi). En bref, un large faisceau monochromatique de lumière polarisée à partir d'une LED illumine toute la surface de la matrice CoCRR sur la surface du prisme. Une caméra CCD haute résolution de la vidéo fournit des images de différence en temps réel sur tous les spots de la gamme CoCRR. Il saisit toutes les modifications locales à la surface de la matrice CoCRR fournissant des informations détaillées sur les événements de liaison et les processus cinétiques ^10. Pendant ce temps, à l'aide de logiciels d'imagerie, images SPR correspondant aux taches sont automatiquement converties en variations de réflectivité versus le temps, générer une série de courbes de liaison cinétiques appelés sensorgrammes. Ainsi, SPRi permet une observation, synchrone, parallèle, sans étiquette et en temps réel des événements de liaison. En outre, le tableau CoCRR obtenu est régénérable et réutilisable pour l'analyse des protéines.

Ce protocole décrit la construction de la langue électronique en utilisant seulement deux petites molécules comme des blocs de construction et illustre son application pour l'analyse des protéines communes basées sur des modèles de reconnaissance continus obtenus avec SPRi.

Protocol

1 Préparation des différentes solutions et échantillons de protéines

1. Préparer 100 ml d'une solution tampon phosphate (PBS-G) contenant 50 mM de NaH ₂ PO _4, NaCl 50 mM, glycerol à 10% et à un pH de 6,8.
2. Préparer 250 ml d'une solution tampon HEPES contenant 10 mM d'HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20 à pH 7,4.
3. Préparer une solution stock de bloc de construction 1 (BB1) lactose et le renforcement bloc 2 (BB2) sulfaté lactose (Figure 1) à 0,2 mM dans du PBS-G.
4. Préparer 1 ml de solutions de protéines dans HEPES: Une lectine rachis hypogaea (AHL) à 500 nm, la myoglobine à 1 uM, et lysozyme à 500 nM.
5. Préparer 20 ml de SDS à 1% dans de l'eau ultrapure.

2 Préparation de la matrice CoCRR

1. Nettoyer la surface d'or du prisme 48 heures avant de l'utiliser avec un nettoyeur à plasma pendant 3 min dans ces conditions: 75% d'oxygène, 25% d'argon, 0,6 mbar, puissance 40 W.
2. Préparer solutio pur et mixte onzens de BB1 ​​et BB2 avec [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapports entre 0 et 100% par incréments de 10% à une concentration BB total de 0,1 mM dans du PBS-G.
3. Dépôt 8 gouttelettes nl de ces solutions pures et mixtes sur la surface du prisme à l'aide d'un observateur sans contact en quatre pour chaque rapport avec 44 points au total (figure 2).
   NOTE: 10% de glycerol ajoutée dans du PBS-G est très important pour réduire l'évaporation du solvant et le changement de concentration BB après le dépôt.
4. Placer le prisme à l'intérieur d'une boîte de Pétri contenant 1 ml d'eau ultra-pure et laisser O / N à la température ambiante pour l'auto-assemblage de BB1 ​​BB2 et sur la surface d'or. Ici, on suppose que la composition de surface moyenne dans le SAM mixte reflète la composition de la solution mixte de dépôt (figure 3) ^11.
5. Laver soigneusement le prisme avec de l'eau ultra pure et puis on sèche sous un flux d'argon.

3 protéines de détection par SPRi

1. Réglez le incubator dans laquelle l'appareil est placé SPRi à 25 ° C afin d'éviter les changements d'indice de réfraction induits par la variation de température au cours de la détection de protéines.
2. Insérer un prisme non fonctionnalisé rinçage dans le 10 ul éther cétone de polyéther (PEEK) cellule connectée à une pompe à seringue commandé par ordinateur, un dégazeur et une soupape d'injection de fluide sous pression 6 ports écoulement (figure 4). Remplir dans le système d'écoulement avec fraîchement filtré et dégazé course de tampon HEPES.
3. Retirer le prisme de rinçage et insérer le prisme contenant le réseau CoCRR dans la cellule d'écoulement. Exécuter HEPES à un débit de 100 ul / min. Avec l'aide de la caméra CCD éliminer les bulles d'air présentes sur la surface du prisme en passant rapidement tampon de migration.
4. Définir la zone d'étude pour chaque tache en dessinant un cercle de même diamètre pour la zone d'intérêt basé sur une image bien contrastée de la gamme et avec l'aide d'un logiciel intégré dans le système SPRi.
5. Tracer des courbes de plasmon, qui représentent le refletLes courbes de ivité en fonction de l'angle d'incidence pour tous les spots.
6. Choisir l'angle (position à laquelle les courbes cinétiques seront enregistrées) de travail au plus haut de la pente des courbes de réflectivité. Tourner le miroir de balayage pour fixer l'angle de travail choisi pour les mesures cinétiques.
7. Continuez à faire fonctionner HEPES à travers le système d'écoulement jusqu'à ce que le signal de réflectivité pour toutes les taches est stable et constant.
8. Injecter 1 ml de solution de LAH avec une seringue dans la boucle d'échantillon (500 ul) à la vanne d'injection en position "charge". Ensuite, mettre la soupape d'injection en position "injection". Le débit utilisé pour toutes les injections de la protéine était de 100 pl / min.
9. Lancer des mesures cinétiques en surveillant les variations de la réflectivité en fonction du temps à la fois sur tous les points.
10. A la fin de l'injection de la protéine, rincer la matrice avec un tampon en cours d'exécution pendant 8 min. Enfin, injecter 1 ml 1% de SDS pour le régénérer.
11. Répétez la même procédure pour l'autre proteins.

4 Traitement et analyse des données

1. Suite à l'entrée de la solution de protéine dans la cellule d'écoulement, moléculaire liaison se produit et induit un décalage des courbes de plasmon et une variation de la réflectivité. Le logiciel d'acquisition d'image convertit les valeurs d'intensité lumineuse mesurées à des niveaux d'échelle de gris, ce qui donne des images SPR Figure 5A, et génère la variation de la réflectivité en fonction du temps, ce qui donne sensorgrammes (Figure 5B).
2. Utilisation d'un logiciel mathématique de calcul pour tracer la réflectivité (R%) à la fin de chaque injection de la protéine par rapport à la [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapport pour générer 2D profil d'évolution continue (PEC) pour chaque échantillon (Figure 5C).
3. Ajouter le [BB1] / ([BB1] + [BB2]) dans le rapport sensorgrammes (figure 5B) pour générer paysage 3D continu de l'évolution (CEL) pour chaque protéine (figure 5D).

Results

Pour sonder la capacité de la languette électronique pour l'analyse des protéines commun, trois protéines ont été utilisées: AHL, la myoglobine et le lysozyme. Pour chaque protéine, un profil 2D distinct continu de l'évolution de la CEP, a été générée par l'ET, comme le montre la figure 6.

En outre, grâce à SPRi, qui est capable de surveiller les adsorption et de désorption cinétique en temps réel, pour chaque protéine un temps de modèle de reconnaissance continue dépendant,...

Discussion

Les étapes les plus critiques pour la construction de cette eT sont dédiés à assurer une bonne reproductibilité du système. Par exemple, le nettoyage de la surface d'or du prisme avec une procédure normalisée avant utilisation, en ajoutant 10% de glycerol dans les onze solutions pures et mixtes de BB1 ​​et BB2 pour éliminer l'évaporation du solvant pendant BB auto-assemblage sur la surface d'or du prisme, dépôt de plusieurs répétitions pour chaque [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Ratio, etc. Comme pour...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Appareil SPRi  ;	L’appareil SPRi de Horiba Scientific-GenOptics		est placé dans un incubateur à température régulée à 25 °C.
Incubateur	Memmert
Pompe à seringue  ;	Cavro scientific instruments	Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  ;	Vanne
	Upchurch Scientific		Le volume de la boucle d’injection utilisée est de 500 µ ;l.
Nettoyeur plasma femto (version 7)	en ligne Diener Electronic		avec 2 canaux.
Spotter	Siliflow		Il s’agit d’un spotter piézoélectrique sans contact.
SPRi-Biochip	Horiba Scientific-GenOptics	36000067	Le prisme est constitué d’un prisme en verre à indice de réfraction élevé recouvert d’une fine pellicule d’or (45 nm) et spécialement développé à des fins d’imagerie.
Erythrina cristagalli lectine  ;	Sigma-Aldrich	L5390
Arachis hypogaea lectine  ;	Sigma-Aldrich	L0881
Myoglobine	Sigma-Aldrich	M1882
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
CXCL12&alpha ;			Fourni par le Dr Hugues Lortat-Jacob ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9
CXCL12&gamma ;   ;			Fourni par le Dr Hugues Lortat-Jacob ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9
Lactose			fourni par le Prof. David Bonnaff ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9
Lactose			fourni par le Prof. David Bonnaff ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5150
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
Tween 20	Sigma-Aldrich	274348
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Phosphate de sodium monobasique	Sigma-Aldrich	S0751
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S3014