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Article de méthode

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN

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⸱

DOI :

10.3791/51902

⸱

6 octobre 2014

 , 
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

Dans cet article

Résumé

l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.

Résumé

L'utilisation généralisée de séquençage de nouvelle génération a ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer et le diagnostic. NGS apportera d'énormes quantités de données sur le cancer, et en particulier la génétique du cancer. Les connaissances actuelles et des découvertes futures, il sera nécessaire d'étudier un grand nombre de gènes qui pourraient être impliqués dans une prédisposition génétique au cancer. À cet égard, nous avons développé une conception Nextera d'étudier 11 gènes complets impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN. Ce protocole a été développé pour étudier en toute sécurité 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, et TP53) de promoteur de 3'-UTR chez 24 patients simultanément. Ce protocole, basé sur la technologie de transposase et enrichissement ADNg, donne un grand avantage en termes de temps pour le diagnostic génétique grâce à multiplexage déguster. Ce protocole peut être utilisé en toute sécurité avec ADNg de sang.

Introduction

En 2010, près de 1,5 millions de personnes (essentiellement des femmes) ont développé un cancer du sein dans le monde entier. On estime que 5 à 10% de ces cas étaient héréditaires. Il ya près de 20 ans, BRCA1 et BRCA2 ont été identifiées comme impliquées dans héréditaire du sein et des ovaires 1. Depuis environ 15 ans, les régions codantes des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été séquencés afin de déterminer la prédisposition génétique au cancer du sein et le cancer de l'ovaire. Des altérations dans les gènes BRCA1 et BRCA2 sont détectés chez 10 à 20% de deux familles sélectionnées suggérant que l'analyse de ces régions ne sont pas suffisantes pour le criblage efficace. Récemment, l'analyse des séquences non codantes (promoteurs, introns, 3-'UTR) de BRCA1 et BRCA2 mis en évidence que de nouvelles mutations / variations pourraient être liés à un risque accru de cancer du sein 6.3.

protéines BRCA1 et BRCA2 sont impliqués dans la recombinaison homologue réparation (RHS), qui est complété par de nombreux partenaires 7. Bien que des altérations de BRCA1 ou BRCA2 induisent des défauts de réparation de l'ADN, les autres partenaires peuvent également influer sur le risque de cancer du sein. Cette hypothèse semble avoir été validé depuis BRIP1 8 et 9 PALB2 avoir un impact avéré sur le cancer du col utérin et du sein, respectivement. En outre, deux autres gènes de prédisposition au cancer du sein "à risque modéré», ATM et CHEK2, peuvent également être étudiées systématiquement 10.

Suite à ces études, nous avons décidé de développer un protocole pour analyser 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, et TP53) chez 24 patients en utilisant un très facile et relativement simultanément protocole rapide basé sur la technologie de la transposase, l'enrichissement et le séquençage sur un dispositif de débit moyen. Mercicette technique, nous avons séquence des gènes complets à partir du début du promoteur à l'extrémité 3'-UTR de, à l'exception de RAP80, pour lequel une région intronique de 2500 pb n'est pas couverte (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Cela représente un total d'environ 1.000.300 pb étudié avec 2734 sondes. Habituellement, BRCA1 et BRCA2 séquences exoniques sont analysés par séquençage de Sanger, qui a besoin de 1,5 mois de moins de 20 patients. Avec le présent protocole (figure 1), dans le même temps, les 11 gènes complets pour plus de 75 patients ont pu être analysés.

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Protocole

1 Évaluation des ADNg (ADN génomique) Rendement

  1. Quantifier fraîchement extrait ADNg avant la préparation de la bibliothèque. Utilisez la méthode d'évaluation du rendement fluorimétrique de quantifier ADNg intact (éviter d'utiliser un spectrophotomètre pour ADNg évaluation de rendement). Mesurer la (260/280 nm) rapport et s'assurer qu'il est compris entre 1,8 et 2 NOTE: 50 ng de ADNg sont nécessaires pour l'expérience.

2. ADNg Enrichissement: Jour 1, Matin

  1. Avant de partir
    1. De la trousse d'enrichissement de l'ADN (voir le tableau des Matériaux / Équipement), dégel tampon d'ADN (TD) et les solutions d'ADN enzyme (TDE1) sur la glace. Au moins 30 minutes avant utilisation, amener des billes magnétiques d'épuration et d'arrêt cible (ST) en mémoire tampon à la température ambiante (RT). Ajouter 20 ul d'échantillon d'ADNg à 2-2,5 ng / ul directement dans une plaque de 96 puits, 1 puits par échantillon. IMPORTANT: utiliser un témoin positif pour valider le protocole (échantillon avec une variation de séquence connue).
  2. Tagmentation
    1. Mix tous les réactifs en renversant 5x, et centrifuger brièvement. À température ambiante, ajouter 25 ul de tampon TD pour chaque puits contenant 50 ng (20 pi) de ADNg, puis 5 ul de tampon TDE1. Réglez pipette à 50 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
    2. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Ensuite, placez la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et exécutez le programme suivant: 55 ° C pendant 5 min et 10 ° C pour une durée illimitée.
    3. Pendant cette incubation, préparer la feuille d'échantillon avec logiciel de gestion de l'expérience pour définir les indices qui seront utilisés.
  3. Tagmentation Purification
    REMARQUE: Cette étape est essentielle. Soyez très prudent.
    1. Vérifier l'absence de précipité dans des billes magnétiques de purification et tampon ST. Si précipités sont présents, réchauffer des solutions dans les mains. Tampon de remise en suspension Thaw (RSB) sur la glace.
    2. À température ambiante, vortex solution ST et ajouter15 pi de chaque échantillon contenant. Réglez pipette à 65 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Couvrir la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    3. Ajouter 52 ul de billes magnétiques de purification préalablement mélangés dans chaque puits. Réglez pipette à 117 pi, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Couvrir la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    4. Retirez le film adhésif. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 2 minutes à température ambiante. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair.
    5. Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour 24 échantillons, ajouter 2 ml d'eau distillée et 8 ml d'éthanol). Retirer et jeter le surnageant en prenant soin de ne pas déranger les perles.
    6. Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant au moins 30 secà la température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une deuxième fois. Assurer la éthanol a été supprimé. Laisser sécher à température ambiante pendant 10 minutes ou jusqu'à évaporation complète de l'éthanol.
    7. Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 22,5 ul de tampon de RSB. Régler la pipette à 22,5 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Transférer doucement 20 pi du surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
      NOTE: En option, déterminer la taille des échantillons tagmented en utilisant un analyseur de fragment. Au lieu des étapes mentionnées ci-dessus, en utilisant une électrophorèse sur gel d'acrylamide de haute résolution. Fragments doit être comprise entre 150 pb et 1000 pb.
  4. 1 Amplification PCR er
    1. Thaw PCR mélange maître à la polymérase (LP-PMM), l'indice 1 amorce, et l'indice 2 solutions d'amorces sur la glace. Correspondre à la combinaison oindices f avec la feuille d'échantillon de Experiment Manager. Par multiplexage, préparer i7 indice différent de 1 (i7, N7xx) pour chaque échantillon.
    2. Dans chaque puits, ajouter 20 pi de LP-PMM, 5 pi de l'indice 1, et 5 pi d'indice 2 Régler la pipette de 50 pi, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Couvrir la plaque avec un film adhésif microseal. Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C.
    3. Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 1 (tableau 1).
      REMARQUE: la procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions pour la nuit dans le thermocycleur ou pour 2 jours entre 2 et 8 ° C.

3. ADNg Enrichissement: Jour 1, après-midi

  1. Avant de partir
    1. Oligos dégel (OSC), capture cible tampon 1 (NCT1), et des solutions RSB sur la glace. Au moins 30 minutes avant l'utilisation, la purification amener des billes magnétiques à la température ambiante.
  2. La purification PCR
    1. Centrifuger la plaque de l'étape 2.4, pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    2. À température ambiante, ajouter 45 ul de billes magnétiques de purification mixte dans chaque puits. Régler la pipette à 95 ul, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 2 minutes à température ambiante.
    3. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour 24 échantillons, ajouter 2 ml d'eau distillée et 8 ml d'éthanol). Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.
    4. Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une deuxième fois. Assurer la éthanol a été supprimé. Laissez sécher à température ambiante pendant 15 min.
    5. Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 40 ul de tampon de RSB. Réglez le tuyautte à 40 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
    6. Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 2 min. Le surnageant doit apparaître tout à fait clair. Transférer doucement 38 pi du surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
    7. Déterminer le rendement de chaque échantillon par une méthode fluorimétrique. Cette première partie du protocole sera validé si les rendements sont évalués entre 30 et 50 ng / ul.
  3. 1 er hybridation
    1. En commun jusqu'à 12 échantillons par pool à ce stade en mélangeant 500 ng de chaque échantillon dans une nouvelle plaque de 96 puits. Assurez-vous que le volume final de chaque groupe ne dépasse pas 40 pi.
      REMARQUE: Si nécessaire, réduire le volume de piscines en utilisant un dispositif de concentrateur sous vide à température ambiante (Attention: la concentration de l'ADN ne peut être modifiée par chauffage, même à 30 ° C le chauffage provoque une dégradation de l'ADN). Ajuster le volume final à 40 pi par addition de solution RSB.
    2. Bien mélanger leSolution NCT1. Pour chaque puits contenant 40 ul d'échantillons d'ADN communs, ajouter 50 pi de NCT1, et 10 pi de CSO. Régler la pipette 100 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    3. Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 2 (tableau 1).

4. ADNg Enrichissement: Jour 2, Matin

  1. Avant de partir
    1. De la trousse d'enrichissement de l'ADN (voir le tableau des Matériaux / Équipement) dégel NaOH 2 N (HP3), cible tampon d'élution 1 (ET1), cible tampon d'élution 1 ET2, des billes magnétiques de streptavidine (SMB), solution de lavage 1 (WS1), lavage solution 2 (WS2), solution de lavage 3 (Volet 3), solutions OSC, et NCT1 à la température ambiante.
  2. 1 er hybridation Wash
    1. Retirer la plaque de 96 puits du thermocycleur et centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C. Retirez le couvercle adhésif très savoully.
    2. Transférer le mélange réactionnel de 100 pi de la plaque à une nouvelle MIDI plaque de 96 puits et ajouter 250 microlitres de solution de SMB bien vortex. Régler la pipette 350 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min.
    3. Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C, retirer le joint de colle et placez la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
    4. Ajouter 200 ul de solution de WS1 bien mélangé dans les puits contenant des perles. Régler la pipette 200 ul de la pipette et doucement l'ensemble du volume de haut en bas 15x évitant la formation de bulles / mousse.
    5. Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
    6. Ajouter 200 ul de solution de WS2 bien mélangé dans des puits contaperles de INING. Régler la pipette 200 ul et délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 15x en évitant la formation de bulles / mousse.
    7. Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
    8. Ajouter 200 ul de solution de WS2 bien mélangé dans des puits contenant des billes. Régler la pipette 200 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x.
    9. Transférer tout le volume dans une nouvelle plaque à 96 puits. Sceller la plaque et placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C). Lancez le thermocycleur à 42 ° C pendant 30 min.
    10. Imediately placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirer le joint et le jeter immédiatement tout le surnageant. Ensuite, retirez la plaque du support magnétique.
    11. Ajouter 200 ul de WS2 dans des puits contenant des billes. Régler la pipette à 200ul et doucement pipeter la totalité du volume de haut en bas 15x en évitant la formation de bulles / mousse. Sceller la plaque et placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C). Lancez le thermocycleur à 42 ° C pendant 30 min.
    12. Immédiatement placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirer le joint et le jeter immédiatement tout le surnageant. Ensuite, retirez la plaque du support magnétique.
    13. Ajouter 200 ul de solution de WS3 bien mélangé dans des puits contenant des billes. Régler la pipette 200 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x.
    14. Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter tout le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
    15. Répéter le WS3 laver une seconde fois.
    16. Après avoir enlevé le surnageant, sceller la plaque et centrifuger à tirer vers le bas le surnageant résiduel. Placer la plaque surle support magnétique pendant 2 minutes. Jeter le surnageant résiduel.
    17. Dans un tube de 0,2 ml, mélanger 28,5 pi de ET1 et 1,5 pl de solutions de HP3. Ce mélange est pour une piscine, si plusieurs pools sont préparés, multiplier ces volumes par le nombre de piscines préparés.
    18. Retirer la plaque du support magnétique. Ajouter 23 ul du mélange préparé ci-dessus. Régler la pipette de 23 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x. Sceller la plaque et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C.
    19. Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirez le film adhésif et transférer 21 pi de surnageant dans un nouveau plaque de 96 puits.
    20. Ajouter 4 ul de la solution dans chaque puits ET2. Régler la pipette de 25 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x et sceller la plaque.
      REMARQUE: la procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions stocké pendant jusqu'à 7 jours à -15 ° C. Si la plaque est gelé, dégeler complètement avant de commencer la 2 e hybridation.
  3. 2 e hybridation
    1. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Retirez le film adhésif et ajouter 50 ul de NCT1, 10 pi de CSO, et 15 pi de l'eau de qualité PCR à 25 pi de bibliothèque. Régler la pipette 100 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
    2. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    3. Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 2 (tableau 1).

5. ADNg Enrichissement: Jour 2, après-midi

  1. Avant de partir
    1. Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 et solutions HP3 à la température ambiante pour lavage d'hybridation. De la trousse d'enrichissement de l'ADN, décongeler PCR Master Mix contenant polymérase (TC-PMM), amorce de PCR cocktail (PPC), et des solutions RSB sur la glace pour l'amplification PCR.
  2. 2 e hybridation Wash
    1. Suivez exactement le même protocole que pour 4,2 - 1 er hybridation lavage.
  3. Amplification par PCR
    1. Dans une nouvelle plaque de 96 puits, mélanger 20 pi de l'élution de l'étape 5.2, 25 pi de TC-PMM, et 5 pi de PPC. Régler la pipette de 50 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
    2. Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 3 (tableau 1).

6. ADNg Enrichissement: Jour 3

  1. Avant de partir
    1. Thaw RSB solution sur de la glace. Au moins 30 minutes avant l'utilisation, la purification amener des billes magnétiques à la température ambiante.
  2. La purification PCR
    1. Centrifuger la plaque de l'étape 5.3 pour 1 min à 280 g à 20 ° C, et retirez le couvercle adhésif.
    2. A température ambiante, ajouter 90 ul de précédemment mélangé billes magnétiques de purification dans chaque puits. Régler la pipette 140 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 5 min à température ambiante. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair.
    3. Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour les deux échantillons, ajouter 200 ul d'eau distillée et 800 ul d'éthanol). Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.
    4. Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une fois de plus. Assurer la éthanol a été supprimé. Laissez sécher à température ambiante pendant 15 min ou jusqu'à évaporation complète de l'éthanol tandis que la plaque se trouve sur le support magnétique.
    5. Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 30 ul de tampon de RSB. Régler la pipette de 30 pi, et doucement la pipette til totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber la plaque pendant 2 minutes à température ambiante.
    6. Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant apparaît tout à fait clair. Transférer doucement 28 pi du surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits (type de plaque: CTE).
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions stocké à -15 ° C pendant jusqu'à 7 jours.
  3. Bibliothèque de validation et quantification
    1. Déterminer la qualité de la bibliothèque en utilisant un analyseur de fragment. Une électrophorèse sur gel d'acrylamide de haute résolution peut être utilisé pour remplacer les étapes mentionnées ci-dessus mais n'est pas recommandée. Fragments doit être comprise entre 150 pb et 1000 pb.
      REMARQUE: Recommandé: Quantifier la bibliothèque par qPCR pour obtenir le meilleur nombre de clusters au cours du séquençage.
    2. À titre de référence, utiliser une bibliothèque validé (2 nM). Si la première bibliothèque est en cours de préparation, utilisez le phage PhiX ADN (10 nM) prévue pour l'étalonnage de la sequencdispositif ing.
    3. Préparer des dilutions en série du contrôle positif à obtenir 7 points à 20, 16, 8, 6, 4, 2, et 13 heures dans EBT (EB élution tampon + 0,1% de Tween 20). Diluer la bibliothèque d'intérêt à 1/1000 et 1/2000. Chaque point doit être analysé en triple exemplaire.
    4. Préparer le mélange suivant (volumes multipliez par le nombre de puits utilisé): 1 bien, ajouter 10 ul de SYBR Green contenant qPCR Master Mix (2x), 0,2 pi de l'amorce sens (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 pi de amorce inverse (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), et 7,6 pi d'eau PCR grade.
    5. Après le mélange, déposer dans une plaque de 96 puits, 18 ul de mélange dans chaque puits et 2 pi de dilutions de contrôle et de bibliothèque positifs. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Ensuite, placez la plaque dans une PCR quantitative programme du thermocycleur et l'essai 4 (Tableau 1).
    6. Analyser les résultats de la quantification absolue classique pour obtenir le rendement de chaque library. L'avantage de qPCR est qu'il ne permet de quantifier l'ADN qui va interagir avec la cellule d'écoulement.
      NOTE: Ne pas utiliser la quantification fluorimétrique de l'ADN en raison de la présence de molécules mimétiques ADN dans l'un des réactifs. Cette méthode de quantification pour effet de surestimer le rendement bibliothèque et par conséquent sous-estimer le score de clustering.
  4. Séquençage Lancement
    1. Diluer chaque bibliothèque à 4 nM dans un volume final de 30 pi de tampon d'élution (EB), et mettre en commun toutes les bibliothèques et bien mélanger.
    2. Préparer une solution fraîche de 0,2 N NaOH dans du tampon EB et mélanger 10 ul de cette solution de NaOH à 10 ul de bibliothèques regroupées. Bien mélanger et incuber exactement 5 min à température ambiante.
    3. Après 5 min, ajouter immédiatement 980 pi de tampon d'hybridation (de la cartouche de séquençage) et bien mélanger. Ensuite, mélanger 400 pi de ce mélange avec 600 pi de tampon d'hybridation. Bien mélanger et transférer 600 pl dans une cartouche de 300 cycles (2 x 150) pour une injection de 8pM. séquençage de lancement.

Analyse 7. données

  1. Une fois que l'appareil a traité les données, transférer le .bam et fichiers vcf vers un nouvel ordinateur.
    REMARQUE: la fragmentation de Transposase intègre empreintes. Par conséquent, le logiciel de versions automatiquement ces données.
  2. Recueillir des variations génétiques obtenues avec l'analyse de l'appareil.
  3. Analyser les fichiers exportés (.bam, vcf) avec un autre logiciel (Alamut) en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, comparez les variations génétiques obtenues avec les deux analyses. Seulement variations détectées deux fois sont présents.

Tableau 1: conditions de PCR

Programme Température Temps Num. des répétitions
1 72 ° C 3 min 1
98 ° C 30 sec 1
98 ° C 10 sec 10
60 ° C 30 sec
72 ° C 30 sec
72 ° C 5 min 1
10 ° C illimité
2 95 ° C 10 min 1
93 ° C 1 min 1
91 ° C 1 min 1
89 ° C 1 min 1
87 ° C 1 min 1
85 ° C 1 min 1
83 ° C 1 min 1
81 ° C 1 min 1
79 ° C 1 min 1
77 ° C 1 min 1
75 ° C 1 min 1
71 ° C 1 min 1
69 ° C 1 min 1
67 ° C 1 min 1
65 ° C 1 min 1
63 ° C 1 min 1
61 ° C 1 min 1
59 ° C 1 min 1
58 ° C 1 min 16-18 h
3 98 ° C 30 sec 1
98 ° C 10 sec 10
60 ° C 30 sec
72 ° C 30 sec
72 ° C 5 min 1
10 ° C illimité
4 95 ° C 10 min 1
95 ° C 15 sec 40
60 ° C 1 min

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Résultats

Exemple QC Résultats

La capacité de cette méthode pour déterminer des séquences de gènes cibles est basée sur la qualité de l'ADNg (figure 2A) et la qualité de l'étape de tagmentation. Si le tagmentation n'est pas suffisante (Figure 2B, panneau supérieur), le séquençage ne ​​sera pas satisfaisante. Comme mentionné ci-dessus, après la purification de tagmentation, l'ADNg doit être tagmented en fragments de 150 pb à 1000 pb avec la majorité des fragments d'enviro...

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Discussion

L'utilisation généralisée de dispositifs et de technologies de l'END a offert de nouvelles possibilités dans l'étude du cancer et des maladies génétiques. En plus de séquençage du génome entier ou le séquençage de l'ARN, l'analyse d'une grande quantité de certaines séquences d'ADNg de nombreux patients en même temps offre de grandes perspectives dans le diagnostic. Ici, nous avons développé une conception spécifique (disponible sur demande) en utilisant la technologie Nextera d'étudier 11...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions la Ligue contre le Cancer de Côte d’Or et le Centre Georges-François Leclerc pour leur soutien financier. Nous remercions Philip Bastable pour l’édition du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MiSeqIlluminaSY-410-1001Dispositif de séquençage/moyen débit
Nextera Kit d’enrichissementIlluminaFC-123-1208Technologie basée sur la transposase
Cartouche 300 cyclesIllumina15033624
Perles AMPureBeckman CoulterA63881Perles de purification magnétique
Support magnétiqueAlpaquaA32782
Plaques à 96 puits LifeTechnologies4306737
MIDI Plaques à 96 puitsBioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001Ce joint n’est nécessaire que pour l’amplification par PCR. D’autres joints standard peuvent être utilisés tout au long de l’expérience
MiSeqIlluminaFourni avec le dispositif de séquençage
Logiciel Experiment Manager
Adresse Internet : http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
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Références

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