Article de méthode

Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

DOI :

10.3791/51906

⸱

6 juillet 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, University of Manitoba, 2Department of Community Health Sciences, University of Manitoba

Dans cet article

Résumé

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L’utilisation du prélèvement par cytobrosse pour collecter les lymphocytes et les monocytes de l’endocol est une technique peu invasive qui fournit des échantillons pour l’analyse de l’immunité de l’appareil génital féminin. Dans ce protocole, nous décrivons la collecte d’échantillons de cytobrosses et l’isolement de cellules immunitaires pour les tests de cytométrie en flux.

Résumé

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Malgré l’importance pour la santé publique des agents pathogènes de la muqueuse (y compris le VIH), on sait relativement peu de choses sur l’immunité muqueuse, en particulier au niveau de l’appareil génital féminin (FGT). Étant donné que la transmission hétérosexuelle représente aujourd’hui le mécanisme dominant de transmission du VIH, et compte tenu de la propagation continue des infections sexuellement transmissibles (ITS), il est essentiel de comprendre l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène au niveau de la muqueuse génitale. Les lacunes importantes dans les connaissances sur l’immunité FGT sont en partie dues à la difficulté de collecter et de traiter avec succès des échantillons de muqueuse. Afin de faciliter les études avec une taille d’échantillon suffisante, les techniques de collecte doivent être peu invasives et efficaces. À cette fin, un protocole pour la collecte d’échantillons de cytobrosses cervicales et l’isolement ultérieur des cellules mononucléées cervicales (CMC) a été optimisé. En utilisant l’immunophénotypage basé sur la cytométrie en flux ex vivo, il est possible de quantifier avec précision et fiabilité les fréquences et les phénotypes des populations de lymphocytes/monocytes CMC. Cette technique peut être couplée à la collecte d’un lavage cervical-vaginal (CVL), qui contient des médiateurs immunitaires solubles, notamment des cytokines, des chimiokines et des anti-protéases, qui peuvent tous être utilisés pour déterminer l’environnement anti- ou pro-inflammatoire dans le vagin.

Introduction

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La majorité des nouvelles infections à VIH dans le monde se pose par transmission hétérosexuelle, les femmes représentent 47% des nouvelles infections en 2011 (ONUSIDA 1). Comprendre les voies génitales féminines (FGT), l'un des principaux portails d'entrée pour le VIH et d'autres agents pathogènes transmissibles sexuellement, est d'une grande importance sur la voie de trouver des stratégies efficaces pour prévenir l'infection. Les réponses immunitaires à la muqueuse génitale sont bien unique et diffèrent de celles mesurées dans le sang périphérique 2. Cependant, les connaissances actuelles de la dynamique immunitaires à la FGT est limitée au mieux. À ce jour, les études de l'environnement immunitaire muqueux ont surtout porté sur les tissus lymphoïdes associés à l'intestin (GALT), où il est devenu clair que les événements précoces dans les muqueuses après l'infection ont un fort impact sur ​​la suite progression de la maladie 3,4. Prélèvement d'échantillons de la muqueuse génitale représente un grand défi et est au moins partiellement responsable de la lack de compréhension de l'immunologie de la FGT. Résoudre le casse-tête de la dynamique immunitaire entre l'hôte et l'agent pathogène dans le contexte de l'environnement distinct qui est la FGT nécessite des méthodes efficaces pour la collecte et l'analyse des échantillons de ce lieu.

La FGT est divisé en deux sections: l'appareil reproducteur supérieur qui comprend les trompes de Fallope, de l'endomètre et de l'endocol, et la zone inférieure qui contient l'exocol et du vagin (examiné par Kaushic et al 5). Il n'est pas encore clair que la contribution relative de ces différents sites est de l'infection à VIH, mais on pense que les deux sites pourraient contribuer à l'entrée du VIH 6. Les cellules T représentent 40 à 50% des leucocytes dans l'appareil reproducteur supérieure et inférieure, tandis que les macrophages constituent environ 10% (passage en revue dans Rodriguez-Garcia et al 2). Les cellules T peuvent être détectés dans le vagin, le col utérin et de l'endomètre. Les macrophages sont plus fortement localized dans l'endomètre et du tissu conjonctif du myomètre que le col de l'utérus, mais ils peuvent être détectés dans les deux tissus. Enfin, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) et les cellules de Langerhans peuvent également être détectés dans les tissus de traitement des fumées. Le phénotype et les proportions des populations immunitaires et leur susceptibilité à l'infection à VIH peuvent varier surtout selon des cycles hormonaux, l'utilisation de contraceptifs hormonaux, la vaginose bactérienne ou des activités sexuelles 5,7-9.

Diverses méthodes ont été développées pour étudier les populations immunitaires et de l'environnement de la FGT. Biopsie cervicale, cytobrosses col de l'utérus et des lavages cervico-vaginales (CVL) 10-12 sont le plus couramment utilisé dans la littérature. Collection CVL par PBS lavage est la méthode la plus simple et permet l'étude des protéines immunomodulateurs, mais les résultats du rendement des cellules extrêmement faible, et n'est donc pas adapté à l'étude des populations de cellules immunitaires de la FGT 13. Échantillons CVL sont, d'autre part, vEry utile pour évaluer l'environnement à l'abri de la FGT par mesure de l'expression de différentes cytokines, les chimiokines ou les facteurs anti-microbiens à l'aide de méthodes telles que l'ELISA, tableau cytokine de talon 14 ou la spectrométrie de masse 15,16. Caractérisation des fréquences des cellules immunitaires, les phénotypes et des fonctions peut être obtenue en collectant les cellules mononucléaires du col (CMC) par cytobrosse col de l'utérus ou de l'échantillonnage de biopsie cervicale.

L'échantillonnage de biopsie cervicale est une méthode invasive qui augmente l'inconfort et le risque de saignement et prend de 2 à 11 jours pour guérir suivant le mode opératoire en fonction de l'état immunitaire de la femme 12. D'autre part, cytobrosses cervicales, en dépit de la baisse de rendement des cellules recueillies, est un moyen moins invasif et plus commode de recueillir les cellules immunitaires de l'FGT. Les deux méthodes peuvent atteindre le même rendement de leucocytes CD45 +, mais deux cytobrosses cervicales séquentielles sont nécessaires pour obtenir la même quantité de cellules contenues in une biopsie 13. Néanmoins, cytobrosse échantillonnage fournit encore un nombre acceptable de cellules (environ 5000 CD45 + cellules / de cytobrosse) pour plus d'ex vivo phénotypage en cytométrie de flux 14. De plus, la caractérisation fonctionnelle peut être réalisée sur ces échantillons, comme la stimulation et le flux intracellulaire par cytométrie ou qPCR ont été effectuées en utilisant les CMC de cytobrosse dérivé d'identifier les réponses immunitaires spécifiques au VIH 17 ou la polarisation de la cellule Th 18. L'expansion de la population de cellules T peut également faciliter les études fonctionnelles avec CMC 19.

Il est important de noter que les biopsies et cytobrosses échantillonnent des parties distinctes de la FGT. Les biopsies sont obtenues à partir de la partie supérieure de l'épithélium et le stroma de l'exocol 12,13, tandis que cytobrosses cervicales échantillonnent l'orifice utérin, la collecte des cellules dérivées de l'épithélium de l'endocol et vraisemblablement la zone de transformation. Échantillons cytobrosse donc goûter une nouvellerégion composée d'une seule couche de l'épithélium cylindrique, tandis que les biopsies, comprennent une région bordée par un épithélium pavimenteux stratifié 5. Par conséquent, la nature des populations leucocytaires recueillies par biopsie cervicale et cytobrosse diffère. Les biopsies de recueillir une plus grande proportion de cellules T CD3 +, alors que cytobrosses se traduisent par une collection de plus grande proportion de monocytes CD14 + / 13 macrophages.

L'étude de l'immunologie de la FGT a eu un intérêt pour de nombreuses années 20-22 et nous avons accumulé beaucoup d'expertise à l'étude des CMC de cytobrosse dérivés. Nos études portent principalement sur l'étude des infectés par le VIH, non infecté et exposés au VIH séronégatifs (Hesn) femmes travailleuses du sexe de Nairobi, au Kenya. Le VIH se réplique préférentiellement dans les cellules T activées 23 et inférieure du nombre de cellules activées qui peuvent être ciblées par le VIH dans le FGT pourraient contribuer à la protection contre la contamination par le VIH. En accord avec cette hypothèse, plusieurs studies ont décrit l'activation immunitaire plus faible parmi les travailleurs du sexe de Hesn qui sont très exposés au VIH restent encore non infectées 24,25, et ce phénotype de repos est également observée dans le FGT 14. Ici, nous décrivons la méthodologie pour le traitement et l'évaluation des cellules T activation dans des échantillons provenant de CMC cytobrosses col de l'utérus par ex vivo cytométrie de flux.

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Protocole

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Déclaration d'éthique: l'éthique de recherche conseils d'administration de l'Université du Manitoba et Kenyatta National Hospital / Université de Nairobi ont approuvé cette étude et du consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude.

1. Préparation des milieux et CMC Collection Tubes

  1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (NaCl 137,93 mM, 2,67 mM de KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM de KH 2 PO 4). Autoclave pour la stérilité. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois.
  2. Pré-aliquote de 5 ml de PBS dans 50 ml tube Falcon (un par échantillon à prélever) et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de la collecte de l'échantillon.
  3. Étiqueter 2-4 cryotubes ou 1,5 ml microtubes par échantillon pour recueillir lavage pour le stockage.
  4. Préparer un milieu de culture cellulaire: RPMI 1640 + 1% de pénicilline / streptomycine / amphotéricine B (concentration finale de 100 unités / ml, 100 pg / ml et 250 ng / ml, respectively, sans FCS / FBS ajouté.

2. Prélèvement des échantillons cytobrosse

Collection d'échantillons de cytobrosse est une procédure non-invasive qui doit être effectuée par un MD ou un gynécologue qualifié.

  1. Recueillir les cellules mononucléaires du col utérin (CMC) en utilisant à la fois un cytobrosse et un grattoir en bois ou en plastique. Recueillir CMC du participant en cours d'examen au spéculum en insérant le grattoir et tournant autour de l'orifice cervical (Figure 1). Insérez le cytobrosse dans les os endocervical pivoter sur 360 ° et placez juste deux la cytobrosse racloir dans le tube falcon 50ml contenant 5 mL de PBS.
  2. Conserver les échantillons sur glace / à 4 º C jusqu'à leur traitement. Pour maintenir la viabilité des cellules, des échantillons de processus à l'intérieur de deux heures de la collecte.
  3. Si possible, prélever des échantillons de sang appariés en vert meilleurs vacutainers d'héparine pour périphérique de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) d'isolement pour servir un comparateur / contrôle pour l'analyse CMC.

3. Isolation des CMC

Effectuer le traitement des échantillons dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2, dans une enceinte de sécurité biologique stérile avec des gants doubles.

  1. Lors de la collecte, les échantillons de CMC peuvent être contaminés avec du sang. Exclure des échantillons de contamination du sang visible de l'étude afin d'éviter l'inclusion de confusion de PBMC dans l'échantillon final. En raison du faible nombre de lymphocytes isolés à partir d'échantillons de CMC, la contamination du sang mineur peut facilement submerger la composante lymphocytaire CMC.
  2. Tubes vortex de faucon contenant à la fois le cytobrosse et grattoir pour 45 sec de dissocier les cellules des brosses. Les échantillons peuvent devenir mousseux cours de ce processus; ce qui est normal.
  3. Utilisez le cytobrosse pour gratter les restes de hors la raclette, et jeter le racleur dans une solution d'eau de Javel. Pour recueillir les cellules restant attachés à la brosse / grattoir, utilisez un gant frais de serrer la raclette entre le pouce et l'index.Faites glisser la brosse, permettant aux cellules et PBS à collecter dans le même tube de 50 ml. Jeter le cytobrosse dans une solution d'eau de Javel, et jeter le gant.
    IMPORTANT: Utilisez un gant neuf pour chaque échantillon.
  4. Monter un 100 um cellule de nylon filtre à 50 ml tube frais de faucon. En utilisant une pipette de transfert, de recueillir la suspension du PBS-cellule à partir du tube d'échantillon et filtrer à travers le filtre dans le tube frais.
  5. Ajouter 5 ml de RPMI 1640 avec le tube de l'échantillon initial. En utilisant la pipette de transfert, laver les parois du tube d'échantillon avec le RPMI, et transférer à travers le filtre vers le nouveau tube de collecte. Laver le fond du filtre en nylon avec le RPMI ainsi.
  6. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 514 x g. Il est essentiel de laisser le frein de la centrifugeuse au cours de cette étape de réduction, afin d'empêcher le délogement de la pastille CMC.
  7. Retirez délicatement le surnageant du tube, en prenant soin de ne pas perturber le culot. taille de Pellet sera très variable; en sortemoi les échantillons, la pastille est assez grande en raison de la présence de grands nombres de cellules epitheliales, tandis que dans d'autres cas, le culot est à peine visible et très transparente.
  8. Reprendre le culot par agitation douce du tube Falcon. Ajouter 5 ml de PBS pour laver l'échantillon.
  9. Centrifuger à nouveau pendant 10 min à 514 xg sans frein de la centrifugeuse.
  10. Prenez soin de le surnageant et remettre en suspension le culot comme ci-dessus. Les cellules sont prêtes pour la cryoconservation soit (en utilisant un protocole de cryoconservation PBMC), la stimulation ou la cytométrie en flux phénotypage.

4. CMC coloration de surface et cytométrie en flux

  1. Reprendre le culot de l'étape 3.10 dans 100 pi de solution de blocage et transférer soit dans une plaque de 96 puits ou FACS tube. La solution de blocage (pour bloquer les récepteurs Fcy) recette est la suivante: IgG de souris de 1,8 pl (concentration finale de 0,2 pg / pl), 5 pl de FBS et 93,2 ul de lavage FACS (PBS + 2% de FBS).La coloration peut être effectué dans une plaque de 96 puits si la taille des granulés sont assez petites, mais peut avoir besoin d'être effectuée dans des tubes FACS si pastilles sont systématiquement grande. Il est important pour titrer les anticorps en conséquence.
  2. Bloquer les échantillons pendant 10 min sur la glace / à 4 ° C.
  3. Laver les cellules avec 100 pi de FACS de lavage (PBS + 2% de FBS) dans des plaques à 96 puits ou 500 pl dans des tubes FACS. Centrifugeuse à 600 g pendant 10 min à 4 ° C avec le frein à faible (ou hors tension, si un réglage du frein bas n'est pas disponible).
  4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules par agitation. Ajouter viabilité Stain (Live Dead colorant de viabilité réparable). Préparer viabilité colorant selon les instructions du fabricant. Il peut avoir besoin d'être titrée pour une utilisation dans chaque configuration laboratoire / de cytomètre. Incuber pendant 30 min à l'obscurité à 4 ° C.
  5. Laver les cellules 100 μl/500 pi de PBS (pour tubes plaque / FACS 96 puits). Centrifuger à 600 g pendant 10 min à faible / pas de frein. Retirer supernatant et remettre les cellules.
  6. Incuber les cellules avec le cocktail d'anticorps de marqueur de surface, dans un volume total de 100 pl. IMPORTANT: Optimiser et titrer chaque cytométrie en flux panneau avant la coloration de l'échantillon. Incuber les cellules pendant 30 min à l'obscurité à 4 ° C.
  7. Répétez l'étape 4.5. si la coloration dans une plaque à 96 puits, les cellules de transfert à un tube FACS et diluer à un volume final de 750 ul de FACS pour lessive contenant 1% de paraformaldehyde (PFA) (ou Cytofix, dilué à 1 4). Passez à acquisition de données sur un cytomètre de flux.

5. Prélèvement et la préparation de col de l'utérus vaginale Lavage (CVL)

  1. Avant cytobrosse échantillonnage, utiliser une seringue pour laver l'endocol avec 2 ml de PBS stérile et aspirer le liquide de lavage du cul de sac postérieur.
  2. Recueillir l'échantillon de lavage aspiré dans un tube Falcon de 15 ml et garder sur la glace / à 4 º C jusqu'à leur traitement.
  3. Extrait Centrifugeuse à 400 g pendant 7 min pour éliminer les débris cellulaires.
  4. Collect le surnageant, aliquote de l'échantillon dans 1 ml ou 500 aliquotes et conserver à -70 ° C. Aliquotes peuvent être décongelés pour ELISA ou analyse de réseau de billes de protéines CVL, mais éviter de multiples cycles de gel / dégel.
  5. Si l'on désire remettre en suspension le culot de débris cellulaires dans la suite de l'ARN pour mesurer l'expression de l'ARN en suivant le protocole du fabricant.

6. D'acquisition de données

  1. Préparer une série de tubes de compensation qui correspond à la face d'anticorps. Exécutez les tubes de compensation pour ajuster chevauchement spectral. Analyser les échantillons sur un cytomètre de flux multicolore qui est configuré pour les anticorps conjugués à un fluorochrome utilisés dans le panneau.
  2. Acquérir un échantillon PBMC premier à ajuster Forward Scatter (FSC) et Side Scatter (SSC) tension afin de détecter la population de lymphocytes. Essayez de les garder à 100 sur chaque axe sur une échelle linéaire. Exécution d'un contrôle PBMC, il sera beaucoup plus facile de trouver de la population de lymphocytes CMC.
  3. Le seuil de FSC pour les échantillons de CMC peut être augmentée par rapport à des échantillons de PBMC en raison de salir l'axe SSC à de faibles valeurs de FSC.
  4. Vortex chaque tube avant d'acquérir. Acquérir la totalité du tube afin de maximiser le nombre d'événements de grille de lymphocytes recueillis. Surveillez attentivement la machine pour éviter le colmatage.
  5. Exporter les données dans un programme d'analyse de cytométrie de flux tel que FlowJo.

7. Stratégie gate

  1. Sélectionnez Transférer diffusion latérale haute (FSC-H) / Forward zone de diffusion latérale (FSC-A) pour déterminer la population de maillot.
  2. Sélectionnez Temps par rapport marqueur fluorescent (comme par exemple FITC) pour contrôler la qualité de l'acquisition. Changement dans le taux d'écoulement peut introduire des artefacts dans les données. Exclure toute zone qui affiche un écart dans le débit.
  3. Identifier la population de lymphocytes sur SSC-A/FSC-A terrain. Utilisez un contrôle CMSP pour faciliter l'identification. Notez que la population de lymphocytes CMC pourrait ne pas être aussi clair que le contrôle des PBMC.
  4. Porte sur SSC-A/viability colorant d'exclure les cellules mortes de cellules vivantes. La mort des cellules non spécifiquement incorporer les anticorps, qui présentera des artefacts.
  5. Porte sur la SSC-A/CD3 d'identifier la population de cellules T. A partir de cette grille, identifier les populations CD4 + et CD8 +.

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Résultats

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cytométrie de flux multiparamétrique est un outil puissant pour étudier les phénotypes et les fonctions de sous-ensembles de cellules dans les tissus non définies auparavant. L'analyse des échantillons de CMC peut fournir des informations à la fois sur les lymphocytes et monocytes populations avec les stratégies de déclenchement appropriées.

Une stratégie de déclenchement CMC représentant, par rapport à un profil PBMC identifié, est présenté à la figure 2. L'FSC-A par rappor...

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Discussion

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Compte tenu des grandes lacunes dans les connaissances à l'égard de l'immunité à l'appareil génital féminin (FGT), analyse phénotypique de CMC peut fournir un large éventail de points de vue dans les populations de lymphocytes multiples au col. Couplée à l'analyse protéomique et des mesures de la charge virale dans le lavage de l'utérus, l'immunité aux infections sexuellement transmissibles (IST s) et d'autres agents pathogènes peut être disséqué dans diverses populations.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Joshua Kimani, directeur clinique du programme de recherche à l’Université de Nairobi, pour son aide dans les études d’immunologie des muqueuses liées à ce protocole. Les auteurs tiennent à souligner le financement de la subvention MOP 86721 de l’ICVV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 &mu ; Passoire à cellules m pour 50 ml Tube FalconBD352360Traitement CMC
RPMI 1640HycloneSH30027.01Traitement CMC
Sérum fœtal bovinTechnologie Life16000044Traitement CMC
FungizoneTechnologie Life15290-018Traitement CMC
Pénicilline/streptomycineSigmaP4333-20mlTraitement CMC
50 ml Tube FalconFisher14-959-49ATraitement CMC
Pipette de transfert jetable Banque de sangFisher13-711-6MTraitement CMC
Cytobrush plusCooper chirurgicalC0121Échantillonnage CMC
Grattoir cervical jetableMédical rapide2183Prélèvement CMC
15 ml Tube FalconFisher14-959-70cTraitement CVL
Tube de 1,5 ml EppendorfFisher05-402-18Stockage CVL
KIT DE COLORATION CELLULAIRE FIXABLEInvitrogenDiversRéactif de cytométrie en flux
Tampon de fixation (4 % PFA)BD554655Réactif de cytométrie en flux
Souris IgGSigmaI8765Réactif de cytométrie en flux

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
  2. Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
  3. Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
  4. Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
  5. Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
  6. Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
  7. Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
  8. Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
  9. St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
  10. Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
  11. Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
  12. Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
  13. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
  14. Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
  15. Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
  16. Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
  17. Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
  18. McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
  19. Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
  20. Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
  21. Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
  22. Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
  23. Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
  24. McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
  25. Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
  26. Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
  27. Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
  28. Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
  29. Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).

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Mots-clés

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