Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

Summary

L’utilisation du prélèvement par cytobrosse pour collecter les lymphocytes et les monocytes de l’endocol est une technique peu invasive qui fournit des échantillons pour l’analyse de l’immunité de l’appareil génital féminin. Dans ce protocole, nous décrivons la collecte d’échantillons de cytobrosses et l’isolement de cellules immunitaires pour les tests de cytométrie en flux.

Abstract

Malgré l’importance pour la santé publique des agents pathogènes de la muqueuse (y compris le VIH), on sait relativement peu de choses sur l’immunité muqueuse, en particulier au niveau de l’appareil génital féminin (FGT). Étant donné que la transmission hétérosexuelle représente aujourd’hui le mécanisme dominant de transmission du VIH, et compte tenu de la propagation continue des infections sexuellement transmissibles (ITS), il est essentiel de comprendre l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène au niveau de la muqueuse génitale. Les lacunes importantes dans les connaissances sur l’immunité FGT sont en partie dues à la difficulté de collecter et de traiter avec succès des échantillons de muqueuse. Afin de faciliter les études avec une taille d’échantillon suffisante, les techniques de collecte doivent être peu invasives et efficaces. À cette fin, un protocole pour la collecte d’échantillons de cytobrosses cervicales et l’isolement ultérieur des cellules mononucléées cervicales (CMC) a été optimisé. En utilisant l’immunophénotypage basé sur la cytométrie en flux ex vivo, il est possible de quantifier avec précision et fiabilité les fréquences et les phénotypes des populations de lymphocytes/monocytes CMC. Cette technique peut être couplée à la collecte d’un lavage cervical-vaginal (CVL), qui contient des médiateurs immunitaires solubles, notamment des cytokines, des chimiokines et des anti-protéases, qui peuvent tous être utilisés pour déterminer l’environnement anti- ou pro-inflammatoire dans le vagin.

Introduction

La majorité des nouvelles infections à VIH dans le monde se pose par transmission hétérosexuelle, les femmes représentent 47% des nouvelles infections en 2011 (ONUSIDA ^1). Comprendre les voies génitales féminines (FGT), l'un des principaux portails d'entrée pour le VIH et d'autres agents pathogènes transmissibles sexuellement, est d'une grande importance sur la voie de trouver des stratégies efficaces pour prévenir l'infection. Les réponses immunitaires à la muqueuse génitale sont bien unique et diffèrent de celles mesurées dans le sang périphérique ^2. Cependant, les connaissances actuelles de la dynamique immunitaires à la F....

Protocol

Déclaration d'éthique: l'éthique de recherche conseils d'administration de l'Université du Manitoba et Kenyatta National Hospital / Université de Nairobi ont approuvé cette étude et du consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude.

1. Préparation des milieux et CMC Collection Tubes

1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (NaCl 137,93 mM, 2,67 mM de KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, 1,47 mM de KH ₂ PO _4). Autoclave pour la stérilité. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois.
2. Pré-aliquote de 5 ml de PBS dan....

Results

cytométrie de flux multiparamétrique est un outil puissant pour étudier les phénotypes et les fonctions de sous-ensembles de cellules dans les tissus non définies auparavant. L'analyse des échantillons de CMC peut fournir des informations à la fois sur les lymphocytes et monocytes populations avec les stratégies de déclenchement appropriées.

Une stratégie de déclenchement CMC représentant, par rapport à un profil PBMC identifié, est présenté à la figure 2. L'FSC-A par rappor.......

Discussion

Compte tenu des grandes lacunes dans les connaissances à l'égard de l'immunité à l'appareil génital féminin (FGT), analyse phénotypique de CMC peut fournir un large éventail de points de vue dans les populations de lymphocytes multiples au col. Couplée à l'analyse protéomique et des mesures de la charge virale dans le lavage de l'utérus, l'immunité aux infections sexuellement transmissibles (IST s) et d'autres agents pathogènes peut être disséqué dans diverses populations.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 &mu ; Passoire à cellules m pour 50 ml Tube Falcon	BD	352360	Traitement CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	Traitement CMC
Sérum fœtal bovin	Technologie Life	16000044	Traitement CMC
Fungizone	Technologie Life	15290-018	Traitement CMC
Pénicilline/streptomycine	Sigma	P4333-20ml	Traitement CMC
50 ml Tube Falcon	Fisher	14-959-49A	Traitement CMC
Pipette de transfert jetable Banque de sang	Fisher	13-711-6M	Traitement CMC
Cytobrush plus	Cooper chirurgical	C0121	Échantillonnage CMC
Grattoir cervical jetable	Médical rapide	2183	Prélèvement CMC
15 ml Tube Falcon	Fisher	14-959-70c	Traitement CVL
Tube de 1,5 ml Eppendorf	Fisher	05-402-18	Stockage CVL
KIT DE COLORATION CELLULAIRE FIXABLE	Invitrogen	Divers	Réactif de cytométrie en flux
Tampon de fixation (4 % PFA)	BD	554655	Réactif de cytométrie en flux
Souris IgG	Sigma	I8765	Réactif de cytométrie en flux