Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles
Dans cet article
Résumé
Résumé
Maladies dégénératives de la rétine, par exemple, la rétinite pigmentaire, avec des dommages de photorécepteur compte résultant pour la plupart de la perte de vision dans le monde industriel. Les modèles animaux sont d'une importance cruciale pour étudier ces maladies. À cet égard, la toxine spécifique photorécepteur N de -nitrosourea de N (MNU) a été largement utilisé chez les rongeurs pour induire pharmacologiquement dégénérescence rétinienne. Auparavant, nous avons établi un modèle de dégénérescence rétinienne MNU-induite chez le poisson zèbre, un autre système de modèle populaire dans la recherche visuelle.
Une différence fascinant pour les mammifères est la neurogenèse persistante chez l'adulte rétine de poisson zèbre et sa régénération après une lésion. Pour quantifier cette observation, nous avons utilisé des mesures de l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte. De ce fait, le réflexe optocinétique a été utilisé pour suivre les changements fonctionnels chez les poissons non-anesthésié. Ceci a été complété par l'histologie ainsi que staini immunohistochimiqueng de l'apoptose (TUNEL) et la prolifération (PCNA) afin de corréler les changements morphologiques en développement.
En résumé, l'apoptose des photorécepteurs se produit trois jours après le traitement MNU, qui est suivie par une réduction marquée de cellules dans la couche nucléaire externe (ONL). Par la suite, la prolifération des cellules de la couche nucléaire interne (INL) et ONL est observée. Ici, nous révélons que non seulement une complète histologique mais aussi une régénération fonctionnelle se produit sur un parcours de temps de 30 jours. Maintenant, nous illustrons les méthodes de quantification et le suivi ment de la rétine de poisson zèbre et la régénération utilisant MNU dans une vidéo au format.
Introduction
Vision est le sens le plus essentiel pour l'être humain et sa dépréciation a un impact socio-économique élevé. Dans le monde développé, les maladies dégénératives de la rétine sont la principale cause de perte de vision et de cécité chez les personnes âgées 1. La cause de la plupart des maladies dégénératives de la rétine n'est que partiellement comprise et solutions thérapeutiques pour retrouver la vision perdue sont très limitées. La rétinite pigmentaire est un exemple typique d'une maladie dégénérative de la rétine avec une perte des photorécepteurs primaire 2-3. N-méthyl-N -nitrosourea (MNU) induit la dégénérescence réti....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences ont adhéré à la Déclaration de l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO).
1. Animaux
- Maintenir le poisson zèbre de type sauvage (Danio rerio) de la souche AB (Oregon) âgés de 6-12 mois dans des conditions standard dans l'eau avec une température de 26,5 ° C et un 14/10 h cycle lumière / obscurité 15.
- Suivez les directives de protection des animaux des établissements concernés pour les expériences sur les animaux après l'approbation par l'Office vétérinaire cantona....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Acuité visuelle:
Le dispositif expérimental [de fréquence spatiale: 0.042 cercles / degré (c / d); contraste: 100%; vitesse de dérive: 20 degrés / seconde (d / src); retour luminance lumineuse: 152 cd / m 2] de cette étude a permis évaluation Oberkirchenrätin de poisson zèbre adulte. La durée moyenne de mesure VA était d'environ 5 - 10 minutes pour chaque poisson zèbre, qui bien toléré la procédure. L'acuité visuelle avant l'exposition MNU était 0,577 ± 0,014 cycles / degré (c / d.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Auparavant, notre groupe a transféré le modèle MNU de dégénérescence des photorécepteurs de rongeurs dans le système poisson-zèbre 9. Les événements qui ont suivi ont été décrits et suivis pendant 30 jours. En cette période de dégénérescence rétinienne morphologique complet et la régénération se sont produits après le traitement initial. Tout d'abord, l'histologie révèle une cellule de tige réduite compter du jour 3 avec un minimum à jour 8 En conséquence, la coloration TUNEL identifie l'apoptose .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Monika Kilchenmann, Federica Bisignani et Agathe Duda pour leur excellente assistance technique.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide acétique | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | A6283 | |
| Ammoniac | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 294993 | 0,80 % |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| Support de montage DAPI | Vector Labs, Burlingame, CA, États-Unis | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 45260 | |
| Éthanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 2860 | 100 %, 96 %, 70 % |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | ED | |
| Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | E10521 | Tricaïne |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 3989 | |
| Chèvre anti-lapin Alexa 594 | Life Technologies, Zoug, Suisse ; | A11012 | |
| Sérum normal de chèvre | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Acide chlorhydrique | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 320331 | 0,20 % |
| Kit de détection de la mort cellulaire in situ | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Suisse | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer’s hemalum solution | Merck, Darmstadt, Allemagne | 109249 | |
| Methylnitrosourrea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | N4766 | |
| Toxic OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a.Paraformaldéhyde | |
| (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Lapin anti-PCNA ; | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, États-Unis | sc-33756 | |
| Lames en verre Superfrost Plus | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Allemagne | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse | 534056 | |
| Poisson-zèbre (Danio rerio) souche AB (Oregon) | Université de Fribourg, Département de biologie | n.d.Propre | pisciculture |
Références
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, a....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
