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Article de méthode

Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles

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DOI :

10.3791/51909

20 octobre 2014

Dans cet article

Résumé

Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur ​​la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.

Résumé

Maladies dégénératives de la rétine, par exemple, la rétinite pigmentaire, avec des dommages de photorécepteur compte résultant pour la plupart de la perte de vision dans le monde industriel. Les modèles animaux sont d'une importance cruciale pour étudier ces maladies. À cet égard, la toxine spécifique photorécepteur N de -nitrosourea de N (MNU) a été largement utilisé chez les rongeurs pour induire pharmacologiquement dégénérescence rétinienne. Auparavant, nous avons établi un modèle de dégénérescence rétinienne MNU-induite chez le poisson zèbre, un autre système de modèle populaire dans la recherche visuelle.

Une différence fascinant pour les mammifères est la neurogenèse persistante chez l'adulte rétine de poisson zèbre et sa régénération après une lésion. Pour quantifier cette observation, nous avons utilisé des mesures de l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte. De ce fait, le réflexe optocinétique a été utilisé pour suivre les changements fonctionnels chez les poissons non-anesthésié. Ceci a été complété par l'histologie ainsi que staini immunohistochimiqueng de l'apoptose (TUNEL) et la prolifération (PCNA) afin de corréler les changements morphologiques en développement.

En résumé, l'apoptose des photorécepteurs se produit trois jours après le traitement MNU, qui est suivie par une réduction marquée de cellules dans la couche nucléaire externe (ONL). Par la suite, la prolifération des cellules de la couche nucléaire interne (INL) et ONL est observée. Ici, nous révélons que non seulement une complète histologique mais aussi une régénération fonctionnelle se produit sur un parcours de temps de 30 jours. Maintenant, nous illustrons les méthodes de quantification et le suivi ment de la rétine de poisson zèbre et la régénération utilisant MNU dans une vidéo au format.

Introduction

Vision est le sens le plus essentiel pour l'être humain et sa dépréciation a un impact socio-économique élevé. Dans le monde développé, les maladies dégénératives de la rétine sont la principale cause de perte de vision et de cécité chez les personnes âgées 1. La cause de la plupart des maladies dégénératives de la rétine n'est que partiellement comprise et solutions thérapeutiques pour retrouver la vision perdue sont très limitées. La rétinite pigmentaire est un exemple typique d'une maladie dégénérative de la rétine avec une perte des photorécepteurs primaire 2-3. N-méthyl-N -nitrosourea (MNU) induit la dégénérescence réti....

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Protocole

Toutes les expériences ont adhéré à la Déclaration de l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO).

1. Animaux

  1. Maintenir le poisson zèbre de type sauvage (Danio rerio) de la souche AB (Oregon) âgés de 6-12 mois dans des conditions standard dans l'eau avec une température de 26,5 ° C et un 14/10 h cycle lumière / obscurité 15.
  2. Suivez les directives de protection des animaux des établissements concernés pour les expériences sur les animaux après l'approbation par l'Office vétérinaire cantona....

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Résultats

Acuité visuelle:

Le dispositif expérimental [de fréquence spatiale: 0.042 cercles / degré (c / d); contraste: 100%; vitesse de dérive: 20 degrés / seconde (d / src); retour luminance lumineuse: 152 cd / m 2] de cette étude a permis évaluation Oberkirchenrätin de poisson zèbre adulte. La durée moyenne de mesure VA était d'environ 5 - 10 minutes pour chaque poisson zèbre, qui bien toléré la procédure. L'acuité visuelle avant l'exposition MNU était 0,577 ± 0,014 cycles / degré (c / d.......

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Discussion

Auparavant, notre groupe a transféré le modèle MNU de dégénérescence des photorécepteurs de rongeurs dans le système poisson-zèbre 9. Les événements qui ont suivi ont été décrits et suivis pendant 30 jours. En cette période de dégénérescence rétinienne morphologique complet et la régénération se sont produits après le traitement initial. Tout d'abord, l'histologie révèle une cellule de tige réduite compter du jour 3 avec un minimum à jour 8 En conséquence, la coloration TUNEL identifie l'apoptose .......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Monika Kilchenmann, Federica Bisignani et Agathe Duda pour leur excellente assistance technique.

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueSigma-Aldrich, Buchs, SuisseA6283
AmmoniacSigma-Aldrich, Buchs, Suisse2949930,80 %
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse05470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
Support de montage DAPIVector Labs, Burlingame, CA, États-UnisH-1200
EosinSigma-Aldrich, Buchs, Suisse45260
ÉthanolSigma-Aldrich, Buchs, Suisse2860100 %, 96 %, 70 %
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseED
Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoateSigma-Aldrich, Buchs, SuisseE10521Tricaïne
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Suisse3989
Chèvre anti-lapin Alexa 594Life Technologies, Zoug, Suisse  ;A11012
Sérum normal de chèvreDako, Glostrup, DanmarkX0907
Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich, Buchs, Suisse3203310,20 %
Kit de détection de la mort cellulaire in situRoche Applied Sciences, Rotkreuz, Suisse11684795910TUNEL Kit
Mayer’s hemalum solutionMerck, Darmstadt, Allemagne109249
Methylnitrosourrea (MNU)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseN4766
Toxic OptoMotryCerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canadan.a.Paraformaldéhyde
(PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP6148
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP5368
Proteinase KDako, Glostrup, DanmarkS3004
Lapin anti-PCNA  ;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, États-Unissc-33756
Lames en verre Superfrost PlusGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Allemagne10149870
Tris buffered saline (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP5912
Trizma baseSigma-Aldrich, Buchs, SuisseT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP1379
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Suisse534056
Poisson-zèbre (Danio rerio) souche AB (Oregon)Université de Fribourg, Département de biologien.d.Proprepisciculture

Références

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, a....

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