Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Summary

L’analyse de l’expression des protéines dans les jeunes valves embryonnaires de souris a été entravée par le tissu limité disponible. Ce manuscrit fournit un protocole pour la préparation de protéines à partir de régions valvulaires embryonnaires de souris en développement pour l’analyse par transfert Western.

Abstract

L’analyse par transfert Western est une technique couramment utilisée pour détecter et quantifier les niveaux de protéines. Cependant, pour les petits échantillons de tissus, cette méthode d’analyse peut ne pas être suffisamment sensible pour détecter une protéine d’intérêt. Pour surmonter ces difficultés, nous avons examiné des protocoles d’obtention de protéines à partir de valves cardiaques humaines adultes et avons modifié ces protocoles pour les homologues embryonnaires précoces en développement. En bref, les régions de la valve aortique embryonnaire de souris, y compris la valve aortique et la paroi aortique environnante, sont collectées dans le volume minimal possible d’un tampon de lyse à base de Tris avec des inhibiteurs de protéase. Si nécessaire, selon la stratégie de reproduction, les embryons sont génotypés avant de regrouper quatre régions de la valve aortique embryonnaire pour l’homogénéisation. Après homogénéisation, un tampon d’échantillon basé sur SDS est utilisé pour dénaturer l’échantillon afin de l’exécuter sur un gel SDS-PAGE et de l’analyse ultérieure par transfert Western. Bien que la concentration en protéines demeure trop faible pour être quantifiée à l’aide d’essais de quantification des protéines par spectrophotométrie et qu’il reste de l’échantillon pour des analyses ultérieures, cette technique peut être utilisée pour détecter et semi-quantifier avec succès les protéines phosphorylées par transfert Western à partir d’échantillons groupés de quatre régions embryonnaires de la valve aortique de souris du jour 13,5, chacune produisant environ 1 μg de protéines. Cette technique sera bénéfique pour l’étude de l’activation de la voie de signalisation cellulaire et des niveaux d’expression des protéines au cours du développement précoce de la valve embryonnaire de souris.

Introduction

Etre capable d'identifier et de quantifier les niveaux d'expression de protéine est une technique standard pour animale et des expériences basées sur des cellules. Cependant, malgré un intérêt de longue date dans le développement de valve cardiaque embryonnaire précoce, l'évaluation de l'expression des protéines dans ce tissu spécifique au cours du développement est actuellement limité à l'immunohistochimie à la fois le poussin et ^1,2 de la souris. Une partie de la difficulté à quantifier l'expression des protéines dans les soupapes de développement de la plupart des organismes modèles (par exemple, poulet et de souris) est....

Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. accise de la valve aortique

1. En utilisant une technique d'euthanasie approuvé pour le stade embryonnaire d'intérêt, euthanasier une souris enceinte de chiots à la journée embryonnaire souhaitée (E) de développement.
2. Utiliser 70% d'éthanol pour stériliser l'abdomen de la femme enceinte. Soulevez la peau et les muscles du bas-ventre et à l'écart des organes internes, et de disséquer cavité abdominale inférieure ouverte la femm....

Results

Grâce à cette technique de préparation, nous avons pu détecter phosphorylée Smad ^1,5,8 (pSmad) dans les régions de la valve aortique unique à partir de E13.5 embryons. Comme le montre la Figure 1A, la protéine isolée à partir d'une même région de la soupape est suffisant pour détecter une bande de pSmad faible. L'intensité du signal augmente proportionnellement au nombre de régions de soupapes qui sont mises en commun. Fait important, la pSmad rapport a / β-actine reste à peu près constant à .......

Discussion

La capacité à quantifier les niveaux de protéines au début embryon de souris et poussin régions cardiaques de soupape constitue un outil supplémentaire pour comprendre les événements de signalisation cellulaires critiques pour le développement de la vanne. Notre protocole décrit ici ne diffère pas beaucoup de procédures d'isolement de protéines standard. Cependant, en modifiant quelques étapes clés, nous avons réussi à obtenir des protéines phosphorylées de tailles très petits échantillons. Pour atteindre ce résulta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Souris			À disséquer au stade embryonnaire d’intérêt
Microscope stéréoscopique	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Microciseaux	Outils de science fine	15003-08
Pince fine, #5	Outils de science fine	11251-30
Aiguille de dissection Ted	Pella Inc.	13560
Aiguilles de dissection	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 &mu ; l, avec embouts
Tampon			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 %
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	Ajouter 1 comprimé à 10 ml de tampon de lyse
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Perles d’acier inoxydable	Qiagen	69989
Microcentrifugeuse