ARN-Seq analyse de l'expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

Résumé

Cette vidéo montre les étapes de base pour effectuer une analyse du transcriptome entier sur des échantillons de moelle épinière embryonnaire de poussin disséqués après transfection avec électroporation in ovo.

Résumé

L’électroporation in ovo du tube neural du poussin est une méthode rapide et peu coûteuse pour l’identification de la fonction des gènes au cours du développement neuronal. L’analyse à l’échelle du génome des transcrits exprimés différentiellement après une telle manipulation expérimentale a le potentiel de découvrir une image presque complète des effets en aval causés par la construction transfectée. Ce travail décrit une méthode simple de comparaison des transcriptomes d’échantillons de moelles épinières embryonnaires transfectées, comprenant toutes les étapes entre l’électroporation et l’identification des transcrits exprimés de manière différentielle. La première étape consiste en des directives pour l’électroporation et des instructions pour la dissection de moitiés de moelle épinière transfectées à partir d’embryons HH23 dans un environnement exempt de ribonucléase et l’extraction d’échantillons d’ARN de haute qualité adaptés au séquençage du transcriptome. L’étape suivante est celle de l’analyse bio-informatique avec des directives générales pour le filtrage et la comparaison des ensembles de données RNA-Seq dans le serveur public Galaxy, ce qui élimine le besoin d’une structure de calcul locale pour les expériences à petite et moyenne échelle. Les résultats représentatifs montrent que les méthodes de dissection génèrent des échantillons d’ARN de haute qualité et que les transcriptomes obtenus à partir de deux échantillons de contrôle sont essentiellement les mêmes, une condition importante pour la détection des gènes d’expression différentielle dans les échantillons expérimentaux. En outre, un exemple est fourni où la surexpression expérimentale d’une construction d’ADN peut être vérifiée visuellement après comparaison avec des échantillons de contrôle. L’application de cette méthode peut être un outil puissant pour faciliter de nouvelles découvertes sur la fonction des facteurs neuronaux impliqués dans le développement précoce de la moelle épinière.

Introduction

Les études génétiques sur les organismes vivants utilisent fréquemment l'embryon de poulet comme modèle parce que dans l'électroporation in ovo représente un moyen rapide et peu coûteux pour la transfection partiellement structures embryonnaires in vivo avec des constructions d'ADN ^1-5. Des vecteurs d'expression bicistronique qui codent pour un produit de transcription contenant un rapporteur fluorescent en même temps que le gène d'intérêt, comme pCIG ⁶ ou ⁷ PMES, permettent une vérification rapide de la qualité de la transfection dans la région souhaitée sous un stéréomicroscope avant de....

Protocole

1. électroporer la construction d'intérêt dans les tubes neuraux de HH12-13 embryons de poulet in ovo

Utilisez un rapporteur fluorescent, de préférence dans une transcription bicistronique ou fusionnée à la protéine d'intérêt avec un 2a virale intercalant peptide ^11, pour permettre l'identification rapide des individus avec des niveaux satisfaisants de transfection. REMARQUE: Le temps d'incubation typique pour ce stade est d'environ 48 heures à 37,8 ° C.

1. Ouvrir une petite fenêtre dans les œufs après avoir enlevé 3 ml d'albumine avec une seringue couplée à un 18 G x 1 1/2 aiguille. Pou....

Résultats

Pour valider la méthode décrite, deux échantillons de contrôle ont été générés à partir d'embryons électroporées avec le vecteur PMES vide ⁷ et un échantillon à partir d'embryons transfectées avec le même vecteur contenant l'insert construire SCRT2-ZNF, qui code pour les domaines en doigt de zinc de poulet SCRT2 ^18. Les échantillons donnant des 11 à 22 pg d'ARN total ont été obtenus chacun à partir de pools de 8 à 12 embryons. Les trois échantillons ont obtenu une valeur optimale RIN de 10 à un con.......

Discussion

Ici nous fournissons des lignes directrices pour l'analyse des effets après l'électroporation de la poule de la moelle épinière. Bien que l'électroporation de vecteurs d'ADN est plus fréquemment utilisé pour surexprimer un gène d'intérêt, on peut aussi utiliser des constructions codant des dominants négatifs, protéines quimeric ou précurseurs de siRNA pour créer les conditions fonction des gènes knock-down ^19-21. En effet, la comparaison des profils de transcriptome résultant de l'anal.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Encre de Chine	Tout fournisseur
18G x 1 1/2 aiguille	BD	305196
seringue de 3 ml	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Bleu 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Colorant alimentaire utilisé pour visualiser l’injection
d’ADN Solution de Ringer (1 L)
;   ;   ;   ; - 7,2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
²   ;   ;   ; - 0,37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
;   ;   ;   ; - 0,225 g de CaCl2• ; 2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
;   ;   ;   ; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
;   ;   ;   ; - 0,02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
;   ;   ;   ; - ddH2O à 800 ml et ajuster le pH à 7,4
;   ;   ; - ddH2O à 1 L
;   ;   ;   ; - Filtre et autoclave
PBS (solution tamponnée au phosphate) (1 L)
;   ;   ;   ; - 8 g de NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
;   ;   ;   ; - 0,2 g de KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
;   ;   ; - 1,15 g Na2HPO4• ; 7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
;   ;   ;   ; - 0,2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
² ;   ;   ;   ; - ddH2O à 800 ml et ajuster le pH à 7,2
;   ;   ; - ddH2O à 1 L et filtre
;   ;   ;   ; - 1 ml de DEPC (Diéthylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
;   ;   ;   ; - Agitez vigoureusement et laissez reposer toute la nuit à température
.   ;   ;   ; - Autoclave
Cuillère tamisée	Tout fournisseur
Stérile 60 x 15 mm polystyrène Boîtes de Pétri	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap Solution de décontamination RNase	Life Technologies	AM9780
Ciseaux chirurgicaux à pointe fine	Tout fournisseur
Pince à épiler droite à pointe fine	Tout fournisseur
Aiguille en verre tiré à partir de tubes capillaires en verre de 1,1 x 75 mm	Kimble Chase	40A502
Pipette Pasteur en verre 9''	Tout fournisseur
Pompe à pipette manuelle	Tout fournisseur
Transparent Microcentrifugeuse Tubes en polypropylène de 1,5 ml	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifugeuse	Tout fournisseur
Solution RNAlater pour la stabilisation de l’ARN	Life Technologies	AM7020
Kit d’isolement de l’ARN total aqueux	Life Technologies	AM1912
Biologie moléculaire Éthanol de qualité Tout	fournisseur
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Électrophorèse Instrument de bioanalyseur	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq Kit de préparation d’échantillons d’ARN v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002

ambiante