Article de méthode

ARN-Seq analyse de l'expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

DOI :

10.3791/51951

⸱

1 novembre 2014

 , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Universidade de São Paulo

Dans cet article

Résumé

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Cette vidéo montre les étapes de base pour effectuer une analyse du transcriptome entier sur des échantillons de moelle épinière embryonnaire de poussin disséqués après transfection avec électroporation in ovo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroporation in ovo du tube neural du poussin est une méthode rapide et peu coûteuse pour l’identification de la fonction des gènes au cours du développement neuronal. L’analyse à l’échelle du génome des transcrits exprimés différentiellement après une telle manipulation expérimentale a le potentiel de découvrir une image presque complète des effets en aval causés par la construction transfectée. Ce travail décrit une méthode simple de comparaison des transcriptomes d’échantillons de moelles épinières embryonnaires transfectées, comprenant toutes les étapes entre l’électroporation et l’identification des transcrits exprimés de manière différentielle. La première étape consiste en des directives pour l’électroporation et des instructions pour la dissection de moitiés de moelle épinière transfectées à partir d’embryons HH23 dans un environnement exempt de ribonucléase et l’extraction d’échantillons d’ARN de haute qualité adaptés au séquençage du transcriptome. L’étape suivante est celle de l’analyse bio-informatique avec des directives générales pour le filtrage et la comparaison des ensembles de données RNA-Seq dans le serveur public Galaxy, ce qui élimine le besoin d’une structure de calcul locale pour les expériences à petite et moyenne échelle. Les résultats représentatifs montrent que les méthodes de dissection génèrent des échantillons d’ARN de haute qualité et que les transcriptomes obtenus à partir de deux échantillons de contrôle sont essentiellement les mêmes, une condition importante pour la détection des gènes d’expression différentielle dans les échantillons expérimentaux. En outre, un exemple est fourni où la surexpression expérimentale d’une construction d’ADN peut être vérifiée visuellement après comparaison avec des échantillons de contrôle. L’application de cette méthode peut être un outil puissant pour faciliter de nouvelles découvertes sur la fonction des facteurs neuronaux impliqués dans le développement précoce de la moelle épinière.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études génétiques sur les organismes vivants utilisent fréquemment l'embryon de poulet comme modèle parce que dans l'électroporation in ovo représente un moyen rapide et peu coûteux pour la transfection partiellement structures embryonnaires in vivo avec des constructions d'ADN 1-5. Des vecteurs d'expression bicistronique qui codent pour un produit de transcription contenant un rapporteur fluorescent en même temps que le gène d'intérêt, comme pCIG 6 ou 7 PMES, permettent une vérification rapide de la qualité de la transfection dans la région souhaitée sous un stéréomicroscope avant de traiter les embryons pour l'analyse en aval.

Avec les progrès récents dans le séquençage de l'ADN, il est maintenant possible d'obtenir des profils d'expression numériques entières du transcriptome à partir d'échantillons d'ARN en utilisant l'ARN-Seq 8,9. Par conséquent, au lieu des méthodes fastidieuses qui permettent l'analyse de seulement un petit nombre de produits de gènes en parallèle, telles que l'hybridation in situ, immunohistochimie et PCR quantitative, la préparation de banques d'ADNc pour enséquençage à haut débit peut fournir des informations de l'ensemble du transcriptome. Observation des effets expérimentaux sur les niveaux de tous les gènes d'expression peut à son tour conduire à dégager sur les voies modifiés par la construction utilisée. Ceci est particulièrement facile si un assemblage génomique de l'organisme utilisé est disponible, donc l'embryon de poulet est de nouveau un modèle approprié.

Si l'utilisateur a accès à un centre de séquençage du génome fiable, le principal problème est l'obtention d'échantillons d'ARN de haute qualité. Ce travail démontre une méthode pour obtenir des échantillons d'ARN à partir de tubes de neurones transfectées appropriés pour l'ARN-Seq, ainsi que les étapes en aval pour l'analyse in silico des ensembles de données obtenus. Après électroporation à HH12-13 suivie par 48 heures d'incubation, le tronc transfectées moitiés de la moelle épinière ont été disséqués dans des conditions exemptes de ribonucléase, immédiatement lysées et plus protégés de la dégradation par ultra-bas jusqu'à ce que le gel purification d'ARN et bibliothèque preparation.

Le serveur public Galaxy 10 donne accès à des ressources gratuites pour l'analyse des données de séquençage à haut débit. La quantité d'espace offert pour les utilisateurs enregistrés est suffisant pour de petites expériences, éliminant ainsi le besoin d'une infrastructure informatique locale. L'analyse des données de l'ARN-Seq comprend le filtrage, l'alignement et la quantification / comparaison de l'expression du gène. Bien qu'il existe des lignes directrices générales pour l'analyse des données de l'ARN-Seq, les paramètres de filtrage dépendra en grande partie sur la qualité de séquençage et devraient être déterminés après analyse de contrôle de la qualité des données brutes.

Ce protocole décrit les étapes pour obtenir et comparer les profils d'ARN-Seq de poulet embryonnaire de la moelle épinière transfectées in vivo. Comme un résultat représentatif, la comparaison des ensembles de données obtenues à partir de deux échantillons de contrôle indépendants transfectées avec un vecteur vide ont montré que le procédé est reproductible et devrait permettre l'identification de différentiellement exprestranscriptions sed dans les échantillons expérimentaux. Par conséquent, l'application de cette méthode a le potentiel d'augmenter considérablement le nombre de découvertes après une expérience unique et de fournir ainsi un vaste ensemble de données pour l'enquête subséquente.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. électroporer la construction d'intérêt dans les tubes neuraux de HH12-13 embryons de poulet in ovo

Utilisez un rapporteur fluorescent, de préférence dans une transcription bicistronique ou fusionnée à la protéine d'intérêt avec un 2a virale intercalant peptide 11, pour permettre l'identification rapide des individus avec des niveaux satisfaisants de transfection. REMARQUE: Le temps d'incubation typique pour ce stade est d'environ 48 heures à 37,8 ° C.

  1. Ouvrir une petite fenêtre dans les œufs après avoir enlevé 3 ml d'albumine avec une seringue couplée à un 18 G x 1 1/2 aiguille. Pour améliorer la visualisation embryon, injecter une petite quantité d'encre de Chine diluée à 1:50 dans la solution de Ringer stérile sous l'embryon 1-4.
  2. Après avoir recouvert l'embryon avec une solution de Ringer stérile, injecter une solution 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 et 0,1% de colorant alimentaire (F, D & C) contenant 2,5 pg / pl d'ADN à travers l'extrémité postérieure du tube neural jusqu'à ce qu'il remplissejusqu'à la région du cerveau postérieur. Pour l'électroporation, des électrodes de platine de positionnement (0,5 mm) de diamètre 4 mm séparées par une région le long du flanc et de fournir des impulsions de 5 à 50 ms et 20 V avec un intervalle de 100 ms entre les quatre.
  3. Après électroporation, incuber embryons manipulés pendant 48 heures de plus jusqu'à ce qu'ils atteignent HH23 de stade et d'identifier les personnes présentant un niveau élevé de transfection à la région flanc sous un stéréomicroscope fluorescent.
    REMARQUE: La durée d'incubation après l'électroporation dépend du but de l'expérience. Les plasmides par électroporation peuvent générer des niveaux d'expression importants après 2 h 2. Ainsi, si l'intérêt réside dans les gènes de l'apparition précoce de la période d'incubation post-électroporation peut être réduite.

2. Récolte succès transfectées embryons et disséquer les moitiés de la moelle épinière électroporation

Remarque: Cette procédure dure 2 à 3 heures pour 10 embryons et les rendements 1-2 Ug d'ARN total par embryon. La dissection de tubes neuraux nécessite des mouvements fins et quelques séances de pratique peut être nécessaire avant de l'appliquer à des échantillons expérimentaux.

  1. Décontaminer les outils de dissection métalliques avec une solution de décontamination RNase ou par cuisson à 150 ° C pendant 4 heures et 12 préparer traitée au DEPC PBS. Utilisez uniquement du matériel en plastique sans RNase certifié.
    NOTE: Après la récolte, il est important de suivre un traitement standard pour prévenir la contamination RNase lors de la dissection.
  2. Récolter les embryons en utilisant une paire de ciseaux fins de dissection et une collection cuillère tamisé. Gardez les embryons dans le froid traitée au DEPC PBS dans une boîte de 100 mm de Pétri.
  3. Avec une paire de pinces fines, découper la région du flanc ensemble (entre la limite postérieure du bourgeon de membre antérieur et la limite antérieure du bourgeon de membre postérieur) et transférer cette section à un nouveau plat contenant froid traitée au DEPC PBS.
  4. Utilisez deux aiguilles fines de verre de perforer à trois différentsles points de chaque côté dorsolatéral de l'embryon entre le tube neural et le mésoderme paraxial.
  5. Introduire les deux aiguilles de verre dans la perforation centrale et se déplacent lentement l'un d'entre eux une distance le long de l'axe antéro-postérieur du tube neural. Répétez cette opération pour les perforations qui ne sont pas atteints par les premiers mouvements. Retirez le mésoderme paraxial individuelle avec une paire de pinces fines.
  6. Tourner l'embryon côté, insérer les extrémités des pinces entre le tube neural et la notochorde et faites-les glisser dans des directions opposées le long de l'axe antéro-postérieur de séparer les deux structures.
    NOTE: Ce devrait également éliminer la plupart du mésoderme encore attachés au tube neural.
  7. Si nécessaire, retirez les morceaux plus gros de tissu mésodermique qui restent attachées en tirant avec une pince à épiler tout en tenant légèrement le tube neural avec une autre paire de pinces. Lorsque vous avez terminé, doucement transférer le tube neural à un autre plat contenant PBS froid de DEPC-traités à l'aide d'unRNase-free pipette Pasteur en verre reliée à une pompe manuelle de la pipette et de garder sur de la glace jusqu'à ce que tous les tubes sont disséqués.
  8. Diviser les tubes neuraux en deux moitiés. Pour cela, insérez la pointe acérée d'une paire de pinces fermé dans la lumière et ouvrir la plaque de toit en déplaçant les pinces à travers elle. Après cela, séparer les deux moitiés en coupant la plaque de fond avec les pincettes conseils.
  9. Trier électroporation moitiés de non-électroporation sous un microscope à dissection à fluorescence et le transfert d'un tube de 1,5 ml rempli avec glacée traitée au DEPC PBS. Si nécessaire, feuilleter les microtubes doucement pour libérer tous les tissus fixés aux parois en matière plastique et de favoriser la sédimentation des tubes.
  10. Spin à 100 g pendant 3 secondes et enlever très lentement autant que possible PBS avec 1 ml micropipette. Pour ce faire, tout en regardant une source de lumière qui brille à travers le microtube pour surveiller si tout matériel embryonnaire est aspiré à la pointe de la pipette; si cela se produit, décharger lentement et répéter la centrifugation.
  11. Ajouter 70 ul de solution de lyse pour l'extraction de l'ARN par neural moitié du tube et secouez le tube pour mélanger le contenu. Incuber à température ambiante pendant 5 min et vigoureusement vortex. Répéter l'incubation de 5 min et agitation au vortex à deux reprises. Conserver à -80 ° C.
  12. Recueillir au moins huit moitiés du tube neural par exemple pour assurer un rendement adéquat pour l'étape suivante. En commun des échantillons plus petits si plusieurs sessions électroporation / dissection doivent amasser un nombre suffisant de tubes neuraux. Stocker suffisamment d'échantillons pour des doubles ou des triples exemplaires pour chaque condition.

3. Purifier l'ARN et préparer des banques pour Illumina séquençage

  1. Retirer les échantillons de -80 ° C stockage et placer sur la glace pendant 15-30 min. Reprendre décongélation à température ambiante jusqu'à la fin.
  2. Vortex bien et laissez à température ambiante pendant 5 min. Vortex nouveau et centrifuger à 15 000 g pendant 1 min à granulés insoluble.
  3. Transférer le surnageant dans un nouveau tubeet procéder à l'extraction de l'ARN selon le total isolement d'ARN instructions du manuel du kit. On élue dans le volume minimum recommandé pour augmenter la concentration.
    REMARQUE: traitement à la DNase après nettoyage est recommandé afin d'éviter la contamination potentielle des séquences d'ADN génomique dans les ensembles de données d'ARN-Seq.
  4. Feuilletez le tube pour mélanger le contenu et enlever 5 pi pour l'analyse de contrôle de la qualité. Conserver l'échantillon restant à -80 ° C jusqu'à ce que la préparation bibliothèque; Ces échantillons doivent être décongelés que une fois pour éviter la dégradation de l'ARN.
  5. Exécutez ARN purifié dans un instrument Bioanalyzer utilisant le kit RNA 6000 Nano; Valeur RIN doit être au moins au-dessus de 7 pour continuer.
  6. Générer des bibliothèques en utilisant un kit de préparation de bibliothèque Illumina compatible ARN-Seq et multiplexer jusqu'à 4 bibliothèques dans une voie d'un instrument de HiSeq mis à produire 100 pb seul lit. Si possible, inclure tous les échantillons dans la même série de minimiser les artefacts techniques potentiels.
    NOTE: Ce devrait produire jusqu'à 50 millions de rEADS par exemple, qui est plus que suffisant pour obtenir une couverture pour la plupart des gènes 13.

4. Comparer les ensembles de données d'ARN-Seq dans le serveur Galaxy publique 10.

REMARQUE: l'espace de stockage du serveur est limité et expériences comparant de nombreux échantillons peut exiger la suppression des fichiers intermédiaires générés dans les étapes de filtrage.

  1. Créez un compte d'utilisateur dans le serveur public Galaxy ( https://usegalaxy.org ) et FTP télécharger les jeux de données Illumina au format fastq.
  2. Préparer les fichiers téléchargés avec l'outil FastqGroomer 14 sous la NGS: Menu QC et la manipulation; si les scores de qualité sont déjà codés dans Phred + 33 (Sanger), ignorez cette étape en changeant simplement le type de fichier à fastqsanger sous les attributs de chaque ensemble de données.
  3. Analyser la qualité générale de chaque ensemble de données en utilisant l'outil FastQC sous la NGS: QC et manipulation moinu.
    REMARQUE: Une attention particulière doit être accordée aux graphiques qui en résultent pour le contenu de la séquence par la qualité de la séquence de base et par la base, car ceux-ci de fournir des estimations pour les paramètres utilisés pour tailler les extrémités du lit.
  4. Garniture lit à jeter des extrémités 3 'des données de faible qualité à l'aide de l'outil FASTQ qualité Trimmer 14 sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l'outil de ne traiter que des extrémités 3 'pour le niveau de qualité en dessous de 20.
  5. Retirer séquences d'adaptation de lit à l'aide de l'outil Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l'outil à jeter lit à moins de 45 pb à gauche, saisir la séquence de l'adaptateur utilisé et choisir la sortie d'inclure les deux séquences coupées et non tronquée. En outre, choisir de ne pas jeter des séquences avec des bases inconnues puisque la plupart des bases de faible qualité ont déjà été supprimés dans la dernière étape.
  6. Utilisation de l'outil séquences TRIM ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sous la NGS: QC et le menu de manipulation, couper les premières bases de la lecture de se retirer 5 partialité »de séquence détectée par FastQC (généralement 10).
    NOTE: A ce stade, il est une bonne idée de lancer FastQC nouveau et comparer avec l'analyse précédente pour déterminer si la qualité de l'ensemble de données a été améliorée.
  7. Téléchargez et décompressez la dernière assemblée du génome du poulet pour le navigateur de génome UCSC d'Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) et télécharger l'ensemble du fichier de format fasta génome et le fichier d'annotation des gènes de format gtf à l'histoire Galaxy utilisant le fichier de téléchargement de l'outil dans le menu Get Data.
  8. Carte lit pour chaque échantillon pour le génome du poulet à l'aide du dispositif d'alignement 15 sous TopHat2les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d'utiliser un génome de l'Histoire (sélectionnez le fichier fasta téléchargé à l'étape 4.7).
  9. Construire un transcriptome prédite pour chaque échantillon à l'aide de manchette 16 sous les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d'utiliser l'annotation de référence comme guide (sélectionnez le fichier téléchargé à l'étape gtf 4.7) et tourner sur les options Effectuer correction du biais (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7) et multi-usage lire correct.
  10. Fusionner transcriptomes prévues pour tous les échantillons à l'aide Cuffmerge 16 sous la NGS: Menu ARN analyse. Choisissez d'utiliser l'annotation de référence (fichier gtf de l'étape 4.7) et les données de séquence (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7).
  11. Comparer les fichiers générés par BAM TopHat2 pour chaque échantillon en utilisant Cuffdiff 16 sous la NGS: Menu ARN analyse. Dans les transcriptions de terrain sélectionner le moitranscriptome rged généré par Cuffmerge et activer les options Effectuer correction du biais (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7) et multi-usage lire correct.
  12. Trier expression différentielle tester tables numérique croissant dans la colonne 13 (valeur de q) à l'aide de l'outil Trier sous le filtre et le menu Trier.
    NOTE: Les gènes / transcriptions montrant une expression différentielle significative entre les conditions expérimentales présentera les valeurs de q plus bas.
  13. Pour vérifier les résultats visuellement avec des graphiques de couverture, d'abord convertir les fichiers au format BAM bedGraph utilisant l'outil Créer une BedGraph de couverture du génome 17 sous le menu bedtools. Désactiver le rapport de régions sans couverture, choisir de traiter les entrées d'épissage que des intervalles distincts et l'échelle de la couverture par un facteur qui normalise profondeur de séquençage pour tous les ensembles de données comparées.
  14. Convertir le fichier résultant au format bedGraph Bigwig l'aide de laoutil perruque / BedGraph à gros bonnet ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) dans le menu des formats de convertir. Téléchargez les fichiers gros bonnets comme des pistes coutume dans le navigateur de génome UCSC ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) pour l'assemblage galGal4 et rechercher un gène d'intérêt à visualiser la couverture dans les ensembles de données.

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Résultats

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Pour valider la méthode décrite, deux échantillons de contrôle ont été générés à partir d'embryons électroporées avec le vecteur PMES vide 7 et un échantillon à partir d'embryons transfectées avec le même vecteur contenant l'insert construire SCRT2-ZNF, qui code pour les domaines en doigt de zinc de poulet SCRT2 18. Les échantillons donnant des 11 à 22 pg d'ARN total ont été obtenus chacun à partir de pools de 8 à 12 embryons. Les trois échantillons ont obtenu une valeur optimale RIN de 10 à un con...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous fournissons des lignes directrices pour l'analyse des effets après l'électroporation de la poule de la moelle épinière. Bien que l'électroporation de vecteurs d'ADN est plus fréquemment utilisé pour surexprimer un gène d'intérêt, on peut aussi utiliser des constructions codant des dominants négatifs, protéines quimeric ou précurseurs de siRNA pour créer les conditions fonction des gènes knock-down 19-21. En effet, la comparaison des profils de transcriptome résultant de l'anal...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CYIY est soutenu par la FAPESP (2012/14421-5) et FMV est soutenu par une bourse de la FAPESP (2009/53695-0). Nous remercions le DNA Technologies Core de l’Université de Californie à Davis pour la préparation et le séquençage des banques RNA-Seq utilisées dans ce travail, l’équipe Galaxy pour avoir fourni une excellente interface gratuite pour les outils d’analyse de données de séquençage à haut débit et le Dr Marianne Bronner pour nous avoir permis de filmer dans son laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Encre de ChineTout fournisseur
18G x 1 1/2 aiguilleBD305196
seringue de 3 mlBD309657
TrisMP Biomedicals819620
F D & C Bleu 1Spectra Colors Corporation5.FC.0010P0Colorant alimentaire utilisé pour visualiser l’injection
d’ADN Solution de Ringer (1 L)
  ;   ;   ;   ; - 7,2 g NaClSigma-AldrichS-9888
²   ;   ;   ; - 0,37 g KClSigma-AldrichP-4504
  ;   ;   ;   ; - 0,225 g de CaCl2• ; 2H2OFisher Scientific10043-52-4
  ;   ;   ;   ; - 0,217 g Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS-9390
  ;   ;   ;   ; - 0,02 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
  ;   ;   ;   ; - ddH2O à 800 ml et ajuster le pH à 7,4
  ;   ;   ; - ddH2O à 1 L
  ;   ;   ;   ; - Filtre et autoclave
PBS (solution tamponnée au phosphate) (1 L)
  ;   ;   ;   ; - 8 g de NaClSigma-AldrichS-9888
 ;   ;   ;   ; - 0,2 g de KClSigma-AldrichP-4504
  ;   ;   ; - 1,15 g Na2HPO4• ; 7H2OSigma-AldrichS-9390
  ;   ;   ;   ; - 0,2 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
² ;   ;   ;   ; - ddH2O à 800 ml et ajuster le pH à 7,2
  ;   ;   ; - ddH2O à 1 L et filtre
  ;   ;   ;   ; - 1 ml de DEPC (Diéthylpyrocarbonate)Sigma-AldrichD-5758
  ;   ;   ;   ; - Agitez vigoureusement et laissez reposer toute la nuit à température
.   ;   ;   ; - Autoclave
Cuillère tamiséeTout fournisseur
Stérile 60 x 15 mm polystyrène Boîtes de PétriCorning Life Sciences351007
RNaseZap Solution de décontamination RNaseLife TechnologiesAM9780
Ciseaux chirurgicaux à pointe fineTout fournisseur
Pince à épiler droite à pointe fineTout fournisseur
Aiguille en verre tiré à partir de tubes capillaires en verre de 1,1 x 75 mmKimble Chase40A502
Pipette Pasteur en verre 9''Tout fournisseur
Pompe à pipette manuelleTout fournisseur
Transparent Microcentrifugeuse Tubes en polypropylène de 1,5 mlCorning Life SciencesMCT-150-C
MicrocentrifugeuseTout fournisseur
Solution RNAlater pour la stabilisation de l’ARNLife TechnologiesAM7020
Kit d’isolement de l’ARN total aqueuxLife TechnologiesAM1912
Biologie moléculaire Éthanol de qualité Toutfournisseur
RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
2100 Électrophorèse Instrument de bioanalyseurAgilent TechnologiesG2939AA
Truseq Kit de préparation d’échantillons d’ARN v2IlluminaRS-122-2001/RS-122-2002
ambiante

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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