Propagation d&#39;<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Par<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Culture Cellulaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l'infection. L'ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.

Résumé

Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l'agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l'agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d'une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l'ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu'à 96 heures après l'infection, qui a été le point d'être déterminé avant l'effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l'activité virale sur l'intégrité de l'attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d'être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d'un biopesticide.

Introduction

Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord ^1. Gestion des populations d'insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l'industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et....

Protocole

1 Culture Cellulaire

REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches.

1. Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm ² flacons de culture.
2. Cultiver et maintenir les cultures dans 25 cm ² flacons de culture de tissu en utilisant un milieu H2G + cicade....

Résultats

attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance du tout. Les ce.......

Discussion

Préoccupations croissantes concernant l'introduction d'espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l'agriculture parce que l'a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fioles de culture cellulaire Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Surface 25 cm2, col incliné, capuchon (joint d’étanchéité)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Microscope inversé et caméra
Trypsine-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049	0,25 %, filtré stérile, BioReagent, adapté à la culture cellulaire, 2,5 g de trypsine porcine et 0,2 g d’EDTA &bull ; 4Na par litre de Hanks&prime ; Solution saline équilibrée avec rouge de phénol
Greiner CELLSTAR Plaques de culture multipuits	Sigma Aldrich	M8937	48 puits (TC traité avec couvercle)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Diéthyldithiocarbamate de sodium trihydraté
Système de filtration sous vide pour bouteille Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Membrane en acétate de cellulose, taille des pores 0,45 & mu ; m, surface de la membrane 54,5 cm2, capacité du filtre 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyéthylène glycol hexadécyléther
Solution tampon de phosphate	Sigma Aldrich	P5244	Reçu sous forme de 100 mM dilué à 10 mM avec de l’eau stérile
TRIzol LS	Life Technologies	10296-028
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	Pour électrophorèse
Bromure d’éthidium	Sigma Aldrich	E7637	BioRéactif, pour la biologie moléculaire, poudre
QIAquick	Qiagen	28704
QuantiTect qRT-PCR kit	Qiagen	204243
4 % de paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	P6148	Qualité réactif, cristallin
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate solution saline tamponnée
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Rhodamine red conjuguée phalloïdine	Life Technologies	R415	La rhodamine phalloïdine est une sonde de haute affinité F-actine conjuguée au colorant fluorescent rouge-orange, tétraméthylrhodamine
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
ProLong Gold Antifade Reagent	Life Technologies	P36934
LSM510 Système méta confocal	Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Logiciel	Carl Zeiss
Grace' s Milieu insecte (supplémenté, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ cicadelle medium component
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ cicadelle medium component Medium
199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ cicadelle medium component
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ cicadelle medium component
Hank' s Sels équilibrés (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ cicadelle moyenne composant
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ cicadelle moyen composant
MEM, mélange d’acides aminés (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ cicadelle moyen composant
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ cicadelle moyenne
composant Pen-Strep (avec / glutamine)	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ cicadelle moyenne composant
Nystatine	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ cicadelle moyenne composant
Gentamycine	Sigma Aldrich	46305	H2G+ cicadelle moyenne
composant Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ cicadelle moyenne composant
Sérum fœtal bovin	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ cicadelle medium composant