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Article de méthode

Propagation d'

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DOI :

10.3791/51953

⸱

25 septembre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l'infection. L'ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.

Résumé

Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l'agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l'agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d'une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l'ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu'à 96 heures après l'infection, qui a été le point d'être déterminé avant l'effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l'activité virale sur l'intégrité de l'attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d'être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d'un biopesticide.

Introduction

Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord 1. Gestion des populations d'insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l'industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et démontré que l'augmentation de la mortalité chez les populations de 2-4, tout en réduisant la résistance de l'insecte aux insecticides.

Développement de méthodes de manière efficace arrière infecté H. vitripennis à l'âge adulte dans un environnement de laboratoire ont été difficiles car H. vitripennis ont des besoins nutritionnels spécifiques de stade qui nécessitent une grande variété de plantes hôtes 5-8. Installations spécifiques sont nécessaires pour H. direct arrière vitripennis aux États-Unis; Par conséquent, la culture cellulaire est plus économique et une alternative viable, ainsi que de plus en plus vital pour HoCV-01 détection et la réplication 2,9. Bien que les méthodes de base pour établir des cultures de cellules de H. vitripennis sont décrites, ces méthodes n'ont pas encore été utilisées pour la production commerciale d'agents de lutte biologique, tels que les virus 2.

L'objectif global des procédures suivantes est de produire une forte concentration de HoCV-01 convient pour une utilisation comme agent de lutte biologique. La réplication virale nécessite une cellule vivante, ce qui explique pourquoi cultiver avec succès et l'optimisation de H. vitripennis cultures est vitale pour le progrès de produire des niveaux rentables de virus.

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Protocole

1 Culture Cellulaire

REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches.

  1. Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm 2 flacons de culture.
  2. Cultiver et maintenir les cultures dans 25 cm 2 flacons de culture de tissu en utilisant un milieu H2G + cicadelle, un média d'abeilles WH2 modifié 10 (tableau 1).
  3. Incuber des flacons de culture à 24 ° C avec ~ 53% d'humidité.
  4. Utilisez un microscope inversé à un grossissement total (TM) de 100X pour surveiller la croissance de la culture, par exemple, vérifier toute croissance cellulaire anormale, surveiller les contaminants potentiels, et vérifier les progrès de la croissance dans le culsurface ture.
  5. Effectuer un changement de milieu complet (~ 4 ml de milieu de culture par flacon) tous les 7 - 10 jours sans perturber la surface de culture.
  6. Faire passer les cultures lorsque la surface de culture est d'environ 80% couvert par une croissance cellulaire (confluent) en utilisant 0,25% de trypsine contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour dissocier les cellules. Ajouter ~ 2 - 3 ml de trypsine à chaque flacon de culture et d'exposer la culture (s) de l'enzyme de courtes périodes de temps (5-10 minutes) pour réaliser une dissociation complète des cellules.
  7. Ajouter une quantité égale de milieu frais au récipient de culture (s) (~ 2 - 3 ml) pour arrêter l'activité enzymatique et de transférer l'ensemble de la solution dans un tube conique de centrifugation.
  8. cellules de pellets par centrifugation à 4 ° C pendant 6 minutes à 350 x g.
  9. Eliminer le surnageant sans perturber le culot de cellules et ajouter ~ 8 ml de milieu frais à chaque tube. Homogénéiser doucement cellules à l'aide d'une pipette.
  10. cultures de Split à un ratio 1: 2 pour 25 cm 2 flacons (~ 4 ml de soluti cellulairepar ballon sur) et laisser les cultures fraîchement passés au repos pendant 48 heures pour permettre aux cellules en suspension à attacher à la surface du ballon.
    REMARQUE: La culture de cellules de 48 puits stériles, des plaques de culture de tissu avec une surface de 1 cm 2 de croissance est également possible et on peut être maintenue de la même façon que les flacons de culture à une réduction de volume du milieu de culture à ~ 250 ul.

2 Extraction de virus entier

  1. Homogénéiser corps entiers de virus H. positif vitripennis dans un tampon phosphate, pH ~ 7,2, avec diéthyldithiocarbamate de sodium à 0,02% trihydrate (DETCA) par vortex pendant ~ 10 secondes d'intervalle jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de grosses touffes de tissus présents. Extrait virus via superspeed centrifugation à 124 500 g pendant 4 heures à 4 ° C ou 22 000 g pendant 16 heures à 4 ° C. Si un précipité se forme à la surface, les retirer avec un coton-tige stérile 11.
  2. Jeter le surnageant.
  3. Recueillir le culot etdissoudre avec 5 ml de tampon phosphate 10 mM (pas de DETCA), pH ~ 7,2, contenant 0,4% d'acide désoxycholique et Na-éther de polyéthylène glycol d'hexadécyle de 4% (Brij 52).
    1. Pour bien mélanger le culot, retirez la boulette du côté du tube et écraser jusqu'à en solution si nécessaire.
    2. Ajouter plus de tampon phosphate 10 mM dans ~ 5 ml incréments pour aider le culot aller dans une solution en cas de besoin et de les combiner en 2 tubes 11.
  4. Centrifuger la solution à 300 g pendant 15 min 11.
  5. Enlever le surnageant et passer la solution à travers un filtre de 0,45 um, et recueillir le filtrat dans un tube à grande collection 11.
  6. Transférer le filtrat sur ​​une membrane de dialyse avec un poids moléculaire coupée (MWCO) de 3,5 kD, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 mM (pH 7) contenant aucun DETCA 11 si nécessaire.
  7. Placer la membrane de dialyse dans un grand bol rempli de trou DDH 2 O à 4 ° C. Changer le trou DDH 2 O chaque heure fou 5-6 heures, jusqu'à ce qu'un précipité blanc se forme dans la membrane 11.
  8. Recueillir le virus purifié à partir de l'intérieur de la membrane et de soumettre la solution de virus à 100% pour une série de dilutions de 10 fois par l'ajout de 10 ul de solution de 90 pl de trou DDH 2 O. Ensuite ajouter 10 ul de la dilution d'un autre 90 ul de trou DDH 2 O jusqu'à une dilution de 1: 100 000.
  9. solution de virus de magasin à -80 ° C.

3. réplication virale

  1. cellules de semences dans des plaques de culture de 48 puits et se développent toutes les lignes jusqu'à ce que la croissance des cellules est de 80% de confluence (environ post-passe 72 heures si les cellules se développent à un taux moyen).
  2. Inoculer chaque rangée de cellules par le virus dilué en série lorsque la croissance cellulaire atteint la confluence, c'est à dire, une ligne d'une dilution de 1:10, une ligne d'une dilution de 1: 100, etc, à l'exception de la rangée du haut. Utilisez la rangée du haut comme témoin et ajouter 10 ul de ddH 2 O dans chaque puits comme un contrôle de volume.
    1. Afin d'établir une concentration de cellules de base de départ pour la comparaison avec le nombre de cellules expérimentales, de dissocier et de compter le premier puits de chaque rangée avant l'inoculation initiale de tous les puits dans les cultures infectées par le virus.
  3. Surveiller les plaques de culture toutes les 24 h après l'inoculation virale de tout changement de couleur dans le milieu indiquant un changement de pH et des éventuelles modifications de la morphologie des cellules.
  4. L'image d'une colonne de la plaque d'essai à chaque point de temps, à l'aide d'un microscope inversé à 100X TM.
  5. Retirez tout support de la colonne qui a été reproduite à chaque point de temps de 24 heures et le stocker à court terme à -20 ° C pour l'extraction de l'ARN et la quantification virale ou à long terme à -80 ° C.
  6. Dissocier les cellules des puits après l'élimination du milieu tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.9, en utilisant seulement ~ 250 pl de 0,25% d'EDTA à la trypsine et du milieu frais pour arrêter l'activité enzymatique et ~ 250 pl de milieu frais pour remettre en suspension la pelle cellulairet.
  7. Ajouter 10 ul de 0,4% trypan bleuissement à chaque tube contenant des cellules pour effectuer des comptages de cellules après dissociation de cellule pour chaque période de 24 heures sur une semaine. Laisser tache à reposer pendant 10 min avant d'effectuer la numération des cellules.
    1. Effectuer le nombre de cellules dans 1 heure d'exposition à tacher ou cellules viables va commencer à absorption tache ainsi que les cellules non-viables.
  8. Ajouter lentement 10 ul de la solution de cellules colorées de chaque côté d'un hémocytomètre standard à l'aide d'une micropipette. Laisser la solution pour être repris par une action capillaire pour éviter les bulles d'air.
  9. Compter le nombre de cellules viables (non colorées) des deux côtés de l'hématimètre (l'équivalent de 4 chefs d'accusation de 16 places dans le hématimètre). Effectuer le nombre de cellules de chaque puits de la colonne qui a été supprimé.
  10. En moyenne le nombre de cellules de chaque colonne et utiliser la formule suivante pour obtenir le nombre total de comptage cellulaire: (nombre moyen de cellules / 4) x facteur de dilution = nombre de cellules x 10 4 ml. Il s'agit de la densité cellulaire ou le nombre de cellules viables dans la culture.

4. Virus Extraction de culture cellulaire

  1. Retirer H. traité vitripennis cellules provenant des flacons de culture tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.8, en utilisant seulement ~ 250 ul d'EDTA 0,25% de trypsine et du milieu frais pour arrêter l'activité enzymatique.
  2. Jeter le surnageant.
  3. Extrait virus à partir des cellules de culture en suivant le protocole précédemment décrit dans les étapes 2.3 à 2.8.

5 Extraction de l'ARN

  1. Extraire l'ARN à partir d'échantillons prélevés au cours de chaque moyen d'essai de virus d'une semaine à l'aide d'une extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium conçu pour des échantillons liquides par le protocole du fabricant.
  2. Magasin extrait des échantillons à -80 ° C.

6. RT-PCR

  1. Établir des normes viraux pour la RT-PCR en exécutant PCR traditionnelle utilisant lepaire d'amorces primaire HoCV RT-PCR 1 (avant 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-inverser ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') par le virus isoler de tout corps H. vitripennis.
  2. Sous réserve de produit de PCR à une électrophorèse sur gel de 60 min à 120 V dans un gel d'agarose à 2% contenant 0,1% de bromure d'éthidium.
  3. Exciser les bandes à partir du gel et on purifie en utilisant un kit d'extraction de gel selon le protocole du fabricant.
  4. Piscine toute excisée et le produit purifié sur gel et purifier davantage par précipitation à l'éthanol de base. On élue le produit de précipitation dans environ 30 ul de Tris EDTA (TE) pour augmenter la concentration de l'échantillon global.
  5. Quantifier le niveau de l'ADNc dans les échantillons mis en commun par spectrophotométrie en utilisant les paramètres de longueur d'onde 260/230 pour la détection d'acide nucléique.
  6. Effectuer une série de dilution en série de dix fois de l'échantillon purifié allant de 57 ng / ul à 57 ag / ul (10 -18). Réaliser des dilutions en série du même type que celui décrit in 2.8 avec des ajustements effectués pour la différence dans les exigences de concentration.
  7. Déterminer les limites de détection de la série de dilutions en effectuant qRT-PCR en utilisant un kit de qRT-PCR avec une quantification fiable de transcrits de faible abondance.
    REMARQUE: Les concentrations virales inférieure à 5 x 10 -3 copies ne sont pas détectables.
  8. Extraire l'ARN à partir d'échantillons expérimentaux comme décrit précédemment à l'étape 5.1 et de quantifier par spectrophotométrie.
  9. Normaliser tous les échantillons prélevés à 5 ng / ul avec de l'eau sans nucléase.
  10. Effectuer qRT-PCR sur tous les échantillons, en double, que les réactions 25 ul en utilisant un kit qRT-PCR en une seule étape avec la possibilité de détecter un faible nombre de copies de la manière suivante: 50 ° C pendant 10 min tenir; 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s; faire fondre de 50 à 99 ° C pendant 5 secondes à chaque étape.
    1. Faire le mélange maître de sorte que chaque mélange réactionnel contient 12,5 pi de maste 1xr mélange, 1,0 pi (0,3 M) de l'amorce de l'avant, 1,0 pi (0,3 M) de l'amorce inverse, 0,25 ul de la transcriptase inverse et des quantités variables de modèle basé sur des valeurs de normalisation.
    2. Amener le volume réactionnel total de 25 ul avec de l'eau libre de la RNase.
    3. Inclure les cinq concentrations standard dans chaque PCR effectuées avec les nombres de copies suivantes: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 et 5 x 10 -2 copies. Régler le seuil pour chaque course juste au-dessous d'une fluorescence de 10x -2,5 à réduire le bruit lors de l'acquisition précoce au début de chaque course.

7. microscopie confocale

  1. Cultiver les cellules Homalodisca de douze dans une même plaque contenant des lamelles de verre mesurant 18 mm de diamètre dans chaque puits.
  2. Inoculer une colonne sur la plaque toutes les 24 heures pendant une période de quatre jours, une fois par monocouche est obtenue. Veiller à ce que chaque cOLONNE puits contient un contrôle, une faible dilution virale (1:10) et ainsi une dilution virale élevée (1: 100.000) bien. Utiliser des solutions de virus obtenus à l'étape 2.8.
  3. Retirez tous les supports sur le cinquième jour et laver les cellules deux fois avec 1x PBS (pH 7,4).
  4. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% à froid à 4 ° C pendant 30 min.
  5. Ajouter 500 ul de 1x tampon phosphate salin (PBS) pour les cellules et les laver pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur à faible vitesse. Laver les cellules trois fois.
  6. Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 aux cellules pour les perméabiliser. Laisser reposer pendant 10 min à température ambiante.
  7. Laver les cellules de nouveau tel que décrit précédemment à l'étape 7.5.
  8. Ajouter 500 ul d'une albumine de sérum bovin (BSA), une solution à 5% pour bloquer les cellules à température ambiante. Laisser reposer pendant 2 h puis retirez.
  9. Diluer actions rhodamine phalloïdine conjugué à du rouge (RCP) 1: 250 dans du PBS 1X contenant 5% de BSA et ajouter 250 microlitres de la dilution à chaque puits pour tache de F-actine.
  10. Plaque de couverture en aluminium fhuile pour empêcher le colorant de blanchiment et incuber les cellules à 4 ° CO / N.
  11. Retirez le RCP après 12 heures d'incubation et le remplacer par 250 pi de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (250 pg / ml) dilué dans du PBS 1X contenant 5% de BSA, pour colorer les noyaux des cellules .
  12. Incuber les cellules contenant du DAPI à la température ambiante pendant 1 heure.
  13. Laver les cellules trois fois avec du PBS 1x, comme décrit précédemment à l'étape 7.5.
  14. Retirez délicatement les lamelles des puits et installer des lames de microscope à l'aide d'un milieu de montage avec un réactif anti-fade.
  15. Laisser sécher les lames en opaque boîtes à être examinés au microscope confocal. Voir préparé diapositives dès que possible en tant que colorants peuvent s'estomper rapidement.
  16. Images colorées cellules en utilisant un système confocal équipé d'un microscope contenant une lentille 63X (huile) Plan-apochromate.
    1. Définissez les longueurs d'onde laser à 543 ± 10 nm excitation et 575 ± 10 nm émission pour Rhoadmine phalloïdine rouge-conjucated, Et 369 ± 10 nm excitation et 450 ± 30 nm émission pour DAPI.
    2. Utilisation gain identique et les paramètres pour compenser le détecteur afin d'obtenir toutes les images.
    3. Traiter les images en utilisant un logiciel approprié pour le traitement de l'image et de tri et d'importer des images de votre choix dans un logiciel de gestion d'image.

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Résultats

attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance du tout. Les ce...

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Discussion

Préoccupations croissantes concernant l'introduction d'espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l'agriculture parce que l'a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Texas Pierce’s Disease Research and Education Program et l’USDA-APHIS pour leur soutien financier à ce projet. Nous tenons également à remercier Hema Kothari du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à Tyler pour son aide en microscopie confocale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fioles de culture cellulaire CorningSigma AldrichCLS430168Surface 25 cm2, col incliné, capuchon (joint d’étanchéité)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusMicroscope inversé et caméra
Trypsine-EDTA solutionSigma AldrichT40490,25 %, filtré stérile, BioReagent, adapté à la culture cellulaire, 2,5 g de trypsine porcine et 0,2 g d’EDTA &bull ; 4Na par litre de Hanks&prime ; Solution saline équilibrée avec rouge de phénol
Greiner CELLSTAR Plaques de culture multipuitsSigma AldrichM893748 puits (TC traité avec couvercle)
DETCASigma Aldrich228680Diéthyldithiocarbamate de sodium trihydraté
Système de filtration sous vide pour bouteille CorningSigma AldrichCLS431206Membrane en acétate de cellulose, taille des pores 0,45 & mu ; m, surface de la membrane 54,5 cm2, capacité du filtre 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Polyéthylène glycol hexadécyléther
Solution tampon de phosphateSigma AldrichP5244Reçu sous forme de 100 mM dilué à 10 mM avec de l’eau stérile
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304Pour électrophorèse
Bromure d’éthidiumSigma AldrichE7637BioRéactif, pour la biologie moléculaire, poudre
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitQiagen204243
4 % de paraformaldéhydeSigma AldrichP6148Qualité réactif, cristallin
PBSSigma AldrichP5368Phosphate solution saline tamponnée
Triton X-100Sigma AldrichX100
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichA2153
Rhodamine red conjuguée phalloïdineLife TechnologiesR415La rhodamine phalloïdine est une sonde de haute affinité F-actine conjuguée au colorant fluorescent rouge-orange, tétraméthylrhodamine
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36934
LSM510 Système méta confocalCarl Zeiss
LSM Zen 2007 LogicielCarl Zeiss
Grace' s Milieu insecte (supplémenté, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ cicadelle medium component
L-histidine monohydrateSigma AldrichH8125H2G+ cicadelle medium component Medium
199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ cicadelle medium component
Medium 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ cicadelle medium component
Hank' s Sels équilibrés (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ cicadelle moyenne composant
L-Glutamine (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ cicadelle moyen composant
MEM, mélange d’acides aminés (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ cicadelle moyen composant
1 M MgCl solutionSigma AldrichM8266H2G+ cicadelle moyenne
composant Pen-Strep (avec / glutamine)Sigma AldrichG6784H2G+ cicadelle moyenne composant
NystatineSigma AldrichN6261H2G+ cicadelle moyenne composant
GentamycineSigma Aldrich46305H2G+ cicadelle moyenne
composant DextroseSigma AldrichD9434H2G+ cicadelle moyenne composant
Sérum fœtal bovinSigma AldrichF2442H2G+ cicadelle medium composant

Références

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