La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Résumé

Ce protocole présente une méthode efficace et fiable pour la transfection humains THP-1 macrophages avec siRNA ou de l'ADN plasmidique par électroporation à haut rendement de transfection tout en maintenant la vitalité des cellules haute capacité et des macrophages plein de différenciation et polarisation.

Résumé

Macrophages, comme des acteurs clés de la réponse immunitaire innée, sont au centre de recherche portant sur l'homéostasie tissulaire ou diverses pathologies. Transfection avec le siRNA et l'ADN plasmidique est un outil efficace pour l'étude de leur fonction, mais transfection des macrophages n'est pas une mince affaire. Bien que de nombreuses approches différentes pour la transfection de cellules eucaryotes sont disponibles, seuls quelques-uns permettent la transfection efficace et fiable des macrophages, mais la vitalité des cellules et réduit le comportement des cellules sévèrement altérée comme une diminution de la capacité de différenciation ou de la polarisation sont fréquemment observées. Par conséquent, un protocole de transfection est nécessaire, qui est capable de transférer les siRNA et de l'ADN plasmidique dans les macrophages sans provoquer d'effets secondaires graves, permettant ainsi l'investigation de l'effet de l'ARNsi ou plasmide dans le cadre du comportement normal de la cellule. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour transfecter des humains THP-1 et des macrophages monocytes avec vitalité cellulaire élevée, une haute efficacité de la transfection, et des effets minimes sur le comportement des cellules. Cette approche est basée sur nucléofection et le protocole a été optimisé pour maintenir une capacité maximale pour l'activation des cellules après transfection. Le protocole est suffisant pour les cellules adhérentes après détachement ainsi que des cellules en suspension, et peut être utilisée pour de petits nombres d'échantillons de taille moyenne. Ainsi, le procédé présenté est utile pour étudier les effets de régulation de gènes au cours de la différenciation des macrophages et de la polarisation. Outre la présentation des résultats caractérisant les macrophages transfectées selon ce protocole par rapport à une méthode chimique de remplacement, l'impact de la culture cellulaire milieu de sélection après transfection sur le comportement des cellules est également discutée. Les données présentées indiquent l'importance de valider la sélection pour les différents paramètres expérimentaux.

Introduction

Parmi les composants cellulaires du système immunitaire humain, les macrophages sont d'une grande importance pour la réponse immunitaire innée. Leurs tâches sont diverses; elles sont impliquées dans la phagocytose des agents pathogènes et des tissus nécrotiques, ils jouent un rôle important dans l'homéostasie tissulaire et produisent et sécrètent un grand nombre de cytokines et de réguler orchestrer la réponse immunitaire ^1. Par conséquent macrophages sont intégralement impliqués dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques conditions. En raison de la diversité de leurs tâches, les macrophages sont un type de cellule très hétérogène et multiforme. Ce résultat est obtenu par des polarisations différentes; selon les macrophages de stimuli externes peut se développer en différents phénotypes ^2. La variabilité et de l'impact de macrophages sur la réponse immunitaire en font un très intéressant sujet de recherche. Afin d'élucider leur métabolique complexe et les fonctions de réglementation, de macrophages approprié dans des modèles in vitro sont required qui reflètent correctement macrophages hétérogénéité et la variabilité.

La transfection de cellules avec des vecteurs d'ADN plasmidique ou de petits ARN interférents (siRNA) afin de modifier l'expression des gènes cellulaire est devenu un outil largement utilisé et puissant en biologie cellulaire pour étudier la fois la régulation des gènes et la fonction des gènes. Actuellement, il ya un grand choix de différents outils disponibles pour la transfection de cellules eucaryotes. Ces outils comprennent l'application des vecteurs viraux, des procédés mécaniques (telles que canons à gènes), les approches chimiques (qui dépendent de polymères ou de lipides qui peuvent former des complexes avec les acides nucléiques), et l'électroporation de cellules ^3. Toutes ces approches ont leurs avantages et inconvénients et le choix les mieux adaptés à partir de ce large éventail pour un type cellulaire spécifique et de l'application peut être un processus long et difficile.

Les macrophages sont notoirement difficiles à transfecter transfe comme presque tous bien établieapproches ction de réduire considérablement la viabilité de macrophages ou interférer avec leur comportement, c'est à dire la différenciation et polarisation particulière. Par conséquent, nous présentons ici, un protocole non-viral efficace pour transfecter humains THP-1 macrophages en utilisant la technologie Nucleofector base électroporation, qui représente une approche d'électroporation optimisé exigeant la réduction des quantités d'ADN. Nucléofection est bien adapté pour des cellules sensibles, telles que les monocytes et les macrophages. Ce protocole est une adaptation de versions précédemment publiées ^4,5.

En bref, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) est utilisé pour différencier les droits de monocytes THP-1 pendant 48 heures dans les macrophages prématurée avant la transfection avec le siRNA ou d'ADN plasmidique. Pour la transfection, les macrophages predifferentiated sont détachés par voie enzymatique par traitement Accutase I. La transfection est réalisée en utilisant un dispositif d'électroporation 2b Nucleofector pour des cellules. Après transfection, différerciation est poursuivi pour une autre de 24 à 48 heures selon les besoins. Enfin, les macrophages matures transfectées sont incubées avec différents types de composés pour des études fonctionnelles.

Cette approche permet la transfection de lignées cellulaires telles que les humains THP-1 et les monocytes et les macrophages a été appliquée avec succès dans le passé ^{de 6 à 10.} Contrairement à la plupart des méthodes de transfection chimique, notre procédure nucléofection modifié en utilisant des macrophages prématurés donne de hauts rendements de transfection, en combinaison avec la viabilité de la cellule intacte, sans avoir besoin d'utiliser des vecteurs viraux ou d'ajouter d'autres composés porteurs d'effets secondaires inconnus. En outre, les macrophages conservent leur plein potentiel de différenciation ainsi que la polarisation permettant ainsi explorations fonctionnelles sans entrave après transfection ^11.

En outre, le milieu de culture cellulaire appliqué après nucléofection influe fortement sur les études fonctionnelles suivant transfection; en particulier, la capacité des macrophages de polarisation peut être influencée en fonction du milieu de culture appliquées. Voici quatre différents types de milieux de culture cellulaire (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 et de la souris des cellules T moyen Nucleofector) ont été testés dans des conditions de désactivation utilisant l'interleukine (IL) 10 Utilisation de THP-1 macrophages, nous avons observé que la cellule de réaction à l'IL10 est la plus forte lorsque le milieu cellulaire de souris Nucleofector T est utilisée par rapport à l'autre milieu de culture mentionné ci-dessus. Ces résultats montrent que l'optimisation de l'ensemble des conditions appropriées de culture cellulaire est essentielle pour la transfection réussie des études fonctionnelles suivantes und car ils peuvent améliorer de manière significative les résultats expérimentaux.

Que les macrophages sont impliqués dans diverses maladies humaines, beaucoup de recherches se concentre sur l'élucidation comportement des macrophages ainsi que des mécanismes régulateurs qui influent sur les macrophages ou, à son tour contrôlée par les macrophages. Par conséquent, ce protocole est de pertinence dansnombreux domaines de recherche différents.

Protocole

1. Predifferentiation de THP-1 macrophages

1. Cultiver cellules THP-1 dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal (FCS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine / L-glutamine (PSG) en CO ₂ (5% ) incubateur à 37 ° C.
2. Avant la transfection, les cellules diviser et de les transférer à un milieu RPMI fraîche comme avant. Cultiver des cellules pendant 24 heures.
3. Graine de 1,0 à 1,5 x 10 ⁷ cellules dans une culture 75 cm ² de tissu ou de ballon 2,5 x 10 ⁷ cellules dans un tissu de 150 cm ² flacon de culture dans du milieu RPMI-1640 et ajouter 10% (v / v) de SVF, 1% (v / v) le PSG, 1% (v / v) de pyruvate de sodium, 1% (v / v) d'acides aminés non essentiels, 10 ng / ml de PMA et 50 uM β-mercaptoéthanol pendant 48 heures.

2 Préparation de nucléofection

1. Placez Accutase I et tous les médias dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Aspirer le milieu de culture de ballon et de le remplacer avec 6 ml (75 cm ² ballon) ou 12 ml (150 cm ²) de ballonAccutase I et incuber pendant 30 min à 37 ° C pour le plein détachement des cellules. Observer la morphologie des cellules après le traitement Accutase je faire en sorte que les cellules ont une apparence ronde. Si certaines cellules semblent encore être fixée, rincer soigneusement le ballon avec une micropipette ou tapotez doucement à compléter détachement. Ne pas utiliser de grattoirs de cellules, car cela aura un effet négatif sur la vitalité des cellules. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml.
3. Pendant le traitement Accutase I, préparer les supports suivants:
   1. Préparer milieu de transfection: supplément de milieu de culture de cellules avec 1% (v / v) de PSG, 1% (v / v) d'acides aminés non essentiels, 1% (v / v) de pyruvate de sodium et 5% (v / v) de sérum humain (par siRNA) ou 20% (v / v) de sérum humain (pour l'ADN de plasmide); préparer un volume final soit de 3 ml / échantillon pour une plaque à 6 puits ou 4 ml / échantillon pour deux plaques de 12 puits.
   2. Préparer milieu de culture: milieu de culture de complément à 1% (v / v) de PSG, 1% (v / v) d'acides aminés non essentiels, 1% (v / v) de pyruvate de sodium et 5% (v / v) hul'homme du sérum (par siRNA) ou 20% (v / v) de sérum humain (pour le plasmide), 2,5 ng / ml de PMA et 50 uM β-mercaptoéthanol; préparer un volume final soit de 3 ml / échantillon pour une plaque à 6 puits ou 4 ml / échantillon pour deux plaques de 12 puits.
4. Centrifuger la suspension de cellules pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
5. Aspirer Accutase cellules I et remettre en suspension dans 1 ml de milieu RPMI préchauffé à 37 ° C; compter les cellules pour déterminer le nombre de cellules.
   REMARQUE: Lorsque les procédures de comptage de cellules automatiques rapides sont utilisés, les étapes 2.4 et 2.5 peuvent être omis et les cellules peuvent être prises en compte immédiatement après détachement à condition que l'exposition prolongée à Accutase I est évitée.
6. Pour chaque échantillon de transfection préparer des aliquotes dans des tubes à centrifuger contenant de 2,0 à 2,5 x 10 ⁶ cellules.

3. nucléofection de THP-1 macrophages

1. Centrifuger les aliquotes de 10 min à 250 x g à température ambiante.
2. Diluer l'ADN plasmidique ou siRNA sans nucléasede l'eau ou un tampon approprié. Maintenir le volume requis d'ADN plasmidique ou siRNA aussi faible que possible.
3. Préparer une cuvette Nucleofector avec soit 1 ug d'ARNsi ou 0,5 pg d'ADN de plasmide pour chaque transfection.
4. Effectuez l'une transfection à la fois. Aspirer le surnageant de aliquote de cellules.
5. Remettre en suspension culot de cellules en solution Nucleofector pour obtenir un volume total de 100 ul d'ADN / siRNA et solution Nucleofector. Maintenir le temps d'exposition à la solution pure Nucleofector à un minimum et de veiller à ce que le temps d'exposition ne dépasse pas 15 min.
6. Mélanger les cellules remises en suspension et de l'ADN / siRNA Nucleofector cuvette en tapotant légèrement.
7. transfecter des cellules en effectuant programme Y-001 dans le dispositif de 2b Nucleofector.
8. Transférer les cellules transfectées dans un flacon de réaction à l'aide de pipettes Pasteur en matière plastique jetable.
9. Immédiatement ajouter 500 ul de milieu de transfection préparée.
10. Répéter les étapes 3.4 à 3.9 pour chaque échantillon de transfection.

4. Post-nucléofection soins

1. Préparer une ou l'autre de 6 puits ou des plaques de 12 puits pour les cellules transfectées. Introduire à la pipette 2,5 ml de milieu de transfection dans chaque puits d'une plaque à 6 puits (puits 1 / transfection) ou 1,75 ml de milieu de transfection dans chaque puits d'une plaque de 12 puits (2 puits / transfection).
2. Mélanger soigneusement les suspensions de cellules avec une micropipette.
3. Transférer les cellules transfectées dans les puits préparés (soit un puits dans une plaque à 6 puits ou deux dans une plaque à 12 puits).
4. Incuber les plaques pendant 4 heures dans un incubateur humidifié (5% de CO _2, 37 ° C).
5. Vérifiez rattachement des cellules au microscope.
   NOTE: La majorité des cellules doit être adhérente à nouveau. De temps en temps, l'extension de la période d'incubation de 1 h augmente le nombre de cellules adhérentes en cas de rattachement insuffisant.
6. Aspirer soigneusement milieu de transfection avec une micropipette et la remplacer par la même quantité de milieu de culture. Aspirer ainsi seulement une à la fois.
7. Incuber les cellules pendant la période de temps nécessaire pour que l'effet maximal de plasmide ou de siRNA (24-72 h). Si les périodes d'incubation dépasse pas 48 heures, remplacez moyen après 48 heures.
8. Pour un traitement supplémentaire avec les effecteurs (par exemple., Les cytokines, agonistes, antagonistes et inhibiteurs) utilisent milieu sans sérum sans PMA et β-mercaptoéthanol. Le temps de la fin de la période d'incubation de l'effecteur à la fois de l'effet maximal de plasmide ou de siRNA et de planifier le changement de milieu et addition de l'effecteur en conséquence. Ne pas maintenir les cellules dans des conditions sans sérum pendant plus de 24 heures.

Résultats

En utilisant ce protocole de transfection de THP-1 macrophages avec des siRNA nous obtenons habituellement des taux de plus de 90% de transfection sans réduction significative de la vitalité des cellules. Figure 1 présente des données représentatives caractérisant l'état des cellules 24 heures après transfection avec marqué par fluorescence siRNA contre un non transfectées contrôle, qui n'ont pas été traités avec des réactifs nucléofection et le pouls ou siRNA mais a reçu tous les changements de milieux de culture, les échantillons transfectées. Sur la figure 1A la morphologie cellulaire est représentée en fonction de la mesure par cytométrie en flux. Les images microscopiques sont présentés dans la figure 1B figures 1C et 1D représentent les taux bas pour l'apoptose (contrôle: 1,5%; nucléofection: 5,4%). Et une nécrose (contrôle: 2,0%; nucléofection: 3,2%) indiquant la vitalité des cellules inchangées. Nécrose et l'apoptose sont légèrement plus élevés pour l'échantillon transfectées comme transfectées macrophages THP-1 sont plusdifficile à détacher de cellules non transfectées, donc la probabilité de dommages aux cellules lors d'augmentations de détachement. Enfin l'efficacité de transfection est présenté dans la figure 1E. Comme l'ensemble de la population transfectée est décalé par rapport au témoin, ce qui indique que toutes les cellules sont transfectées qui est confirmé par les images au microscope à fluorescence (Figure 2B). Les deux cytométrie de flux de données ainsi que des images microscopiques de fluorescence indiquent que toutes les cellules sont transfectées avec constante une répartition homogène de siRNA parmi les cellules, ainsi que dans les cellules. Ceci est en contraste avec de nombreux réactifs de transfection chimiques, par comparaison figures 2A et 2B montrent les données de cytométrie en flux et la fluorescence respectifs des images microscopiques d'un agent de transfection chimique en utilisant une approche à base de lipides. Ces figures montrent que les deux populations distinctes de cellules transfectées peuvent être détectés. La première population est similaire aux cellules transfectées folloaile nucléofection. Ils sont caractérisés par une faible fluorescence globale et une répartition homogène de siRNA dans les cellules. La deuxième population est marquée par une fluorescence plus intense qui provient de agglomérats intracellulaires très lumineux de siRNA. La morphologie cellulaire n'est pas affectée par les deux méthodes de transfection, comme indiqué par contraste interférentiel différentiel de la figure 2C. Transfections utilisant rendement de l'ADN plasmide efficace des résultats similaires, pour des exemples s'il vous plaît se référer à Robenek et al. (2009) ⁹ ou Xie et al. (2006) ^7.

Le choix du milieu de culture de cellules après transfection est d'une grande importance; donc différents milieux de culture cellulaire ont été testés en comparaison. Les médias sélectionnés sont tous adaptés à la culture des cellules THP-1 et ont été choisis selon les recommandations de Lonza que les médias applicable pour la post-nucléofection culture. Figure 3 représente la mediat siRNAed knockdown efficacité en utilisant un siRNA dirigé contre IL10RB (interleukine chaîne d'β du récepteur 10) ARNm. Pour tous les milieux testés IL10RB de l'expression a été considérablement réduite à environ 10 à 20% du niveau de commande (Figure 3). Cependant, les cellules transfectées sont différentes en fonction du milieu de culture dans leur potentiel de polarisation. Macrophages THP-1 transfectées avec le siRNA soit de siRNA de contrôle non spécifique ou IL10RB spécifiques ont été cultivées dans différents médias après la transfection et traités avec IL10. Ensuite, les niveaux de la SOCS3 génique induite par l'IL10 (suppresseur de signalisation des cytokines 3) au niveau de l'expression de l'ARNm ont été mesurés par RT-qPCR. Les différences entre les milieux de culture se produisent en ce qui concerne la mesure de l'induction de l'expression de l'ARNm SOCS3 (figure 4), les inductions pour chacun des milieux testés cellules T de souris Nucleofector moyen, LGM3, X-VIVO 20 et IMDM étaient 19,5 [17,7 à 21,5 ], 11.5 [8,5 à 15,7], 8,0 [4,6 à 14,2] et 7.2 [5.6 à 9.5] plier, respectivement. Laapplication refore du milieu Nucleofector souris T Cell est vitale. En outre, les différences de l'effet de l'inactivation de l'expression de IL10RB SOCS3 après traitement IL10 sont observables, les niveaux d'ARNm d'expression SOCS3 a été réduit à 9,5 [8.8 à 10.3] replier dans des cellules T de souris moyen Nucleofector, 2,1 [1.1 à 4.1] replient dans LGM3, 4.8 [3.2 à 7.2] plier dans X-VIVO 20 et 3.3 [2.7 à 3.9] plier en IMDM. Ces valeurs correspondent à des réductions d'expression SOCS3 dans les différents médias à 49%, 18%, 60% et 45%, respectivement. Réduction de SOCS3 expression de l'IL-10 induit après transfection de siARN IL10RB confirme la régulation à la baisse succès de IL10RB par la transfection.

Figure 1: Caractérisation des THP-1 transfectées macrophages. L'état caractéristique des cellules n'est pas affectée révélée par microscopie optique et analyse par cytométrie de flux non transfectées control cellules THP-1 par rapport aux macrophages transfectées selon le protocole présenté. THP-1 ont été différenciées macrophages avec 10 ng / ml de PMA pendant 48 heures et transfectées avec marquage fluorescent (Alexa 488) non spécifique, siRNA contrôle. 24 h après la transfection, soit des images de cellules vivantes ont été prises (B), ou les cellules ont été détachées par traitement Accutase I et analysées par cytométrie de flux (A). L'apoptose et la nécrose coloration a été réalisée en utilisant l'annexine V-phycoérythrine (PE) (C) et 7-aminoactinomycine (7-AAD) (D). L'efficacité de transfection (E) a été déterminée par cytométrie de flux en utilisant le marqueur fluorescent attaché au siRNA. Le signal de fluorescence des cellules transfectées (noir) est représenté par le signal de commande (gris). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Comparaison de la distribution intracellulaire de siRNA après nucléofection contre lipofection THP-1. Cellules sont différenciées pendant 48 heures selon ce protocole et ensuite transfectées soit par nucléofection ou par lipofection. Les résultats de lipofection présentés ont été obtenus en utilisant le kit Xtremegene siRNA selon les recommandations du fabricant avec un rapport de charge de réactif de siRNA de 4: 1. 24 h après la transfection, les cellules ont été soit détaché avec Accutase I pour l'analyse par cytométrie de flux ou au microscope évaluée avec des cellules vivantes. (A) L'efficacité de transfection et la distribution de siRNA par cellule au sein de la population a été déterminée par cytométrie de flux en utilisant l'étiquette de fluorescence attaché au siRNA, contrôles transfectées sans siARN sont affichées en gris, les échantillons transfectées avec le siRNA sont représentés en noir. (B) La microscopie à fluorescenceimages montrant la distribution intracellulaire de siRNA marqué par fluorescence (Alexa Fluor 488); la barre d'échelle représente 40 um. (C) de l'image différentielle de contraste d'interférence correspondant à l'image de fluorescence; la barre d'échelle représente 40 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Knockdown de IL10RB Figure 3 siRNA médiation dans THP-1 transfectées macrophages. Macrophages THP-1 ont été transfectées selon le protocole décrit. Après transfection, les cellules ont été cultivées dans quatre différents supports de culture, à savoir milieu Nucleofector souris des cellules T (A), IMDM (B), LGM3 (C), et X-VIVO 20 (D), complétées de la manière décrite dans la section de protocole. Caunes ont été soit transfectées avec contrôle non spécifique siRNA (Ctrl) ou IL10RB spécifique siRNA (IL10RB). Comme des contrôles supplémentaires des échantillons suivants ont été inclus: Commande d'impulsion, c'est à dire. les cellules qui ont subi une transfection en l'absence de siRNA (Pulse), et un moyen de contrôle, c'est à dire. cellules qui ont reçu seulement les changements de milieux de culture, mais qui restent non traitées autrement. 24 h après la transfection, les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum, avec ou sans 50 ng / ml de IL-10 pour plus de 24 heures. Expression IL10RB a été mesurée par RT-qPCR; diagrammes montrent la moyenne de trois expériences indépendantes, les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs Ctrl. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 de régulation de SOCS3 IL10-dépendante après inactivation de IL10RB dans THP-1 transfectées macrophages. Macrophages THP-1 ont été transfectées selon le protocole décrit. Après transfection, les cellules ont été cultivées dans quatre différents milieux de culture des cellules T de souris Nucleofector milieu (A), IMDM (B), LGM3 (C) et X-VIVO 20 (D) complété comme décrit dans la section de protocole. Les cellules ont été transfectées avec soit le contrôle non spécifique siRNA (Ctrl) ou IL10RB spécifique siRNA (IL10RB). Comme des contrôles supplémentaires des échantillons suivants ont été inclus: Commande d'impulsion, c'est à dire des cellules qui ont subi la transfection en l'absence de ARNAS (Pulse), et un milieu de contrôle, c'est à dire. cellules qui ont reçu seulement les changements de milieux de culture, mais qui restent non traitées autrement. 24 h après la transfection, les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum, avec ou sans 50 ng / ml de IL-10 pour plus de 24 heures. SOCS3 expression a été mesurée par RT-qPCR; diagrammes montrent la moyenne de trois expériences indépendantes, les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; ***, ### P <0,001 vs Ctrl et contre Ctrl + IL-10, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici présente un moyen fiable et efficace pour la transfection de cellules THP-1 macrophages qui sont généralement assez difficiles à transfecter. La transfection peut être réalisée avec des efficacités de transfection supérieures à 90% pour les siRNA sans réduction significative de la vitalité des cellules. Efficacité de plasmides peuvent être moins en raison de leur taille, mais transfection efficacité de l'ordre de 70% peuvent être généralement obtenus. L'efficacité de l'effet de choc induite par le siRNA peut atteindre 80 à 90% en fonction du siRNA appliqué. Un avantage majeur de ce protocole est que cela n'interfère pas avec la différenciation cellulaire. Après transfection, les cellules répondent toujours normalement à l'agent de différenciation PMA (Figure 1A à 1B et figure 4) ^12. De plus la polarisation cellulaire par des stimuli tels que des cytokines IL-10 ou LPS / IFN ¹² n'est pas affectée, même si cela dépend également fortement sur ​​le support sélectionné pour une culture après transfections indique la figure 4.

Il ya plusieurs options dans la procédure qui peut être modifié afin d'adapter le protocole à des exigences spécifiques. Les cellules Comme le montre la Figure 4 réagissent différemment au même stimulus IL10 selon le milieu de culture choisi après la transfection. Ceci indique que la composition du milieu a une forte influence sur le comportement cellulaire. Comme l'effet imposée par le milieu peut être différente pour différents stimuli expérimentaux, il est possible que le milieu optimal peut changer et par conséquent il est nécessaire de vérifier l'aptitude du moyen de différentes expériences de façon indépendante. Toutefois, le milieu RPMI-1640, qui est le moyen par défaut utilisé pour la culture de cellules THP-1, s'est avérée peu adaptée à la culture après la transfection par une perte significative de la vitalité des cellules a été observée. En outre, le protocole peut également être appliqué à des monocytes THP-1 sans la différenciation induite par le PMA-avant, cettesupprime évidemment la nécessité pour le détachement des cellules au cours de la procédure, mais les étapes restantes ne doivent pas être ajustés. Les monocytes THP-1 peuvent être différenciés par la suite si nécessaire.

Les éléments les plus critiques du protocole sont d'une part le détachement et d'autre part le temps nécessaire pour la transfection. Le détachement doit être effectuée le plus doucement possible, afin de maintenir la viabilité des cellules haute. Par conséquent, nous vous recommandons le détachement enzymatique relativement doux par Accutase je cours Méthodes très agressifs tels que la trypsine. D'autres procédés tels que le traitement de détachement de lidocaïne ou de raclage sont avérées plutôt nuisible et ne doivent pas être utilisés. Dans le cas que de 30 min de traitement Accutase je ne devrait pas être suffisante pour détacher les cellules correctement ce qui est généralement une indication de la solution a été mal enregistré ou expiré Accutase I ou de trop nombreux cycles de gel-dégel. Nous avons obtenu de bons résultats par le stockage de petites fractions de Accutase je à -20 °C pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel. Cependant, quand il ya détachement insuffisante soit remplacer Accutase I avec Accutase frais ou augmenter le temps d'incubation allant jusqu'à 1 h. En outre tapotant doucement ou de rinçage de la fiole ou de la plaque peut aider détachement. En ce qui concerne le temps nécessaire à la transfection, le temps d'exposition des cellules à la solution pure Nucleofector a obtenu fort impact sur la survie des cellules et par conséquent doit être aussi courte que possible. La meilleure façon d'y parvenir est d'effectuer chaque transfection à la fois (étapes 2.10 à 2.15) et non plusieurs transfections en parallèle.

Si knockdown efficacité est faible, ce n'est pas habituellement causée par une faible efficacité de transfection, mais ceci peut être facilement vérifiée en utilisant la cytométrie en flux ou microscopie à fluorescence et siRNA marqué par fluorescence ou un plasmide codant pour la GFP. La plupart du temps la cause est un ADN plasmidique siRNA ou inefficace. Dans ces conditions, il doit être considéré pour augmenter la quantité de siRNA (jusqu'à 3.2 pg) oul'ADN plasmidique (jusqu'à 1-2 pg) ou d'utiliser un siRNA ou vecteur d'expression différente si disponible. En variante, des résultats satisfaisants peuvent également être obtenus en utilisant un pool de plusieurs ARNsi différents dirigés contre la même cible. En outre, des expériences de cours à temps pourraient être nécessaires pour déterminer avec précision la durée de l'effet maximal, qui est généralement atteint après 24 à 72 heures après transfection.

En dehors de la transfection par électroporation il existe en outre des techniques bien établies pour la transfection de cellules de mammifères. Fréquemment les systèmes utilisés sont des agents de transfection chimiques qui peuvent former des complexes avec l'acide nucléique de la cargaison et de faciliter le transport dans les cellules. Les réactifs les plus fréquemment utilisés sont soit basés sur différentes espèces lipidiques ou peuvent être choisis parmi un certain nombre de polymères cationiques ^3. Pour les deux approches, une sélection variée est disponible dans le commerce. Ces réactifs de transfection ont l'avantage qu'ils sont habituellementfacile à utiliser, ne nécessitent pas beaucoup de temps, et de travailler avec des cellules adhérentes ainsi, éliminant ainsi la nécessité de détachement. Malheureusement, les macrophages sont plutôt difficiles à transfecter par ces méthodes car elles ne prolifèrent pas de manière significative in vitro et possèdent des mécanismes de défense à l'encontre de l'ADN étranger cytosolique ^{de 13 à 15.} Ainsi, les méthodes de transfection chimique ont souvent pour résultat une forte réduction de la viabilité des cellules. Toutefois, comme indiqué sur la figure 2 il existe des agents de transfection chimiques qui peuvent transférer avec succès siRNA dans les macrophages, mais aussi par cytométrie de flux (Figure 2A) et au microscope à fluorescence (Figure 2B), les analyses indiquent qu'ils ne parviennent pas à atteindre la même répartition homogène de siRNA dans les cellules en tant que obtenu par nucléofection. En fait, les données de cytométrie en flux, indiquent que deux populations différentes de cellules transfectées produisent tout d'abord une population de fluorescence similaire à celle des cellules après Nucleofectisur la détection et d'autre part il ya une population avec une fluorescence plus intense. Confirmation définitive est toujours nécessaire, mais nous supposons que la première population est dans la microscopie à fluorescence identique à ces cellules qui présentent une répartition homogène des siRNA fluorescent dans le cytosol tandis que la seconde population correspond probablement à des cellules avec des agglomérats très lumineux. Les données de cytométrie en flux de la Figure 2A suggèrent que les résultats de nucléofection en moins siRNA par cellule que l'approche de lipofection alternative. Cependant, les données de la figure 3 montre que la même quantité relativement faible de siRNA constituée par nucléofection est déjà suffisant pour 80 à 90% de l'effet de choc gène cible. Par conséquent, le montant supplémentaire de siRNA constituée par la deuxième population après transfection chimique est très probable excédent et est donc plus susceptible de causer des effets secondaires indésirables que d'accroître encore l'efficacité de knockdown. En dehors de celaformation d'agglomérats intracellulaires est déjà en soi indésirable puisque ces molécules de siARN sont susceptibles de ne pas fonctionnelle ou au moins moins efficace que les molécules de siARN libres et peuvent provoquer des effets ponctuels de cibles. En outre, la vraie nature de ces agglomérats n'est pas encore clair. Il est possible que ces points lumineux représentent endosomes indiquant que le siRNA a été internalisée par les cellules, mais par la suite libérer des endosomes et n'ont pas le siRNA reste piégé et donc inefficace. En variante, les points peuvent être des agglomérats qui sont formés de manière intracellulaire. Évaluations fonctionnelles de la transfection chimique sont en cours, donc pas de conclusions définitives sur l'efficacité knockdown peuvent être encore faites, encore l'existence de deux populations distinctes est déjà défavorable, cela signifie que tous les résultats décrivent la moyenne des deux populations, cela ne correspond donc pas à ou l'autre des populations. Pour cette raison nucléofection est la meilleure approche.

Mais il ya aussi des limites à la procédure de transfection décrit ici. Etant donné que les cellules doivent être en suspension pour les cellules adhérentes nucléofection doivent être détaché, qui présente un facteur de stress supplémentaire pour les cellules. En outre, l'ensemble du protocole est plutôt chronophage. Depuis transfections ne peuvent pas être réalisées simultanément, mais devra être réalisée rapidement afin d'éviter d'endommager la cellule, le nombre d'échantillons est limitée à environ 8 - 10 par expérience. Ainsi, ce protocole n'est pas adapté pour les projets de criblage à haut débit. Pour les applications à haut débit des systèmes de Nucleofector différents sont disponibles. Tout d'abord, il ya le système 4D-Nucleofector qui offre un format de bande 16 de bien. Pour encore plus le débit, il ya le système de navette à 96 puits et 384 puits système HT Nucleofector. Cependant, comme ces nouveaux systèmes fonctionnent avec des électrodes conductrices de polymère à la place de l'aluminium et donc des conditions électriques, à savoir les programmes et les composition de solution Nucleofector, ont évolué en conséquence, il doit être déterminé si notre protocole peut être transféré à ces systèmes.

Cependant, malgré ces limitations du protocole présenté ici ne donne une transfection fiable et efficace des cellules THP-1 qui est supérieure à toutes les autres approches non virales. Ce protocole permet à l'enquête sur les effets de l'expression du gène altéré dans cellules THP-1 qui, dans tous les autres aspects de différencier et de polariser normalement et ainsi montrer que peu d'effets secondaires de transfection que possible.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Acides aminés non essentiels	PAA	M11-003
Tubes à centrifuger (15 ml)	TPP	TPP91015
Sérum de veau fœtal (FCS gold)	PAA	A15-151
Kit de nucléofecteur de monocytes humains	Lonza	VPA-1007	Contient une solution de nucléofecteur, des cuvettes et Pasteur pipettes
Sérum humain hors du caillot	Lonza	C11-020
Milieu de Dulbecco modifié d’Isove (IMDM) avec 25 mM HEPES et 25 mM de L-glutamine	Lonza	12-722F
Milieu de croissance des lymphocytes 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Nucléofecteur de souris Milieu	Lonza	VZB-1001
Nucléofecteur 2b	Lonza	AAD-1001
Pénicilline / streptomycine / L-glutamine (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plasmide
Pyruvate de sodium (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 leucémie humaine monocytes	CLS	300356
Fioles de culture tissulaire (75 cm² ;; 150 cm² ;)	TPP	TPP90076/TPP90151
(6 puits ; 12 puits)	Tubes TPP	TPP92406/TPP92012
(1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Eau (sans nucléase) ou tampon
X-Vivo 20 avec gentamycine	Lonza	BE04-448Q
&beta ;-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148