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Article de méthode

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

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DOI :

10.3791/51964

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16 février 2015

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Résumé

Anastasis (grec pour «la hausse à la vie») fait référence à la récupération des cellules mourantes. Avant que ces cellules se rétablissent, ils sont passés par des points de contrôle importants de l'apoptose, y compris la fragmentation mitochondriale, la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol, l'activation des caspases, la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane plasmique, le rétrécissement des cellules, l'exposition de la surface cellulaire de phosphatidylsérine, et la formation de corps apoptotiques. Anastasis peut se produire lorsque les stimuli apoptotiques sont retirés avant la mort, permettant ainsi cellules mourantes pour inverser l'apoptose et potentiellement d'autres mécanismes de mort. Par conséquent, Anastasis semble impliquer des processus physiologiques de guérison qui pourrait également soutenir les cellules endommagées de façon inappropriée. Les fonctions et les mécanismes de Anastasis sont pas encore claires, entravée en partie par les outils limités pour détecter les événements passés après la récupération des cellules apparemment en bonne santé. Stratégies pour détecter AnastaSIS permettra des études sur les mécanismes physiologiques, les dangers de cellules morts-vivants dans la pathologie de la maladie, et des thérapies potentielles pour moduler Anastasis. Ici, nous décrivons des stratégies efficaces en utilisant la microscopie de cellules vivantes et un biocapteur de caspase mammifère pour l'identification et le suivi Anastasis dans des cellules mammifères.

Introduction

Apoptose (grec pour «tomber à la mort") est généralement supposé être un processus à sens unique se terminant par suicide cellulaire 1-7. La perturbation génétique de gènes pro-mort conduit à la survie des cellules supplémentaires qui seraient autrement mourir dans des animaux entiers, y compris des cellules qui ont déjà ouvert la voie de 8,9 apoptose. De même, les manipulations génétiques permettent aux cellules de mammifères en bonne santé qui affichent artificiellement "Eat Me" signaux ou qui perdent leur adhérence à la matrice extracellulaire pour échapper à la mort par phagocytose de cellules entières ou entose respectivement 10,11. Cependant, nous et d'autres avons montré que, sans manipulation génétique des cellules de mammifères sains et de lignées cellulaires peuvent également récupérer dès les premiers stades de l'apoptose 12-15. Utilisation d'outils pour suivre des cellules individuelles, nous avons encore démontré la récupération de stades tardifs de l'apoptose 12,13, après que les cellules ont passé les postes de contrôle important que typiqueLy marquer le «point de non-retour" 2-6. Ces points de contrôle de l'apoptose au stade avancé comprennent la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, et la formation de corps apoptotiques. Nous avons adopté un mot composé grec "Anastasis", qui signifie "la hausse à la vie", pour décrire ce renversement de l'apoptose au bord de la mort cellulaire 2-6.

Sauf tout le processus de recouvrement des mourants est observé par imagerie des cellules vivantes, il est difficile de distinguer les cellules qui ont subi Anastasis partir de cellules qui ne ont jamais connu les événements apoptotiques. Des décennies de travail ont révélé que les caractéristiques morphologiques de suicide cellulaire par apoptose sont entraînés par des événements biochimiques et moléculaires évolutives conservées 16-19. Ces événements favorisent l'auto-destruction des cellules pour réguler les processus de développement et homéostatiques dans les organismes unicellulaires et multicellulaires en éliminant endommagé ou dcellules angerous 16-19. Alors que les cellules apoptotiques peuvent être facilement distingués par des manifestations morphologiques, biochimiques et moléculaires de l'apoptose 1,5,6,16,20 standardisés, il ne existe actuellement aucun marqueur spécifique connue Anastasis 12,13. Fait important, les cellules qui ont subi anastasis semblent être les cellules saines normales et des cellules qui commencent juste inverser l'apoptose des cellules mourantes apparaître comme apoptotiques 12,13. Ainsi, de nouveaux outils sont nécessaires pour conclure avec certitude qu'une cellule donnée survivant avait déjà connu des processus apoptotiques actifs.

L'apoptose est généralement admis comme une cascade irréversible parce que ce est un processus de destruction rapide et massive. Bien qu'il pourrait prendre quelques minutes à quelques jours pour certaines cellules pour initier l'apoptose, une fois mitochondries ont publié facteurs tels que apoptogènes cytochrome c dans le cytosol 21,22, caspases peuvent être activées dans les 5 minutes 23,24, suivis par cytoplasmique etcondensation nucléaire dans les 10 minutes de 25 à 27, et la mort cellulaire peu après 25-27. Les caspases activées orchestrent l'apoptose par clivage et en inactivant des composants structuraux et fonctionnels clés dans le but de démolition 2,28 cellulaire, tel que l'inhibiteur d'endonucléase DFF45 / CISD 29,30. Caspases activent également des facteurs pro-apoptotiques, comme famille Bcl-2 BID membre, qui translocation vers les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c mitochondrial 31,32. l'activité de la caspase résulte également dans la cellule exposition de la surface de la phosphatidylsérine comme un signal "me manger" pour la promotion de l'engloutissement de mourir cellules par les macrophages ou les cellules voisines par phagocytose 33. En outre, les événements apoptotiques rendent la dysfonction mitochondriale, perturbant bioénergétique cellulaire et métabolisme 34,35,36. Ainsi, la récupération de cette destruction semble intuitivement peu probable.

Contrairement à l'original se attendretions, les cellules peuvent inverser le processus de mort cellulaire par apoptose, même à un stade tardif. En surveillant en permanence le sort de mourir des cellules en culture, nous avons observé la réversibilité de l'apoptose de stade tardif dans une plage de cellules primaires et des lignées cellulaires 12,13. L'élimination du stimulus de mort a permis la récupération des éléments visibles de l'apoptose, telles que fragmentation mitochondriale, de la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, le plasma membrane bourgeonnement, l'exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine, la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, rétrécissement des cellules, et la formation de corps apoptotiques. Ces observations soulèvent des questions sans réponses concernant les fonctions, les conséquences et les mécanismes de Anastasis. Pour répondre à ces questions, une condition préalable est d'identifier de manière fiable des cellules qui ont subi Anastasis. Ici, nous décrivons des méthodes de microscopie vivants et un biocapteur de caspase pour détecter des cellules qui ont déjà inversé apoptose et e de stade tardifen survécu.

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Protocole

1. Préparation des cellules pour imagerie de cellules vivantes

  1. Pour faciliter la détection des changements morphologiques, pour choisir des cellules adhérentes telles que HeLa (carcinome cervical humain) des cellules qui sont à plat sur le substrat afin de mieux visualiser l'altération de la membrane plasmique et les organites intracellulaires.
    Note: Inversion de l'apoptose a été observée dans diverses cellules de mammifères 12,13, y compris les cellules hépatiques de souris primaire, des macrophages de souris primaires, les cardiomyocytes primaires de rat, et de la cellule aussi des lignes telles que des cellules HEK-293T humaines de rein embryonnaire, singe vert COS épithéliales rénales africains -7 cellules, de muscle cardiaque de souris NS-1 des cellules, des fibroblastes de souris NIH 3T3, le furet (Mustela putoris furo) des cellules du cerveau CRL1656, les cellules A375 de cancer de la peau humaine, des cellules CRL1973 du cancer testiculaire humaine, les petites cellules H446 de carcinome du poumon à grandes cellules humaines, le cancer du foie humain cellules HepG2, les cellules MCF7 du cancer du sein humain, des cellules PC3 de cancer de la prostate et des cellules humaines SH-SY5Y de neuroblastome humain.
  2. Pré-lavage des lamelles de verre de verre des boîtes de culture cellulaire bas avec de l'éthanol absolu pour le nettoyage et la stérilisation.
    Note 1: utilisation de plats à fond de verre est recommandé pour la haute qualité contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie et haute confocale d'agrandissement ou la microscopie épi-fluorescence (voir la discussion).
    Note 2: Pour des grossissements élevés (40X, 60 / 63X ou 100X objectifs et des ouvertures numériques élevées 1,3 ou 1,4), l'utilisation de boîtes de culture cellulaire à fond de verre plus mince (épaisseur 0,085 à 0,16 mm) fournit de plus longues distances pour l'imagerie de travail (voir Protocole 3 ).
  3. Selon le type cellulaire, plats en verre de culture sur le fond peuvent nécessiter revêtement de poly-D-lysine (0,1 mg / ml), du collagène (solution à 0,01% dans 0,01 M d'acide acétique) et / ou de la fibronectine (5 ug / ml) avant l'ensemencement cellules.
    Note: Optimisation de la nature et la concentration de l'agent de revêtement est nécessaire pour différentes lignées cellulaires. Cellules HeLa peuvent adhérer directement sur verre sans revêtement. Cependant, certaines cellules, such comme souris muscle cardiaque HL-1 cellules, ne peuvent pas adhérer directement à des surfaces de verre, mais exiger des protocoles de culture et de revêtement spécifiques 37.
  4. Graine ~ 2-3 x 10 5 cellules de verre pré-enduit des boîtes de culture de cellules de 35 mm en bas et incuber à 37 degrés Celsius (° C) avec 5% de CO 2 pendant une journée pour atteindre 80% de confluence.
    Note 1: Les conditions optimales de la densité cellulaire, le temps d'incubation, et des conditions de culture peut varier en fonction du type de cellule. Cellule confluence peut affecter la réponse apoptotique des cellules (Voir Protocole 2). A forte confluence, les cellules pourraient être moins sensibles aux mêmes concentrations de stimuli apoptotiques.
    Note 2: Évitez de trop cellules confluentes, que la densité cellulaire élevée peut masquer des changements morphologiques des cellules individuelles et de leurs organites.

2. Application et suppression des cellules apoptotiques stimuli

  1. Peu de temps avant utilisation, de pré-mélanger l'agent inducteur d'apoptose à 37 ° C du milieu de culture cellulaire. De l'éthanol (03/06 à 04/05% Vol / vol) a servi comme inducteur de l'apoptose dans la présente manifestation.
    Note 1: Nos données publiées et non publiées démontrent que les cellules peuvent également inverser l'apoptose qui est déclenchée par d'autres stimuli 12,13 apoptotique, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO, 8% vol / vol pendant 24 heures), la staurosporine (STS, 0,5 uM pour 1 h), et le taxol (1 pM pendant 12 h). L'optimisation de la dose pour le déclenchement de l'apoptose est requis pour différents types de cellules pour atteindre la dose minimum qui peut déclencher la majorité des cellules dans la population à subir une apoptose.
    Note 2: Le pré-mélange des agents induisant l'apoptose par du milieu de culture cellulaire est important d'éviter l'exposition non uniforme des cellules à des stimuli apoptotiques.
  2. Image un groupe de cellules de la santé dans la boîte de culture cellulaire avant d'appliquer l'agent inducteur d'apoptose pour établir morphologies de base.
  3. Retirez le support original de la boîte de culture cellulaire, et ensuite appliquer 2 ml de prémélange agent induisant l'apoptose dans le plat àdéclencher les cellules à subir une apoptose. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 (ou d'autres conditions de culture normales).
  4. Après incubation, observer les cellules par la lumière, épi-fluorescence ou microscopie confocale à surveiller la progression de caractéristiques apoptotiques.
    Note 1: Les cellules en apoptose afficheront caractéristiques morphologiques, biochimiques et moléculaires de l'apoptose qui peut être détecté par microscopie et biocapteurs basés sur la fluorescence (voir Protocoles 3 et 4).
    Note 2: Le temps d'incubation des cellules avec différents inducteurs d'apoptose peut varier, selon le type de cellule, les conditions cellulaires (tels que des nutriments et de l'état de confluence), et la dose de stimulus appliqué mort. Titration prudente peut être nécessaire.
  5. Lorsque les cellules présentent des caractéristiques de l'apoptose, éliminer l'agent induisant l'apoptose par lavage des cellules une fois avec chaude (37 ° C, ou une autre température de culture normale) milieu de culture cellulaire frais.
    Note 1: Comme les cellules apoptotiques sont plus mal fixés surla plaque de culture, il est important d'appliquer et d'éliminer le milieu doucement afin que les cellules ne seront pas emportés.
    Note 2: Les cellules vivantes en suspension peuvent être récupérés à partir du surnageant par centrifugation douce (160 g pendant 1 min) et rajoutés à la boîte de culture.
  6. Incuber les cellules à 37 ° C avec 2 ml / boîte de 35 mm de milieu de culture de cellules fraîches dans 5% de CO2. En variante, l'utilisation de milieu conditionné (milieu de culture exempt de cellules recueillies à partir de cellules saines) pour améliorer encore la survie des cellules apoptotiques.
    Remarque: Le lavage et l'incubation de cellules avec du milieu frais permettent la majorité des cellules à inverser l'apoptose induite par l'éthanol après exposition à l'éthanol 12,13. Cependant, en répétant cette étape de lavage peut être nécessaire lorsque les cellules sont exposées à d'autres stimuli apoptotiques (voir la discussion).

3. cellules vivantes Microscopie

  1. Nous vous recommandons d'utiliser un confocale ou épi-fluorescence microscope inversé avec contrôle de l'environnement (37 ° C,5% de CO 2) pour la microscopie de cellules vivantes.
    Remarque: Il est également possible à l'image des cellules en utilisant les microscopes droits avec un objectif à immersion. Tremper l'objectif directement dans le milieu de culture de cellules d'image. Cependant, les cellules peuvent être écrasés par l'objectif de focalisation au cours de l'immersion.
  2. Pré-réchauffer le microscope (tels que chambre de contrôle de l'environnement, l'étape d'incubation, et l'élément chauffant objectif) au moins 2 heures avant l'imagerie.
    Note: Ceci permet aux composants de microscope pour atteindre thermo-équilibre, de façon à pouvoir éviter la dérive du décalage de mise au point et le plan xy du fait de la dilatation et la contraction thermiques des composants.
  3. Placez un 35 mm verre plat bas de cellules cultivées (Voir Protocole 1) sur la scène d'un microscope inversé et capturer des images de cellules en utilisant un objectif 40X ou 63X Plan-Apochromat avec une ouverture numérique (NA) 1.3 ou 1.4 pour l'imagerie de cellules à partir de la fond de la boîte par l'intermédiaire des lamelles de verre.
    Remarque: Évitez d'appliquer plus de 2 ml de milieu35 mm à fond plat en verre, selon le poids du milieu peut provoquer une courbure du fond de verre, ce qui rend difficile pour un champ d'image de cellules dans le même plan focal.
  4. Maintenir les cellules à 37 ° C ou la température normale correspondante pendant le processus d'imagerie.
    Remarque: Le processus de l'apoptose, et probablement le renversement de l'apoptose, dépend de la température activités enzymatiques sensibles. Par conséquent, le maintien des cellules à 37 ° C (par exemple avec une platine de microscope en haut de l'incubateur) est important tout au long de l'expérience. Diminution de la température pourrait ralentir la réponse apoptotique et la réponse de récupération après le retrait des mesures de relance apoptotique.
  5. Utiliser un dispositif d'humidité ou de porter une feuille transparente (Voir Matériaux) sur la boîte de culture pour réduire la perte d'eau par évaporation du milieu.
    Remarque: la feuille pourrait perturber la polarité de la lumière pour microscopie DIC. Restaurer la polarité en ajustant le polariseur à la trajectoire de la lumière.
  6. Maintenir le pH dans lamilieu de culture cellulaire (pH 6,8 -7,3) par incubation dans 5% de CO 2 avec une chambre de contrôle de l'environnement sur ​​le microscope.
    Remarque: Maintien du pH dans le milieu de culture peut également être réalisée par addition de tampon HEPES, ou à l'aide de CO 2 -indépendante milieu commercial (Voir Matériaux). Les conditions optimales peuvent varier en fonction du type de cellule.
  7. Réduire la fluorescence / laser (d'intensité lumineuse d'excitation) exposition aux cellules pendant le processus d'imagerie pour éviter phototoxicité en réduisant l'intensité de fluorescence à la plus faible nécessaire pour obtenir des images de haute qualité de cellules / structures sous-cellulaires ou biocapteurs exprimées (Détails du protocole 4).

4. Stratégies pour détecter et suivre Anastasis pendant et après apoptotiques Evénements

  1. Plasma bourgeonnement de la membrane, une condensation cytoplasmique, rétrécissement des cellules et la formation de corps apoptotiques (voir les figures 1A - C, E).
    1. Effectuer time-lapse diffé de cellules vivantesrentiel contraste d'interférence (DIC) ou microscopie à contraste de phase de suivre un groupe de cellules de santé et d'observer leur morphologie cellulaire (Voir le protocole 3 pour la microscopie de cellules vivantes, et de voir Discussion).
      Note 1: Réduire l'intensité de la source lumineuse pour le contrat imagerie DIC / de phase pour éviter phototoxicité aux cellules.
      Note 2: Si DIC et microscopie à contraste de phase ne sont pas disponibles, utilisez CellTracker pour colorer le cytosol de décrire la morphologie des cellules vivantes pour la microscopie confocale ou épi-fluorescence et surveiller la morphologie cellulaire.
    2. Appliquer la mort cellulaire stimulus pour déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques).
    3. Respecter les cellules traitées pour caractéristiques morphologiques de l'apoptose tels que le bourgeonnement de la membrane plasmatique, la condensation cytoplasmique, rétrécissement des cellules et la formation de corps apoptotiques (figures 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Laver stimuli de mort, et les cellules de ravitaillement avec du milieu frais lorsque les cellules displacaractéristiques morphologiques y de l'apoptose.
      Note 1: Appliquer la mort cellulaire stimulus ou en changeant le milieu de culture cellulaire sur la platine du microscope au cours de time-lapse imagerie des cellules vivantes peut être réalisé en utilisant une chambre de culture de cellules de perfusion, ou peut être réalisée directement sur la boîte de culture cellulaire en soigneusement pipetage sans toucher le plat, pendant les intervalles entre les images.
      Note 2: Utilisez les systèmes accent de compensation de la dérive pour éviter de mise au point des cellules en raison de la perte de thermo-équilibre du système de microscope après avoir changé le milieu de culture cellulaire (voir la discussion).
    5. Continue imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules qui affichent caractéristiques de l'apoptose. Les cellules que l'apoptose inverse peut réparer les dommages et de retrouver la morphologie normale plat (Figures 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. La fragmentation mitochondriale, ADN / condensation de la chromatine et la fragmentation nucléaire (Voir les figures 1D, 1F, 1G).
    1. Pour visualiser mitochondria, cellules tache avec 50 nM MitoTracker rouge profond colorant / rouge / vert fluorescent, et simultanément colorent le noyau avec 10 pg / ml de colorant Hoechst 33342 nucléaire bleu dans un milieu de culture pour 20 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
      Note 1: Réduire la concentration de colorants et de durée d'incubation pour éviter la cytotoxicité et de réduire la fluorescence de fond lorsque le besoin. Optimiser les conditions de coloration pour obtenir un bon rapport signal sur bruit avec la quantité minimale de colorant et la durée d'incubation pour la coloration.
      Note 2: Utilisez colorants fluorescents pour les mitochondries tels que MitoTracker Rouge CMXRos, MitoTracker Deep Red FM ou MitoTracker vert FM, qui ne fuit pas des mitochondries cours de l'apoptose. Ceci permet la visualisation de la morphologie des mitochondries pendant l'apoptose et anastasis. Voir les matériaux et tableau des équipements pour plus de détails au sujet de ces taches.
    2. Gardez cellules colorées dans l'obscurité pour éviter photoblanchiment.
    3. Retirer l'excès de colorant par lavage des cellulesTrois fois avec de 37 ° C tampon phosphate saline (PBS) ou du milieu de culture cellulaire frais, avec une min d'incubation dans le milieu frais entre chaque lavage, puis incuber en outre dans le milieu frais pendant 20 minutes avant le lavage final à permettre excessive les taches de sortir des cellules pour réduire arrière-plan du signal non-spécifique pour l'imagerie.
      Remarque: Raccourcir les temps d'incubation avec du milieu cellulaire après coloration peut entraîner une forte arrière-plan pour l'imagerie.
    4. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou la microscopie épi-fluorescence pour les cellules saines de l'image avant l'induction apoptotique est appliquée (Voir le protocole 3 pour la microscopie de cellules vivantes).
      Remarque: Les cellules saines présentent des mitochondries et des noyaux tubulaires ronds dans la plupart des types de cellules (figures 1D, 1F, 1G).
    5. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules).
    6. Continuer time-lapse microscopie de cellules vivantes pour observer des modifications dans morpholog mitochondrial et nucléaireies immédiatement après le stimulus est appliqué à la mort des cellules. Respecter les cellules affichant caractéristiques de l'apoptose mitochondriale tels que la fragmentation et le gonflement, la condensation de la chromatine et la fragmentation nucléaire, contrairement aux cellules saines présentant des mitochondries et des noyaux tubulaires ronds.
    7. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, laver et fournir les cellules avec du milieu frais, et continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules. Les cellules que l'apoptose mitochondriale inversent retrouver normale et de la morphologie nucléaire (figures 1D, 1F, 1G).
      Remarque: effectuer DIC microscopie en parallèle lorsque ce est possible d'obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose en observant les modifications de la morphologie des cellules dans le même groupe de cellules (voir Protocole 4,1 pour microscopie DIC).
  3. Détection de la libération du cytochrome c mitochondrial utilisant des cellules exprimant de manière stable un cytochrome c pr fusion GFPotein (voir figure 2).
    1. cellules exprimant de façon stable taches cytochrome c GFP avec 23,24 MitoTracker Rouge d'étiqueter les mitochondries des cellules polarisées (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour vivre cellules mitochondries coloration).
    2. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou épi-microscopie à fluorescence pour suivre les cellules saines (Détails dans le protocole no 3 pour l'imagerie de cellules vivantes).
      Remarque: Le signal de GFP cytochrome c se localise principalement dans les mitochondries des cellules saines (figures 2A i, 2B).
    3. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules). Continuer Vidéomicroscopie d'observer translocation du cytochrome c GFP des mitochondries vers le cytosol (figures 2aii-iii, 2B).
      Remarque: la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol est un marqueur de mitochondrial perméabilisation de la membrane externe (MOMP)4, une étape critique dans les mitochondries apoptose dépendante 21,22
    4. Lorsque les cellules affichent le signal de GFP du cytochrome c dans le cytoplasme, retirer le stimulus de la mort cellulaire, et les cellules d'alimentation avec du milieu frais (Voir protocole n ° 2). Continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules avec GFP cytosolique.
      Note: Les cellules que l'apoptose inversent retrouver morphologie cellulaire normale, et réduire leur signal de GFP du cytochrome c cytosolique probablement par la dégradation ou la translocation retour aux mitochondries (figures 2Aiv-vii, 2B).
    5. Capturer des images DIC en parallèle pour obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose par l'observation des modifications de la morphologie cellulaire dans des cellules ou groupes de cellules individuelles (Voir 4.1 Protocole pour la microscopie DIC).
  4. Détection de l'activité de la caspase en utilisant un biocapteur de caspase (voir la figure 3)
    1. transfecter des cellules avec le caspase biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS pour16-24 h avant de les soumettre à un stimulus apoptotique 13.
    2. Colorer les cultures transfectées avec Hoechst 33342 pour marquer les noyaux des cellules (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour la coloration nucléaire des cellules vivantes).
    3. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou épi-microscopie à fluorescence pour suivre les cellules saines (Détails dans le protocole no 3 pour l'imagerie de cellules vivantes).
      Remarque: Le signal de biocapteur NES-DEVD-YFP-NLS localise principalement dans le cytosol des cellules saines en raison de son signal d'export nucléaire (NES) (figures 3A, 3BI et 3C, voir la discussion).
    4. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules). Continuer Vidéomicroscopie d'observer la translocation nucléaire de la YFP.
      Remarque: L'activation des caspases clive le motif dans la caspase DEVD biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS, résultant en YFP-NLS translocation du cytosol vers le noyau (figures 3A, 3Bii-iv, voir la discussion).
    5. Lorsque les cellules affichent YFP nucléaire, supprimer le stimulus apoptotique, et les cellules d'alimentation avec du milieu frais (voir le protocole 2).
      Remarque: Les cellules qui inversent l'apoptose retrouver la morphologie cellulaire normale, mais conservent le signal YFP nucléaire (figures 3Bv-x, les cellules 1 et 2, et 3D).
    6. Continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules qui affichent YFP nucléaire.
      Remarque: Le signal YFP nucléaire deviendra dégradées plusieurs heures après que les cellules ont inversé l'apoptose (figures 3B, vi-x, Cell 1, Résultats et discussion) vraisemblablement par le biais des mécanismes de clairance des cellules normales telles que la dégradation du protéasome.
    7. Capturer des images DIC en parallèle pour obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose par l'observation des modifications de la morphologie cellulaire dans des cellules individuelles ou d'un groupe de cellules. (Voir le protocole 4.1 pour microscopie DIC).
  5. l'exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine (voir Figure 4)
    1. cellules de semences sur glass lamelles de d'atteindre 80% de confluence cellulaire (Voir Protocole 1).
    2. Co-tache les cellules avec MitoTracker rouge et bleu fluorescent Hoechst 33342 tache pendant les mitochondries et les noyaux, respectivement (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour mitochondriale des cellules vivantes et de coloration nucléaire).
    3. Déclencher cellules à l'apoptose en utilisant un inducteur d'apoptose (Voir protocole n ° 2).
    4. Appliquer à marquage fluorescent à l'annexine V (Voir Matériaux) pour colorer les cellules apoptotiques 10 min à 37 ° C avant le retrait de l'inducteur de l'apoptose pour détecter l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface des cellules apoptotiques.
      Note 1: saine cellules ne sont pas colorées avec l'annexine V parce phosphatidylsérine est normalement séquestré sur le centre-feuillet de la membrane plasmique de la cellule 38. Les cellules apoptotiques sont colorées avec l'annexine V, qui se lie à la phosphatidylsérine sur la surface cellulaire (figures 4A et 4B).
      Note 2: marquage fluorescent à l'annexine V peut aussi être appliquée pour colorer les cellules apoptotiques immédiatement après le retrait de l'inducteur de l'apoptose, avec 10 minutes d'incubation.
    5. Retirer la mort cellulaire stimulus, laver les cellules colorées avec du PBS chaud ou milieu frais une fois, puis fournir les cellules avec du milieu frais pendant 2 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2 (Voir Protocole 2).
      Note 1: Les cellules qui inversée apoptose retrouver morphologie normale et retenir marqué par fluorescence signal de V annexine après avoir retrouvé une morphologie normale (figures 4A et 4B).
      Note 2: Le signal annexine V diminue avec le temps sur les cellules récupérées (voir la discussion).
    6. Fixer les cellules à des moments choisis avec 4% de paraformaldehyde contenant 8% de saccharose dans 1x PBS pendant 20 minutes dans l'obscurité à la température ambiante, et laver les cellules fixées avec du PBS pour trois fois pour éliminer paraformaldehyde avant que les cellules de montage sur des lames de verre lamelles de avec antifade milieu de montage (Voir Matériaux) pour la microscopie confocale ou épi-fluorescence et observer annexine V sur les cellules après l'enlèvement de l'apoptose inducteur.
      Note 1: Le saccharose dans un fixateur préserve la structure de la membrane cellulaire lors de la fixation.
      Note 2: Conserver la solution de paraformaldéhyde dans l'obscurité à 4 ° C pour éviter la dégradation.
      Note 3: Warm up solution de paraformaldéhyde à la température ambiante avant de l'appliquer aux cellules pour la fixation pour éviter un choc froid pour les cellules.

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Résultats

Pour étudier l'inversion de l'apoptose, des cellules de culture tissulaire sont d'abord exposés à un stimulus de mort pour déclencher l'apoptose. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, milieu de culture frais est ensuite appliqué à laver le stimulus et ensuite incuber les cellules mourantes pour permettre la récupération (figure 1A). Ici, la question clé étant adressée est de savoir jusqu'où cellules cultivées meurent individuels peuvent progresser vers l'apoptose et encore subir...

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Discussion

Anastasis désigne le phénomène où les cellules qui ont activés voie de mort cellulaire inverse par la suite le processus de la mort et de survivre. Ici, nous avons démontré que l'imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour confirmer que les mêmes cellules individuelles en fait peuvent inverser apoptotique processus de mort cellulaire à un stade tardif, et puis continuer survivant et la reproduction. Nos protocoles décrivent différentes conditions de traitement spécifiques d'un type cellulaire optimisé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Révérend Dr. Ralph Bohlmann et le révérend Dr James Voelz pour suggérer le mot "Anastasis" pour décrire l'inversion de l'apoptose; Douglas R. Green pour les cellules HeLa exprimant de façon stable cytochrome c GFP; Charles M. Rudin et Eric E. Gardner pour H446 cellules; Heather Lamb d'assistance en dessin animé à la vidéo; Yee Hui Yeo de discussion précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la bourse Dr Walter Szeto Memorial (HLT), bourse Fulbright 007-2009 (HLT), Fondation Life Science Research Fellowship (HLT), NIH accorde NS037402 (JMH) et NS083373 (JMH), et le Comité de la Hong Kong University Grants AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang est une Fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
LSM780 Microscopie confocaleCarl Zeiss Plat de
culture à fond de verreMatTek CorporationP35G-0-14-C
Transparent CultFoiCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 indépendantLife Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker Red CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
Annexine V BiovisionK201

Références

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