Article de méthode

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

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DOI :

10.3791/52008

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10 octobre 2014

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1Center for Biotechnology Education, Johns Hopkins University, 2PBS Biotech, Inc.

Dans cet article

Résumé

À l’aide d’un bioréacteur pneumatique, nous démontrons l’assemblage, le fonctionnement et les performances de ce système de bioréacteur à usage unique pour la croissance de cellules de mammifères.

Résumé

Les progrès récents dans la culture et la mise à l’échelle de cellules de mammifères, d’insectes et de cellules souches ont créé d’énormes opportunités pour de nouvelles thérapies et des innovations en médecine personnalisée. Cependant, pour traduire ces avancées en applications thérapeutiques, il faudra des systèmes in vitro permettant de disposer de systèmes de bioréacteurs robustes, flexibles et rentables. Il existe plusieurs systèmes de bioréacteurs actuellement utilisés dans la recherche et le commerce ; Cependant, bon nombre de ces systèmes ne sont pas optimaux pour l’établissement, l’expansion et la surveillance de la croissance de différents types de cellules. Les paramètres de culture les plus difficiles à contrôler dans ces systèmes comprennent la minimisation du cisaillement hydrodynamique, la prévention de la formation de gradients de nutriments, l’établissement d’une aération uniforme du milieu de culture, la prévention de la contamination microbienne et la surveillance et l’ajustement des conditions de culture en temps réel. À l’aide d’un système de bioréacteur pneumatique à usage unique, nous démontrons l’assemblage et le fonctionnement de ce nouveau bioréacteur pour les cellules de mammifères cultivées sur des micro-supports. Ce système de bioréacteur élimine de nombreux défis associés aux systèmes actuellement disponibles en minimisant le cisaillement hydrodynamique et la formation de gradients de nutriments, et en permettant une aération uniforme du milieu de culture. De plus, le logiciel du bioréacteur permet de surveiller et d’ajuster à distance en temps réel les paramètres de fonctionnement du bioréacteur. Ce système de bioréacteur présente également un énorme potentiel de mise à l’échelle de cellules de mammifères adhérentes et en suspension pour la production d’une variété de protéines thérapeutiques, d’anticorps monoclonaux, de cellules souches, de biosimilaires et de vaccins.

Introduction

Lignées de cellules de mammifères peuvent être classés en trois catégories en fonction de leurs caractéristiques de croissance: les cellules qui se développent en suspension, les cellules qui poussent comme des agrégats, et les cellules qui poussent ancré sur un substrat. Bien que le bioréacteur air roues démontré dans cette vidéo est capable de croître tous les trois types de cellules, cette vidéo démontre l'utilisation du bioréacteur à cultiver des cellules dépendantes de l'ancrage sur les micro-supports. Des cellules de mammifère dépendantes d'un support peuvent être cultivées dans le but de produire plusieurs cellules - où les cellules elles-mêmes sont le produit. Par exemple, les cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse humaine sont actuellement cultivés dans le but de récolter les cellules et de les injecter dans le tissu malade. Le bioréacteur pneumatique montré dans cette vidéo s'est avéré approprié pour la production de ces cellules souches mésenchymateuses de la présente demande (Serra et al., Communication personnelle, 2013).

Anchorage deples cellules de mammifères sont généralement de endent cultivées à petite échelle dans des récipients de culture 2D tels que des plaques de culture cellulaire, des flacons de culture cellulaire, ou des bouteilles roulantes, où elles adhèrent à une surface de croissance spécialement traité 1. Lorsque plusieurs cellules sont souhaitées, les plaques ou les flacons peuvent être développées en utilisant des navires de plus ou plus. Cependant, pour plus de culture rentable de grandes quantités de cellules dépendantes de l'ancrage, ce qui augmente la surface pour la fixation des cellules peut être réalisée en utilisant de petites billes solides appelées micro-supports. En fonction des caractéristiques de fixation de la cellule, plusieurs types différents de micro-supports sont disponibles dans le commerce, tels que le dextrane, un peptide, ou revêtues de collagène. Les micro-porteurs ont une grande surface par rapport au volume offrant une plus grande surface pour la croissance des cellules; et les micro-supports peuvent être maintenues en suspension par agitation, ce qui permet aux cellules d'être cultivées à des densités élevées en deux systèmes de bioréacteurs. Actuellement, les types de bioreacteurs où les cellules adhérentes sont cultivées sur des micro-supports comprennent des flacons spinner et des systèmes de réservoir agité, qui utilisent des turbines axiales à maintenir une suspension de enrobées de cellules micro-transporteurs.

Plusieurs facteurs sont importants pour le succès de la culture de cellules, y compris la tension en oxygène, la contrainte de cisaillement, la surface de la matrice, et les concentrations d'éléments nutritifs et de métabolites. L'utilisation de bioréacteurs permet la surveillance en temps réel des conditions de croissance et le potentiel de façon significative les coûts de production inférieurs 1. Il existe plusieurs modèles de bioréacteurs commun pour la culture in vitro de cellules, y compris, suspension agitée, tournant navire de mur, à fibres creuses, sac bioréacteur sur une plate-forme de bascule, et les systèmes à lit fluidisé 3. Beaucoup de ces systèmes présentent des problèmes particuliers pour la culture de cellules et de l'échelle -up, tels que le coût élevé, des éléments nutritifs des gradients de concentration, de cisaillement hydrodynamique, l'agrégation de cellules, et la difficulté de l'échantillonnage, la surveillance et le contrôle de cell échelle.

Diverses lignées de cellules adhérentes sont utilisés dans la production de virus, que ce soit dans la production de vaccins viraux ou pour la production de vecteurs viraux pour des applications de thérapie génique. Dans cette vidéo, à l'aide de l'utilisation unique pneumatique (air-roue) système de bioréacteur, nous démontrons la culture de cellules de carcinome de poumon humain (A549) de cellules sur micro-supports pour la production d'un adénovirus oncolytique. La conception du bioréacteur pneumatique utilise une roue à agitation verticale qui est alimenté par la flottabilité du gaz injecté dans la partie inférieure du bioréacteur. Cette méthode d'agitation douce limite des forces de cisaillement hydrodynamiques, mais assure toujours moyen optimal et cellule de mélange 4. Par rapport au réacteur à cuve agitée, le réacteur pneumatique a une faible contrainte de cisaillement de paroi, même avec des systèmes de bioréacteurs Air-roue en grand volume (figure 1). Contrairement aux bioréacteurs à cuve agitée, la roue verticale de ce réacteur à usage unique est activé par un courant de bulles de gaz à l'intérieurle récipient, ce qui permet de tendre et uniforme moyen mélangeur (figure 2).

Protocole

1 Connexion

  1. Alimenter le bioréacteur. Cliquez n'importe où pour ouvrir la page de connexion. Sélectionnez le nom d'utilisateur et entrez le mot de passe et cliquez sur «Connexion».

2. étalonnage

  1. Calibrer capteur de pH (2 points avant autoclavage).
  2. Inspectez capteur de pH et de confirmer la pointe du capteur est rempli avec une solution d'électrolyte. Préparer deux béchers avec des solutions d'étalonnage de pH (électrolytiques) de pH 4 et pH 7 et disposer d'une bouteille de lavage avec de l'eau distillée.
  3. Branchez le câble de pH au capteur de pH. Accédez à l'onglet "Actions" sur l'interface Bonjour et cliquez sur "calibrer". Entrez la température du tampon dans le domaine de température de la solution d'étalonnage.
  4. Placez capteur de pH dans le tampon 1 (pH 4) et entrer la valeur dans le champ "zéro". Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton "calibrer 1", cliquez sur. Rincez le capteur de pH avec de l'eau distillée.
  5. Placer le capteur dans un tampon 2 (pH 7). Entrez tampon2 valeur dans le champ "span". Attendez graphique pour stabiliser et cliquez sur le bouton calibrer 2.
  6. Cliquez sur "Enregistrer" puis cliquez sur "Fermer".
  7. Calibrer le capteur d'oxygène dissous (DO).
  8. Assurer la sonde à oxygène a été polarisé en étant connecté au système pendant plusieurs heures. Accédez à l'onglet "Actions" sur l'interface Bonjour et cliquez calibrer. Cliquez sur le bouton "faire un".
  9. Débrancher la sonde à oxygène et entrez 0 dans le champ "zéro". Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton "Calibrer 1", cliquez sur.
  10. Rebranchez le capteur DO et entrez 100 dans le domaine «Span». Attendez que le graphique pour stabiliser et le bouton "Calibrer 2", cliquez sur.
  11. Cliquez sur "Enregistrer" puis cliquez sur "close".

3. autoclave et installer des capteurs et des navires de réactifs

  1. Après calibration, placer des capteurs et bien thermique dans AUTOCsachets Lave et autoclave pendant 30 min à 121 ° C, 15 psi.
  2. Désinfectez sachets autoclave avec 70% d'alcool isopropylique (IPA) et de transfert des sachets à enceinte de sécurité biologique (BSC). Retirez l'emballage extérieur du bateau.
  3. Désinfectez emballage intérieur, avec 70% d'IPA et transférer navire enceinte de sécurité biologique (BSC). Retirez l'emballage intérieur et d'inspecter le navire et les tubes des dommages causés lors de l'expédition.
  4. Installer le pH et DO capteurs dans les deux ports avant. Installez le bien thermique au port arrière gauche. Ouvrez le bouchon du capteur.
  5. Guide de la sonde à travers l'orifice de la sonde. Enfilez le capteur fermement dans le port.
  6. Transfert navire de BSC.
  7. Accrochez le DO et les câbles de capteur de pH en dehors de la douille de navire et vérifier que rien n'est dans le manchon. Faites glisser le navire dans le manchon, les pieds en premier.
  8. Installer avec précaution le capteur de température dans le puits thermique de la cuve. Assurez-vous que le fond du récipient est en appui contre les dispositifs de chauffage.
  9. Supprimerle tube fixe de leurs sacs. Alignement de codage de couleur sur les tubes aux raccords et les pompes correspondantes sur l'unité de contrôle du bioréacteur.
  10. Installez la conduite de gaz principale en appuyant sur le connecteur dans la prise de gaz. Installez la conduite de gaz micro en tournant le raccord vers la droite dans la sortie de gaz. Installez le tube de filtre d'échappement:
  11. Ouvrez le four de filtre. Fixer le filtre d'échappement sur le profilé en U de sorte que son tube passe par les deux crochets au filtre et à la sortie du four.
  12. Installation du tuyau par sac de condenseur dans le porte-tube. Fermer la porte.
  13. addition des lignes de Route A et B, les deux lignes des médias, et la ligne de récolte derrière la sonde à oxygène et sur le banc à côté de l'unité de commande de bioréacteur.
  14. Connectez les câbles aux DO et pH capteurs.

4. Ajout moyennes et micro-supports

  1. Accédez à l'onglet "actions" et cliquez sur "Control Pompes" sur l'interface de l'ordinateur.
  2. Former un stérilisateurle raccordement entre une ligne non utilisée moyen d'addition (une bande orange) et la source de la bouteille / du sac par le soudage du milieu ou les tubes en utilisant des raccords Luer.
  3. Cliquez sur le curseur pour activer la pompe de médias sur. Cliquez sur le curseur pour éteindre la pompe les médias au bout de plus la quantité désirée de milieu.
  4. Passer billes microsupports en Ca2 +, Mg2 + libre du PBS pendant 3 h à température ambiante.
  5. Laver Perles plusieurs fois avec Ca2 +, Mg 2 + libre PBS.
  6. Autoclave pendant 15 minutes à 115 ° C, 15 psi.
    NOTE: Ajouter 3 g / L (poids sec) dans cette expérience.
  7. Pompe à micro-supports qui ont été hydratées, lavées et passées à l'autoclave dans le réacteur de la même manière, le milieu est ajouté à l'étape 4.1.

5. équilibrage et à un point DO étalonnage

  1. Réglez les contrôleurs à Auto et entrez les consignes désirées. Ici, utiliser agitation du point de consigne (SP) = 15 min, Température SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendez que le pramètres s'équilibrer.
  2. Confirmez capteur est complètement polarisée. Confirmez DO valeur actuelle s'est stabilisée.
  3. Accédez à l'onglet "Actions" et cliquez sur "calibrer". Cliquez sur "DO A", cliquez sur "à un point".
  4. Entrez «100» dans le champ «Span». Cliquez sur le bouton "Calibrer 1", cliquez sur "Enregistrer" et cliquez sur "Fermer":

6 Démarrage d'un cycle

  1. Accédez à l'onglet Actions. Cliquez sur "Batch". Utilisez le clavier à l'écran ou un clavier externe pour entrer un nom de lot 16 caractères ou moins.
  2. Cliquez sur "Masquer" bouton du clavier à l'écran. Cliquez sur "Démarrer lot" confirmer en cliquant sur "Démarrer" dans la superposition.

7 Ensemencer avec des cellules

  1. Former une connexion stérile entre d'une sortie ligne de plus moyen (1 bande orange) et le sac de source / bouteille de cellule par soudagele tube ou l'aide des raccords Luer.
  2. Installer la section de silicone de la tubulure dans la pompe de support de sorte que la flèche vers le tube entre la pompe et la cuve.
  3. Vérifiez les tuyaux pince est ouverte et sa pince de tube ramifié est fermé. Cliquez sur le curseur pour éteindre la pompe de médias sur et cliquez sur «Off» après l'ajout de cellules.
  4. Accédez à l'onglet "Actions" et cliquez sur "Pompes de contrôle".

8. échantillonnage

  1. Après inoculation et aussi souvent que désiré pour surveiller la culture, prélever un échantillon de la culture de la manière suivante:
  2. Accédez à l'onglet "actions" et cliquez sur "prendre exemple". Placez le tuyau d'échantillonnage dans la pompe de prélèvement et de manipuler le robinet de prélèvement selon les instructions à l'écran.
  3. Effectuer au moins une observation microscopique jour et le nombre de cellules sur ces échantillons.
  4. Lorsque les cellules ont atteint la densité souhaitée, dans ce case 1,2 x 10 6 cellules / ml, infecter les cellules avec l'addition d'un inoculum de virus.
  5. Ajouter de manière aseptique de l'inoculum à une seringue de 20 ml, et de relier la seringue à l'un des ports d'addition de rechange sur le réacteur. Introduire l'inoculum dans le réacteur en appuyant sur le piston de la seringue.
  6. Continuer l'échantillonnage et l'analyse de la culture de la concentration de particules d'adénovirus intracellulaire.

Résultats

Sur la figure 3, les paramètres de déclenchement de la course de bioréacteur sont présentés. Cette figure montre l'écran avant de fixer les paramètres de température, l'oxygène dissous, le pH et l'agitation. Une fois que les paramètres sont définis, les paramètres d'exécution sont surveillés en permanence et des ajustements peuvent être faits pour maintenir les conditions requises. Le logiciel produit une lecture continue qui permet d'identifier facilement les problèmes. Dans cette expérience, en utilisant 2,5 L de milieu DMEM contenant 10% de FBS, 250 ppm de SAFC Anti-mousse C, 2 mM de L-glutamine et 3 g / l de micro-porteurs, le système est stabilisé de sorte que le pour cent d'oxygène est de 50%, l' la température est de 37 ° C, et le pH est de 7,2. Le réacteur est inoculé avec des cellules A549 à une concentration de 7 x 10 4 cellules / ml (soit 10 cellules / micro-porteurs). Les paramètres choisis pour cet essai ont permis, dans la majorité des cellules qui adhèrent aux micro-porteurs à l'intérieur de 2 heures (figure 4). Après 12 h, les cellules sont des démonstrant des signes de l'aplatissement et l'étalement sur ​​la surface de micro-support (Figure 5). En 24 heures, les micro-porteurs ont une répartition relativement égale des cellules, sans micro-supports sans cellules et pas de grands amas de cellules sur les micro-supports (Figure 6). Le pourcentage de micro-support colonisation par des cellules A549 est de 75% en 24 h et de 90% par la suite (figure 7). Les cellules ont continué à croître de façon exponentielle à ~ 1 million de cellules / ml après 48 heures (Figure 8). Après infection par une dose d'adénovirus oncolytique (2 x 10 8 virions / ml) à 50 h, la densité a augmenté à 1,2 millions de cellules / ml, puis a commencé à diminuer à mesure que l'infection lytique progressé. Il y avait ~ 10.000 fois amplification de l'inoculum viral.

Dans les expériences précédentes, nous avons trouvé que le contrôle et le réglage de l'écoulement de gaz est essentiel pour optimiser la croissance des cellules (données non publiées). Rapidement les cellules en croissance peuvent épuiser le système de l'oxygène avec le niveau de l'oxygène pour tomber à zéro. Alors que les cellules ont continué à croître, il était à un rythme beaucoup plus lent. Il est important de surveiller et d'ajuster le débit d'oxygène pour satisfaire les exigences de la cellule pendant la phase de croissance logarithmique. Chaque course peut être analysée pour une croissance optimale en comparant le pH, DO, et la température avec les comptes quotidiens cellulaires.

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Figure 1: la dynamique des fluides du système bioréacteur pneumatique (PBS) par rapport à un réservoir agitateur bioréacteur mesure des forces de cisaillement de mur à différents volumes de réacteur.

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Figure 2 pneumatique Air roues réacteur turbine.

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Figure 3. pneumatique Air Roue logiciel capture d'écran de paramètres pour lancer le cycle de bioréacteur.

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Figure 4 Micro porte-colonisation par des cellules A549 2 heures après l'inoculation. (Diamètre micro-porteur moyen ~ 180 um.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5 h 12 après le début de la culture, les cellules A549 sont attachants, planer, et la diffusion sur les micro-supports.5highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6: Micro-porteuses revêtues de cellules après 24 heures de culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 7 Pourcentage de micro-support colonisation par des cellules A549 après l'inoculation.

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Figure 8: Le nombre de cellules viables A549 en culture avant et après l'infection avec adenovirnous. Notez que l'étape de l'infection virale a eu lieu à 50 h.

Discussion

Ce système de bioréacteur à usage unique est relativement simple à utiliser et fournit des analyses en temps réel pour la surveillance et l'analyse réacteur. Il est très bien adapté pour la culture de cellules de mammifères et d'insectes avec des densités cellulaires atteignant plus de 30 millions de cellules / ml. Outre les cellules A549 décrits dans ce rapport 11, nous avons grandi SF-9 cellules d'insectes dans le bioréacteur ainsi. Le mélange doux fourni par la roue d'air pneumatique réduit les dommages cellulaires. Plusieurs étapes sont essentielles lors de la création de ce réacteur. Tout d'abord, le calibrage approprié du pH et les sondes à oxygène sont importantes pour le contrôle optimal de la culture et pour l'addition de réactifs pour ajuster le pH ou l'oxygène dans le système. Deuxièmement, les flacons de réactifs et de semences doivent être remplis et les pièces jointes luer fait dans un environnement stérile comme un BSC. Une fois que les bouteilles de réactif sont déplacés hors de l'environnement stérile, les liaisons avec les lignes d'alimentation de bioréacteur doivent être effectués avec soin pour éviter une contamination microbienne.

Bien que ce système de bioréacteur fonctionne bien pour les lignes cellulaires mammifères et d'insectes, il n'est pas conçu pour des cultures bactériennes. Le système ne peut pas fournir le mélange rapide et l'oxygénation qui est nécessaire pour les cellules bactériennes. La croissance bactérienne est mieux assurée dans un bioréacteur à cuve agitée. Par rapport à d'autres bioréacteurs à usage unique pour la culture de cellules de mammifères ou d'insectes, ce système est facile à utiliser, fournit des données suffisantes pour l'analyse des pistes, et a la croissance des cellules similaire ou meilleure que l'autre système à usage unique que nous avons évalué.

Le système de bioréacteur pneumatique à usage unique a le potentiel de répondre à un grand nombre de la recherche et les applications cliniques dans les domaines de produits biothérapeutiques, les vaccins, les cellules souches et la médecine personnalisée 4. En outre, la souplesse de ce système permet de batch, fed-batch, la perfusion, et la transfection à base de bioréacteur applications 5. Enfin, à usage unique systèmes de bioréacteurs jetables ont le potentiel pour répondre aux besoins de la production industrielle à grande échelle et à se conformer aux directives et recommandations des organismes de réglementation nationaux et internationaux 6-10.

Déclarations de divulgation

Auteurs D. Giroux et Y. Hashimura sont des employés de PBS Biotech qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Remerciements

Ce projet a été soutenu en partie par l’Université Johns Hopkins, Bureau du vice-recteur par le biais de la Gateway Science Initiative.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PBS 3Assemblage PBS
usage uniqueCellules de
(A549)ATCCCCL-185
DMEM Glucose élevé Moyen Sérum
fœtal bovin
Trypsine EDTA, 0,25 %
Cytodex 1 MicrotransporteursGE3781
Antimousse CSigmaA8011
à carcinome pulmonaire humain PBS

Références

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
  2. Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
  3. Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
  4. Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).
  5. Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
  6. Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
  7. Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
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  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
  10. Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
  11. Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).

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Mots-clés

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