Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l'aide qu'épisomes et les inhibiteurs de HDAC

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d'histone déacétylase.

Résumé

Ce manuscrit illustre un protocole pour créer efficacement des cellules gratuit intégration humains souches pluripotentes induites (CISP) du sang périphérique en utilisant des plasmides épisomiques et histone déacétylase (HDAC) inhibiteurs. Les avantages de cette approche sont les suivants: (1) l'utilisation d'une quantité minimale de sang périphérique en tant que matériau de source; (2) nonintegrating vecteurs de reprogrammation; (3) une méthode rentable pour générer des vecteurs iPSCs libres; (4) une seule transfection; et (5) l'utilisation de petites molécules pour faciliter la reprogrammation épigénétique. En bref, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir d'échantillons de phlébotomie routine et ensuite mises en culture dans des facteurs de croissance définies pour obtenir une population de cellules progénitrices érythrocytaires hautement proliférative qui est remarquablement prêtent à une reprogrammation. Nonintegrating, plasmides épisomiques non transmissibles exprimant OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, et un court en épingle à cheveux (sh) ARN p53 sont introduced dans les érythroblastes dérivés via une seule nucléofection. La co-transfection d'un épisome qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) permet une identification facile des cellules transfectées. Un plasmide à réplication déficiente séparé d'Epstein-Barr exprimant l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) est également ajouté au mélange réactionnel pour une expression accrue de protéines de épisomiques. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées (les iMEFs) pour une reprogrammation continue. Dès que des colonies apparaissent comme iPSC à environ douze jours après nucléofection, les inhibiteurs de HDAC sont ajoutés au milieu pour faciliter le remodelage épigénétique. Nous avons trouvé que l'inclusion d'inhibiteurs HDAC augmente régulièrement la génération de colonies iPSC entièrement reprogrammé par 2 fois. Une fois colonies iPSC présentent typique cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) morphologie, ils sont délicatement transférés à Imef tissus enduits des plaques de culture individuels pour la croissance et l'expansion continue.

Introduction

iPSCs sont dérivées de tissus somatiques par l'expression ectopique d'un ensemble minimal de gènes de pluripotence. Cette technique a d'abord été démontré par transduction rétrovirale des fibroblastes humains avec OCT4, SOX2, KLF4, et cmyc, qui sont fortement exprimés dans l'état pluripotent ^1. Ces exprimés de façon transitoire "facteurs de reprogrammation épigénétique" modifient le paysage et profil d'expression génique de la cellule cible analogue aux cellules souches embryonnaires humaines ^2. Une fois créé, iPSCs peut potentiellement être différenciées en tout type de tissu pour complément d'enquête. Ainsi, ils sont prometteurs pour l'utilisation dans la médecine régénérative, la modélisation des maladies, et des applications de thérapie génique. Cependant, ce qui perturbe le génome des virus intégrant a le potentiel de modifier l'expression du gène endogène, influence le phénotype cellulaire, et en fin de compte de biaiser les résultats scientifiques. En outre, les intégrations virales aléatoires peuvent conduire à délétère e cellulaireffets, y compris la possibilité d'une transformation maligne ³ ou ré-expression des transgènes oncogènes ^4. Futures applications cliniques, il faudra intégrer les non-génération iPSC.

Qu'épisomes, qui sont chromosomiques circulaire molécules d'ADN supplémentaires, offrent une stratégie visant à générer iPSCs rentables, sans ^{intégration-5.} La combinaison de vecteurs épisomiques indiqués dans le tableau 1 expriment la reprogrammation facteurs OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, et LIN28A. Le plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contient également une p53 shRNA pour la suppression temporaire de TP53 à améliorer la reprogrammation cellulaire ^6. Le déficient vecteur pCXWB-EBNA1 réplication favorise l'amplification des facteurs de reprogrammation et une efficacité accrue de reprogrammation en fournissant une augmentation transitoire de l'expression de EBNA1 ^7. Le plasmide pCXLE_EGFP peut être ajouté au mélange de nucléofection dans le but de determining l'efficacité de transfection ou pour des applications de tri des cellules. A l'exception du p-EBNA1 CXWB, des plasmides épisomiques utilisées dans ce protocole contiennent l'origine du virus d'Epstein-Barr de la réplication du virus et le gène EBNA1, qui médient la réplication et la partition de l'épisome au cours de la division de la cellule hôte ^8. Les qu'épisomes sont spontanément perdu avec extensions successives iPSC ^7. Sous-clonage et la caractérisation des CSPi avec épisomaux perte de vecteur, qui peut être déduit de la perte d'expression eGFP, peuvent conduire à l'intégration complètement iPSCs gratuits pour futures applications cliniques.

Inhérente au processus de génération iPSC est la suppression de gènes spécifiques de la lignée et la réactivation des gènes de pluripotence associée. Régulation de l'expression des gènes se produit à plusieurs niveaux dans le noyau, y compris les modifications de l'ADN et la chromatine pour permettre des facteurs de transcription, des éléments d'ADN régulatrices, et l'accès de l'ARN polymérase à ciblergènes. Rénovation du paysage épigénétique via des modifications globales de la chromatine est un élément clé de ré-expression du programme génétique de la pluripotence. Une modification de la chromatine spécifique qui est importante dans la régulation de l'expression génique est l'acétylation des histones particulier à des résidus lysine, permettant l'accès à cibler des gènes par le biais diminution de la tension de la bobine d'histone-ADN. Les inhibiteurs de HDAC sont de petites molécules qui ont été montré pour améliorer la reprogrammation de cellules iPSC et CSEh auto-renouvellement ^9,10, probablement en raison de l'appui de l'état acétylé ^11. Le protocole décrit ci-dessous, adapté d'une publication préalable en utilisant des lentivirus intégrant ^12, fournit une méthode étape par étape pour la production de cellules iPSC optimisé de sang périphérique en utilisant qu'épisomes et les inhibiteurs d'HDAC. Les concentrations d'inhibiteur d'HDAC utilisés ici sont la moitié de ceux décrits par Ware, et al. ^9, et ont systématiquement conduit à une augmentation de 2 fois dans les colonies iPSC entièrement reprogrammés plus de normeprotocoles de reprogrammation épisomaux sans inhibiteurs d'HDAC. Ce niveau de reprogrammation va de pair avec l'efficacité que nous observons avec les méthodes lentiviraux. En utilisant ce protocole, nous avons généré efficacement iPSC de personnes comme vieux de 87 ans.

Protocole

Le consentement éclairé, tel qu'approuvé par les Institutional Review Board de la Cancer Research Center Fred Hutchinson et de l'hôpital de Philadelphie s enfants », a été obtenu à partir de patients avant de recueillir des échantillons de sang périphérique. Toutes les lignes directrices institutionnelles ont été observées. Toutes les expériences animales, y compris la génération MEF et formation de tératome ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et institutionnel.

1. Ficoll séparation des PBMC et Expansion des érythroblastes - Jour 0

1. Diluer le sang périphérique de 1: 1 avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Dans un tuyau à fond rond en polystyrène de 15 ml, 7 ml soigneusement la couche de sang dilué sur 3 ml de la température ambiante de Ficoll-Hypaque.
2. Centrifuger l'échantillon à 400 g pendant 30 min.
3. Les PBMC aura réglé à l'interface entre le plasma et le Ficoll-Hypaque, vu comme une couche blanche trouble. L'utilisation d'un transfert pipette stérile, recueillir le PBMC dans un tube de 15 ml conique. Porter le volume à 10 ml à l'aide de DPBS.
4. En utilisant un hématimètre, compter les PBMC.
5. Pipette 2 × 10 ⁶ PBMC dans un tube de 15 ml conique séparé et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Centrifuger les cellules restantes et le gel à une concentration de 2 x 10 ⁶ CMSP / ml dans 90% de sérum bovin fœtal (FBS) / 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
6. Préparer Expansion: milieu libre QBSF-60 sérum (abri de la lumière) + pénicilline / streptomycine (1%) + acide ascorbique (50 ng / ml) + facteur des cellules souches (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + érythropoïétine (EPO, 2 U / ml) + insuline-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexaméthasone (1 uM; abri de la lumière; dégeler une partie aliquote de chaque média changer).
7. Remettre en suspension 2 × 10 ⁶ PBMC dans 2 ml de fraîchement préparé milieu d'expansion et le placer dans un puits d'une plaque de culture de 12 tissu puits et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° avec une atmosphère de 5% O _2, 5% CO ₂ et 90% N _2.
8. Le jour 3 et le jour 6, remplacer médias.
   1. Recueillir les cellules et laver le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir toutes les cellules restantes.
   2. Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 5 min et le surnageant aspiré.
   3. Reprendre les cellules dans 2 ml de la nouvelle extension moyenne et les retourner à la même plaque 12 puits.

2. reprogrammation des cellules par nucléofection - Jour 9

1. Pipeter les plasmides de reprogrammation dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile (tableau 1).
2. Mélanger la solution de nucléofection avec supplément (fourni par le fabricant) et la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile.
3. Introduire à la pipette 2 ml de moyen d'extension dans un puits d'une plaque 12 puits et la place dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O _2, 5% CO ₂ et 90% N ₂₎ pour atteindre l'équilibre avant l'ajout de cellules.
4. Recueillir leLavage des cellules cultivées et le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir les cellules restantes.
5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
6. Laver les cellules par remise en suspension dans 5 ml de DPBS et centrifugation à 300 xg pendant 5 min.
7. Aspirer le surnageant.
8. Reprendre le culot cellulaire dans 100 pi de solution de nucléofection + Supplément, en prenant soin d'éviter les bulles de production.
9. Introduire à la pipette la suspension cellulaire dans le tube contenant les plasmides de reprogrammation, pipette de haut en bas une fois, et la pipette l'échantillon dans le fond de la cuvette de nucléofection.
10. Placez la cuvette dans la machine de nucléofection et exécuter le programme T-019.
11. Transférer 100 ul de l'expansion préchauffé moyen (à partir de la plaque d'équilibrage à l'étape 2.3) dans la cuvette de nucléofection.
12. Recueillir immédiatement l'ensemble de l'échantillon et le dépôt dans le puits de préchauffé Moyen Foisonnement. Éviter de recueillir le, des débris flottants de cellules mortes blanc.
13. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O _2, 5% CO ₂ et 90% N ₂₎ pour la croissance.

3. Placage Feeder cellules - Jour 10 ou 11

1. Au jour 10, les cellules plaque d'alimentation.
   1. Revêtez un 6 et plaque de culture de tissu avec de la gélatine.
      1. Introduire à la pipette 1 m de gélatine à 0,1% en solution saline tamponnée de Hank (HBSS) dans chaque puits de la plaque.
      2. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur pendant au moins 5 min.
      3. Immédiatement avant utilisation, aspirer la solution de gélatine à partir de la plaque.
   2. Décongeler une fiole de 2 x 10 ⁶ fibroblastes embryonnaires de souris irradiées à 3000 cGy dans 10 ml d'préchauffé MEF Media (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + pénicilline / streptomycine (1%)).
   3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Reprendre les cellules dans 12 ml de MEF médias et pipette 2 ml inPour chaque puits de la plaque 6 puits revêtu de gélatine. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O _2, 5% CO ₂ et 90% N ₂₎ jusqu'au jour 12.

4. étalement des cellules sur des cellules nourricières et changement de support - Jour 12

1. Recueillir les cellules dans une nucleofected 15 ml tube conique et collecter toutes les cellules restantes par un lavage des puits avec 2 ml de QBSF-60. Centrifuger l'échantillon à 300 g pendant 5 min.
2. Préparer reprogrammation moyenne: Iscove modification de Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + non animale L-glutamine (1 mM) + non-acides aminés essentiels (NEAA, 1%) + pénicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoéthanol (0,1 mM) + le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, ajoutées à l'alimentation fraîche, 10 ng / ml) + acide ascorbique (frais ajoutés à l'alimentation, 50 pg / ml).
3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 12 ml de reprogrammation moyenne. Introduire à la pipette 2 ml par puits de la suspension de cellules dansla plaque à 6 puits de cellules nourricières (tel que préparé dans la section 3). Centrifuger la plaque à 50 xg pendant 30 min à température ambiante.
4. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O _2, 5% CO ₂ et 90% N ₂₎ pour la croissance. Changer la reprogrammation moyenne tous les deux jours jusqu'à ce que les colonies iPSC commencent à apparaître (1-2 semaines).
5. Préparer hESC moyenne: DMEM / F12 1: 1 + Knockout sérum de remplacement (20%) + pénicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + non animale L-glutamine (1 mM) + pyruvate de sodium (1%) + bicarbonate de sodium (0,12%) + β-mercaptoéthanol (0,1 mM) + bFGF (ajoutés à l'alimentation fraîche, 10 ng / ml)
6. Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l'alimentation fraîche, 100 M), de l'acide suberanilohydroxamic (SAHA, a ajouté à l'alimentation fraîche, 200 nM). Une fois colonies iPSC apparaissent, commencent à se nourrir les cellules avec des inhibiteurs de CSEh moyen + HDAC, le changement moyen chaque jour.
   REMARQUE: le butyrate de sodium est une petite molécule qui est adsorbé sur des tubes en plastique, therefore stocker dans un tube en verre de borosilicate à 4 ° C.

5. Les clones isolation iPSC

1. Une fois colonies iPSC sont assez grands pour être isolé (20-25 cellules), les prendre avec une pipette P20.
2. Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l'alimentation fraîche, 100 M), SAHA (ajoutée à l'alimentation fraîche, 200 nM)
3. Placez les colonies isolées sur iMEFs dans les différents boîtes de 35 mm contenant des inhibiteurs d'HDAC CSEh moyen + + Supplément Clonage & Recovery.
4. Le jour après la cueillette des colonies, changer de support de CSEh inhibiteurs HDAC moyen +.
5. Changer le support tous les jours jusqu'à ce que les colonies iPSC sont prêts pour des passages.
6. Retirer les inhibiteurs d'HDAC dans le milieu une fois colonies se stabilisent à passage 2-3.

Résultats

Trois jours après nucléofection et avant l'étalement des cellules sur nucleofected iMEFs, l'efficacité de nucléofection réussi doit être estimée par microscopie à fluorescence pour eGFP. La figure 1 représente une expérience typique de nucléofection à environ 5-10% de la population totale des cellules exprimant eGFP.

Colonies reprogrammées iPSC vont commencer à apparaître environ deux semaines après nucléofection. Les colonies sont généralement circulaire avec des frontières...

Discussion

Pour la réussite génération iPSC lors de l'utilisation de ce protocole, il ya plusieurs mises en garde importantes qui devraient être considérés. Au cours de la phase d'expansion des érythroblastes, le calendrier de changement de support doit être strictement suivie, que les écarts peuvent conduire à la stimulation inefficace de la population de cellules progénitrices cible et un rendement plus faible de génération iPSC. Il est important de faire de nouveaux milieu d'expansion avec la dexaméthasone frais à c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Conserver à 4 ° ;C. Chauffer à température ambiante avant utilisation.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Magasin à 4 ° ;C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Magasin à 4 ° ;C.
sérum fœtal bovin (FBS)	Life Technologies	10437028	Se conserve à -20 ° ; C jusqu’à ce que nécessaire. Décongeler, aliquoter, conserver à 4 °C.
sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Conserver à température ambiante.
QBSF-60 moyen sans sérum	Fisher Scientific	50-983-234	Conserver à 4 ° ;C.
pénicilline/streptomycine	Life Technologies	15140122	Stocker à 4 ° ;C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Stocker à 4 ° ;C.
Solution de gélatine à 2 %	Sigma-Aldrich	G1393	Conserver à 4 ° ; C, liquéfier en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.
Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Magasin à 4 ° ;C.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Magasin à 4 ° ;C.
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Magasin à 4 ° ;C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, congélation à -20 ° ;C.
acides aminés non essentiels (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Stocker à 4 ° ; C, à l’abri de la lumière.
DMEM/Ham’s F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Se conserve à 4 ° ;C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, congélation à -20 ° ;C.
pyruvate de sodium, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Stocker à 4 ° ;C.
bicarbonate de sodium, 7,5 %	Life Technologies	25080094	Stocker à 4 °C.
de croissance des fibroblastes de base (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Faire 10 mg/ml de stock dans DPBS, aliquote, congeler à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
Butyrate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Faire 2000x stock (400 mM) en DPBS, aliquote, geler à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
hES Clonage cellulaire & Supplément de récupération	Stemgent	01-0014-500	Conserver à -20 ° ; C jusqu’à ce que nécessaire. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
Matrigel BD BD	Biosciences	35-4277	Décongeler pendant la nuit sur la glace à 4 ° ; C, aliquote dans des tubes pré-refroidis à l’aide d’embouts de pipette pré-refroidis. Conserver à -20 ° ; C jusqu’à ce que nécessaire. Décongeler à 4 ° ; C, utiliser immédiatement.
StemSpan SFEM  ;	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, congélation à -20 ° ;C.
ascorbique, en poudre	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Produire 5 mg/ml de bouillon dans DPBS, filtre stérile, stocker à 4 °C.
facteur de cellules souches humaines recombinantes (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 &mu ; stock g/m en SFEM, aliquote, congélation à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
interleukine humaine recombinante 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 &mu ; g/ml stock en SFEM, aliquote, congeler à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
érythropoïétine (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Faire 1000 U/ml stock en SFEM, aliquote, congélation à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
facteur de croissance analogue à l’insuline humaine recombinante 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 &mu ; g/ml stock en SFEM, aliquote, congeler à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
&beta ;-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Produire 1000x stock (100 mM) en DPBS.
dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Faire 50x stock (50 &mu ; M) dans le DPBS, filtre stérile, stocker à 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Fabriquer 2 000x le stock (400 mM) dans DPBS, aliquote, congeler à -20 ° ;C. Une fois décongelé, conserver à 4 °C.
Plaque de culture tissulaire 12 puits	Fisher Scientific	08-772-29
Tube conique de 15 ml	Sarstedt	62553002
Tube Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Plaque de culture tissulaire 6 puits	Fisher Scientific	08-772-1B
Plaques de culture de tissu de 35 mm	BD Biosciences	353001
Pipettes sérologiques jetables de 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Pipettes sérologiques jetables de 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Pipettes sérologiques jetables de 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 &mu ; l pointes de pipette, pointes barrières	Genessee	24-404
verre Pipettes Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
aide à la pipette	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624