Article de méthode

Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines

DOI :

10.3791/52021

⸱

6 novembre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un test biologique robuste pour quantifier le taux relatif de protéolyse par le système ubiquitine-protéasome. La lecture du test est le taux de croissance de la levure en culture liquide, qui dépend des niveaux cellulaires d’une protéine rapporteure comprenant un signal de dégradation fusionné à un marqueur métabolique essentiel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un mécanisme majeur de la protéine de régulation de l'homéostasie dans tous les eucaryotes. L'approche standard pour déterminer la dégradation des protéines intracellulaires repose sur des tests biochimiques pour suivre la cinétique de la baisse de la protéine. Ces méthodes sont souvent laborieux et fastidieux et donc ne se prêtent pas à des expériences visant à évaluer plusieurs substrats et conditions de dégradation. Comme alternative, les dosages en fonction de la croissance de cellules ont été développés, qui sont, dans leur format classique, point final des analyses qui ne peuvent pas déterminer quantitativement les variations relatives des niveaux de protéines.

Nous décrivons ici une méthode qui détermine fidèlement l'évolution des taux de dégradation des protéines en les couplant à levure cinétique de croissance des cellules. La méthode est basée sur un système de sélection mis en place où l'uracile auxotrophic de URA3 Supprimé par les cellules de levure est sauvé par une protéine rapporteur exogène exprimée, Composé d'une fusion entre le gène URA3 et un déterminant essentiel de la dégradation (de degron). La protéine rapporteur est conçu de telle sorte que sa vitesse de synthèse est constant tandis que le taux de dégradation est déterminé par le degron. Comme la croissance de la cellule dans un milieu déficient en uracile est proportionnelle aux niveaux relatifs de Ura3, la cinétique de croissance dépendent entièrement de la dégradation de la protéine rapporteur.

Cette méthode permet de mesurer avec précision les changements dans la cinétique de dégradation intracellulaire des protéines. Il a été appliqué à: (a) L'évaluation de la contribution relative des facteurs de l'ubiquitine conjugaison connus à la protéolyse (b) E2 enzyme conjuguant structure-fonction des analyses (c) Identification et caractérisation de nouveaux degrons. Application du système à base de URA3 degron- dépasse le domaine de la dégradation des protéines, comme il peut également être adapté à la surveillance des changements de niveaux de protéines associées à d'autres fonctions des voies cellulaires.

Introduction

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Le système de dégradation ubiquitine-protéasome est un appareil de régulation principal, qui a été impliquée dans le maintien de l'homéostasie des protéines dans tous les eucaryotes. L'onduleur conjugue initialement plusieurs molécules d'ubiquitine à une protéine cible, après quoi la protéine de poly-ubiquitine marqué est dégradée par le protéasome 26S. Dans la plupart des cas, le taux étape pour l'ubiquitine médiation dégradation limitant est ubiquitylation substrat, médiée par la conjugaison d'enzymes E2 et E3 ligature enzymes (E3 ligases) 1. Par conséquent, la stabilité intracellulaire de protéines spécifiques reflète leur sensibilité à la conjugaison à l'ubiquitine et l'activité de leurs enzymes ubiquitylation apparentées.

Ligases E3 sont les principaux composants de reconnaissance de substrat de l'onduleur. En tant que tels, ces enzymes reconnaissent degrons au sein de leurs substrats qui sont absents ou ne sont pas exposés à leurs isotopes stables 2. Par exemple, de nombreux régulateurs du cycle cellulaire must être synthétisé et dégradé de façon spécifique dans le temps afin de maintenir la progression du cycle cellulaire dans l'ordre. La dégradation de ces protéines est souvent contrôlée par la phosphorylation médiée par les kinases régulées de signalisation cellulaire 3,4. D'autre part, les protéines aberrante-croisés sont reconnus par degrons cryptiques. Ce sont des régions qui sont normalement cachés dans la structure native et sont exposés à la structure perturbation. Ces degrons comprennent des domaines hydrophobes et 5-7 segments intrinsèquement désordonnées 8.

Depuis la découverte de la charnière, le système de l'ubiquitine de la dégradation des protéines et de la caractérisation des bases dans des lysats de réticulocytes 9, la génétique des levures a joué un rôle dans la découverte de plusieurs des composants du système 10 de l'ubiquitine. Le succès de la levure comme organisme modèle pour l'analyse systématique de la dégradation des protéines par l'onduleur est principalement dû au fait que l'onduleur est élevément conservé chez tous les eucaryotes 4, couplée à leur susceptibilité comme un système expérimental. En effet, les systèmes à base de levure sont couramment utilisés pour déchiffrer les mécanismes d'action de l'appareil d'ubiquitination.

L'étude de la dégradation des protéines par des moyens biochimiques nécessite généralement la préparation d'extraits cellulaires. Bien que les protéines de cellules animales peuvent être extraites dans des conditions relativement douces qui préservent les interactions et la fonction des protéines, la présence d'une paroi cellulaire robuste dans la levure 11 exige des conditions de perturbation considérablement plus sévères qui peuvent affecter la récupération des protéines. En effet, différentes procédures de rupture des cellules de levure varient considérablement dans leur capacité à récupérer les protéines intactes dans les montants qui représentent correctement leur abondance cellulaire relative. En outre imprécision est inhérente aux différentes méthodes utilisées pour déterminer les taux de protéines spécifiques de dégradation: expériences métaboliques base étiquetage-pulse-chase '' suivi par immunoprecipitation, pour isoler des protéines spécifiques 12, est souvent pas strictement quantitative. Ainsi, lorsque la dégradation des protéines est comparée par cette méthode, des précautions particulières doivent être prises dans l'interprétation des résultats. Pour contourner cet inconvénient, une solution de rechange cycloheximide (CHX) essai de chasse peut être utilisé 12. Dans cet essai, l'inhibiteur de la traduction est ajouté à des cultures de cellules et des variations temporelles du niveau d'état stable de protéines sont ensuite surveillés. Néanmoins, l'utilisation de CHX est limitée à des protéines relativement courte demi-vie (<90 min), que l'inhibition à long terme de la synthèse de protéine est cytotoxique. En particulier, à la fois des dosages mentionnés ci-dessus nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques de la protéine, qui ne sont pas toujours disponibles.

Pour surmonter ces limitations techniques, les chercheurs ont développé plusieurs approches qui ne nécessitent pas l'extraction de cellule et de la manipulation directe de la protéine. Une approche est basée sur la mise en place de oui auxotrophiquest souches, obtenues par la délétion des gènes codant pour des enzymes métaboliques essentielles. De tels gènes comprennent HIS3, LEU2, LYS2 et TRP1, codant pour des enzymes nécessaires à la biosynthèse d'acides aminés, ainsi que URA3 qui code pour l'OMP décarboxylase (Ura3), une enzyme essentielle de la biosynthèse de la pyrimidine ribonucléotide. Ura3 a été largement utilisé dans les études de dégradation des protéines. Dans ces essais, l'expression constitutive de Ura3 sauve la croissance des cellules dans un milieu de ura3 déficient en uracile 13. Par conséquent, la déstabilisation Ura3 par la fusion d'une degron peut diminuer la croissance des cellules sur milieu minimum dépourvu d'uracile. Cette méthode a été utilisée dans plusieurs études de dégradation des protéines, y compris l'identification des déterminants de la dégradation 5, E3 ligases 14 et facteurs ubiquitylation auxiliaire 15 et la découverte de nouveaux UPS degrons 16. Toutes ces méthodes employées croissance des cellules sur des plaques de gélose que l'essai de lecture. Cependant, le til critère de croissance (croissance positive / négative), tandis que robuste et efficace, est surtout qualitative et ne fournit pas d'information quantitative qui est important pour l'évaluation de la puissance d'un degron ou la contribution relative des différents facteurs de dégradation auxiliaires.

Nous avons donc mis au point et utilisé des vecteurs de levure et les méthodes de criblage permettant une analyse systématique et quantitative de la dégradation des protéines par le URA3 -degron système de fusion. Le protocole est basé sur un test-à-poignée facile qui mesure la cinétique de la croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (SLIG) et sur la génération de courbes de croissance standard. cinétique de croissance de la levure sont caractérisées par trois phases principales - le décalage, l'exponentielle (LOG) et la phase stationnaire. Le calcul de la cinétique de réplication de levure au cours de la phase logarithmique dans des conditions sélectives, qui est déterminée par les niveaux d'expression de la Ura3-degron, fournit une mesure quantitative non biaisée of dégradation des protéines. Ce procédé peut être appliqué à la mesure et la comparaison des taux de plusieurs substrats de l'onduleur de dégradation simultanément dans de multiples souches et dans diverses conditions.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Transformer des cellules de levure auxotrophes appropriés, tels que Try467 (tableau 2), avec un plasmide contenant (a) un URA3 -degron fusion et (b) un marqueur métabolique supplémentaire pour la sélection de plasmide et d'entretien.
    REMARQUE: Un exemple d'un plasmide approprié est YDpK-MET25p-DEG1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Ceci est un plasmide intégratif de levure contenant une protéine de fusion comprenant de DEG1 - un degron dérivé de la transcription de levure. mat2 facteur 17, épitope FLAG - pour la détection par immuno-empreinte, Vma12 - une protéine ER stables, et Ura3 15,18 (figure 3A). (Voir le tableau 3 pour les plasmides utilisés dans cette étude et pour d'autres exemples de plasmides appropriés.)
  2. Pour la sélection du plasmide et la maintenance, conserver les cellules dans des plaques d'agar sous un synthétique appropriée (SD) définis milieu dépourvu de marqueurs de sélection d'acides aminés 19 (Par exemple, DEG1-UV est choisi et maintenu sous SD-LYS milieu sélectif).
  3. Cultiver les cellules O / N à 30 ° C dans un milieu sélectif SD approprié pour le maintien du plasmide jusqu'à ce que la phase stationnaire est atteinte. Cultiver les cellules dans des tubes à essai ou dans une plaque à 96 puits, en fonction du nombre d'échantillons à analyser (section 2).

2. Préparation des cellules pour l'analyse

  1. Quand un petit nombre d'échantillons (N≤15) sont à doser, de diluer les cellules et remplacer le milieu comme suit:
    1. Diluer 50 pi de cellules à partir d'une culture O / N avec 150 pi de milieu SD par puits dans une plaque de 96 puits (fond clair). A noter, le premier échantillon est désigné comme milieu ne contient vide.
    2. Déterminer les OD 600 valeurs des échantillons dans la plaque de 96 puits en utilisant un lecteur de microplaques.
    3. Calculer le diamètre extérieur réel 600 dans chaque puits en multipliant la lecture DO 600 par le facteur de dilution (x4), à partir de which la valeur de la lecture à blanc est soustraite. Normaliser les valeurs obtenues en divisant par 0,55 pour obtenir une longueur de trajet de 1 cm calculée selon la loi de Beer-Lambert. Notez que cette valeur est constante en mesurant la DO600 de 200 ul de cellules dans une plaque à 96 puits standard.
    4. Calculer le volume exact nécessaire à l'obtention des cellules de levure à un montant équivalent à DO600 de 0,25 et le transférer dans un tube Eppendorf.
    5. Isoler les cellules à grande vitesse (12 000 xg) pendant 1 min.
    6. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu sélectif approprié (voir la section 3.1) pour obtenir DO600 de 0,25.
    7. Transférer 200 ul des souches dilué à un nouveau puits dans une plaque de 96 puits.
  2. Quand un grand nombre d'échantillons (N> 15) sont à tester, diluer les cellules et remplacer le milieu sans préalable mesure OD 600, comme suit:
    1. Transférer 10 ul de cellules stationnairesadulte O / N dans une plaque de 96 puits dans une nouvelle plaque de 96 puits contenant 190 pi (dilution 1:20) des milieux sélectifs appropriés (voir section 3.1).

3. cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (Gils)

  1. Les supports suivants sont pour des mesures de croissance à l'aide de la journaliste Ura3-degron:
    1. Pour les contrôles positifs de la croissance de la levure dans des conditions non restrictives, utilisation plasmide médias SD sélectif (voir section 1.2). Si aucune sélection de plasmide est requise, par exemple, lors de l'utilisation d'un plasmide intégratif comme DEG1 -UV, milieu SD contenant tous les acides aminés nécessaires (SD complète) peut être utilisé.
    2. Pour les échantillons expérimentaux mesure de la croissance dans des conditions restrictives, utilisez milieu SD-URA.
  2. Fixer un lecteur de microplaques multimode à:. Une température d'incubation de 30 ° C, OD 600 intervalles de mesure de 15 min, et un cycle d'orbite linéaire et agitation de 1 minute toutes les sept minutes
    NOTE: Ce double mode secousse a été optimisé pour obtenir une répartition homogène de cellules; Cependant, d'autres modes de secouer ou même sans agitation peuvent fonctionner aussi bien.
  3. Incuber les cellules à 30 ° C dans un lecteur de microplaques O / N ou jusqu'à ce que les cellules ont atteint la phase stationnaire (12 à 24 h).
  4. Exporter les données brutes dans un fichier tableur.
  5. Déterminer la cinétique de croissance de levure en utilisant MDTcalc, un logiciel personnalisé qui calcule le temps minimum (en h) pour les cellules de doubler la taille de leur population (Minimal Doublement du temps (MDT); pour plus de détails, voir la section 4).

4. Calcul de Minimal temps de doublement (MDT): Principes de l'algorithme MDTcalc

NOTE: Les principes de l'algorithme MDTcalc, en utilisant un échantillon représentatif de cellules de levure Try467 (tableau 2) cultivées dans des milieux complets SD, sont illustrés dans le Tableau 1 et la Figure 1, montrant une feuille de données et de croissance parcelles, respecment.

  1. Soustraire OD 600 valeurs à blanc, obtenu dans le puits respectif, à partir de chacune des valeurs obtenues dans le puits d'échantillon. Diviser les différences résultant par 0,55 (pour des plaques à 96 puits) pour corriger la longueur du trajet de la lumière. Tracer les valeurs finales (tableau 1, Trans.) Contre le temps pour produire la courbe de croissance de la levure réelle (DO600 / h) (figure 1A).
  2. Calculer log 2 (OD 600) pour chacune des valeurs transformées pour convertir la phase de croissance logarithmique dans une courbe linéaire (figure 1B).
  3. Calculer la pente d'un intervalle de 10 points dans le temps (N = 10) à partir de l'instant 0 et déplacement d'un point dans le temps à la fois jusqu'à ce que N <10 (tableau 1, la pente, la figure 1C).
  4. Calculer la valeur inverse de la pente de chaque obtenir le temps nécessaire pour que la population de cellules de doubler (tableau 1, 1 / pente, la figure 1C). Calculer le minimum1 / valeur de la pente pour déterminer le MDT (tableau 1, rectangle noir; figure 1C). Extrait MDT calculé pour les cellules de l'échantillon (tableau 1, 1 / pente, rectangle noir) de l'intervalle de temps choisi (tableau 1, délimitée par le rectangle rouge, les figures 1B, 1D).
    NOTE: Le taux de croissance des cellules sur milieu SD-URA est inversement proportionnelle à la MDT.

5. Utilisation MDTcalc

  1. Copiez les fichiers du programme complété dans un dossier désigné sur l'ordinateur.
  2. Assurez-vous que le fichier de feuille de calcul contenant les données de croissance est enregistré et fermé. Ouvrez le programme d'application MDTcalc pour voir le début apparaît.
    1. Insérez les informations nécessaires, comme le montre la figure 2:
      1. Sous "Chemin du fichier", cliquez sur le rectangle sur la droite pour localiser le fichier de feuille de calcul.
      2. Sous "Nom de la feuille», écrire le nom de la feuille de calcul où til est situé données brutes.
      3. Sous la rubrique «Position de départ», insérer la feuille de calcul de coordonnées de temps 0 du premier échantillon.
      4. Sous «colonne Time», insérer la lettre définissant l'emplacement de la colonne de point de temps (temps devrait être fournie en secondes).
      5. Sous «colonne vide», insérer la lettre définissant l'emplacement de la colonne vide (généralement, mais pas nécessairement dans le puits A1 de la plaque de 96 puits).
      6. Sous «valeur de DO ', choisissez l'transformé DO600 valeur minimale requise pour l'initiation de calcul MDT (généralement 0,15-0,25). La définition de cette valeur empêche les calculs de la PCT pour les cultures en phase de latence due à une dilution excessive de sorte que la PCT est calculée uniquement pour les échantillons qui atteignent la valeur DO 600 ou plus défini.
    2. Une fois la dernière valeur a été saisi, appuyez sur le bouton 'Calculer' au bas de l'écran. Assurez-vous que la barre de progression sur la droite se transforme progressivement en green. Ne pas ouvrir le fichier de feuille de calcul au cours du processus de calcul.
    3. Exportez les deux ensembles de données qui apparaissent automatiquement à l'écran à la fin du calcul MDT dans un tableur. Veiller à ce que les données comprennent: (a) la valeur MDT pour chaque bien qui passe le test de valeur de DO minimal (tel que défini à la section 5.2.1.6) et (b) le point de temps initial de l'intervalle à partir de laquelle le PCT a été calculé (Démarrer temps).

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Résultats

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Etude du rôle des enzymes de la voie Doa10 dans la dégradation d'un substrat reporter

Pour tester la validité de la méthode SLIG il a été comparé à un essai de dégradation traditionnel. Cette expérience évalue la contribution relative des composantes de l'ER-membrane localisée Doa10 E3 ligase complexe 20,21 à la dégradation du substrat rapporteur de contrôle de la qualité des protéines Deg1- VU (figure 3A). Le plasmide Deg1- VU a...

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Discussion

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Nous décrivons ici un essai basé sur la croissance des cellules pour déterminer le taux relatif de dégradation des protéines, appelée «cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives de (Gils). Le test Gils a plusieurs avantages: Il est simple à mettre en place, l'acquisition et l'analyse des données est simple et il est extrêmement modulaire. Par conséquent, Gils peut être appliquée simultanément à plusieurs échantillons dans un format de plaque conviviale multi-puits qui peut être ada...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Yuval Reiss et le Dr William Breuer d’avoir examiné le manuscrit de manière critique et Omri Alfassy d’avoir contribué au développement du test de dépistage Ura3-GFP. Nous remercions également le Dr M. Hochstrasser et le Dr R. Kulka pour les plasmides et les souches. Ce travail a été financé par l’Académie israélienne des sciences (subvention 786/08) et par la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël (subvention 2011253).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Base azotée de levure Difco sans acides aminés et sulfate d’ammoniumBD Biosciences233520Pour la croissance de levures sur des milieux minimaux SD.  ; Les acides aminés à fournir sont les suivants : Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Méthionine, Phénylalanine, Thréonine, Tryptophane Sulfate
d’ammoniumSigma - AldrichA4418
GlucoseSigma - Aldrich16325
AdénineSigma - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
Acides aminés Highest pureté disponible  ;
Plaques à 96 puitsNunc167008Toute autre marque compatible peut être utilisée
Cyclohexamide  ;Sigma - AldrichC7698Conc. de travail 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO seriesTecanPour l’incubation de levures et les mesures OD600. Tout autre lecteur compatible à température contrôlée peut être utilisé.
MDTcalcLogiciel expérimental

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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