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Article de méthode

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l'analyse de la différenciation hématopoïétique

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DOI :

10.3791/52022

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20 octobre 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Dans cet article

Résumé

La manipulation de l’expression temporelle des gènes dans les cellules souches embryonnaires (CSE) en différenciation peut être réalisée à l’aide de systèmes de gènes inductibles. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires est coûteuse et prend du temps. Ce protocole permet l’expression rapide d’un transgène dans la différenciation des cellules dérivées de l’ES et l’analyse ultérieure de la différenciation hématopoïétique en aval.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires (CSE) constituent un modèle exceptionnel pour élucider les mécanismes moléculaires de la différenciation cellulaire. Ils sont particulièrement utiles pour étudier le développement des cellules progénitrices hématopoïétiques précoces (HPC). L’expression des gènes dans les CSE peut être manipulée par plusieurs techniques qui permettent de déterminer le rôle des molécules individuelles dans le développement. L’une des difficultés est que l’expression de gènes spécifiques a souvent des effets phénotypiques différents en fonction de leur expression temporelle. Ce problème peut être contourné par la génération de CSE qui expriment inductiblement un gène d’intérêt à l’aide d’une technologie telle que le système de transgènes inductibles par la doxycycline. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires inductibles est coûteuse et prend du temps. La présente invention concerne une méthode permettant de désagréger des corps embryoïdes (EB) dérivés d’ESC en suspensions unicellulaires, en infectant rétroviralement les suspensions cellulaires, puis en reformant les EB par chute suspendue. La différenciation en aval est ensuite évaluée par cytométrie en flux. En utilisant ce protocole, il a été démontré que l’expression exogène d’un gène de microARN au début de la différenciation des ESC bloque la génération de HPC. Cependant, lorsqu’il est exprimé dans des cellules dérivées de l’EB après la production d’un mésoderme naissant, le gène microARN améliore la différenciation hématopoïétique. Cette méthode est utile pour étudier le rôle des gènes après la dérivation d’un tissu spécifique de la couche germinale.

Introduction

cellules souches embryonnaires murines (CSE) sont pluripotentes, restant indifférenciées et s’auto-renouvelant en présence de la cytokine Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)1. Lors de l’arrêt du FIL, ils se différencient spontanément en structures tridimensionnelles (3D) appelées corps embryoïdes (EB)2. L’architecture 3D permet le développement des trois couches germinales ectoderme, endoderme et mésoderme, qui donnent ensuite naissance à des tissus matures de types3. Les CSE constituent un modèle exceptionnel pour élucider les mécanismes moléculaires de la différenciation cellulaire, en particulier l’étude du développement des cellules progénitrices hématopoïétiques précoces (HPCs)4.

L’expression des gènes dans les CSE peut être manipulée par plusieurs techniques qui permettent de déterminer le rôle de molécules individuelles dans le développement. L’une des techniques les plus courantes consiste à utiliser la recombinaison homologue pour générer des lignées ESC, qui n’ont pas de gène d’intérêt5,6. Il existe également un certain nombre de techniques qui ont été utilisées pour surexprimer les gènes. La première technique utilisée pour modifier l’expression des gènes dans les CSE a été de les infecter avec des rétrovirus recombinants7,8. Le gène d’intérêt, cependant, est souvent réduit au silence lorsque les ESC se différencient en types de cellules progénitrices et matures. L’utilisation de lentivirus a permis de limiter le silençage des gènes exprimés viralement9. D’autres vecteurs viraux utilisés pour la surexpression comprennent l’adénovirus et le virus adéno-associé10. De plus, les techniques de transfection standard pour introduire de manière stable des plasmides d’expression sont largement utilisées pour l’expression du transgène ESC11. L’une des difficultés de ces systèmes est que l’expression d’un gène spécifique a souvent des effets différents en fonction de son expression temporelle. Par exemple, la protéine Smad1 affecte différemment le développement des cellules hématopoïétiques au cours des différentes étapes du développement de l’EB12,13.

Ce problème peut être contourné par la génération de CSE qui expriment induitement un gène d’intérêt. Le système le plus courant pour l’expression inductive des transgènes dans les CSE utilise l’opéron de résistance à la tétracycline d’E. Coli (Escherichia coli). Plusieurs systèmes tétracyclines différents ont été développés. L’une des stratégies les plus populaires a été développée par Kyba et ses collègues14. Ils ont généré une lignée ESC (Ainv15), dont le gène inverse du transactivateur de la tétracycline est inséré dans le locus ROSA26 constitutivement actif. Un élément de réponse à la tétracycline (TRE), un site LoxP en aval (locus de X-over P1 du bactériophage P1) et une cassette de néomycine sans promoteur ont été introduits dans le locus HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) sur le chromosome X. En utilisant une approche de recombinaison CRE, un gène d’intérêt accompagné d’un promoteur eucaryote pour piloter l’expression du gène de résistance à la néomycine peut être inséré dans le site LoxP. Les ESC correctement ciblés sont isolés par la sélection G418. Ces clones ciblés doivent ensuite être testés pour l’expression inductible du transgène par la doxycycline (ou la tétracycline). Cette approche a réussi à générer des raies ESC qui expriment de manière induite HoxB4, Stat5, SCL et Smad714-17. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires inductibles prend du temps. La présente invention concerne une méthode permettant de désagréger les corps embryoïdes (EB) dérivés de l’ESC en suspensions unicellulaires, d’infecter rétroviralement les suspensions cellulaires à différents jours de développement, puis de reformer les EB par chute suspendue. La différenciation en aval est ensuite évaluée par cytométrie en flux. Dans cet article, nous présentons un exemple de la façon dont l’expression des miARN dans les cellules dérivées de l’EB affecte la différenciation hématopoïétique. Cette méthode est utile pour étudier le rôle des gènes après la dérivation d’un tissu spécifique de la couche germinale.

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Protocole

1. embryoïdes corps (EB) Formation

  1. Gélatine adapter CES qui ont été maintenues sur des fibroblastes d'embryon de souris (MEF). CES Passage 3 fois sur 6 et la plaque de culture de tissus enduits de gélatine à 0,1% pour enlever MEF.
    1. Cultiver les cellules dans les médias d'entretien ESC avec FRV pour maintenir les cellules indifférenciées (tableau 1). Assurez-vous que les cellules ne dépassent jamais 80% de confluence. Utilisez passage bas (10 ou moins après la suppression de passages MEF) cellules de différenciation.
  2. A la veille de CES sont cultivées pour la différenciation EB, passage des cellules de sorte qu'ils seront environ 50-70% de confluence le lendemain. Continuer à cultiver des cellules dans le milieu de la maintenance ESC pour conserver la pluripotence cellulaire.
  3. Le jour de la différenciation, les médias de maintenance ESC aspiration et laver avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, et 11,9 mM de tampon phosphate, pH 7,4) dans chaque puits d'une plaque à 6 puits.
    1. Ajouter 200 ul de 0,25% trypsen / EDTA à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
    2. Inactiver la trypsine / EDTA avec 800 pi de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas dans une pipette sérologique de 2 ml avec une pointe de p200 de débâcle des cellules dans une suspension de cellules isolées. Assurez-vous que la pointe de p200 s'adapte parfaitement sur la fin si les médias ne vont pas entre la pipette et l'interface de pointe.
    3. Pipet haut et bas environ 5-10 fois. Prenez soin de ne pas créer des bulles au cours de la pipette.
  4. les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Amener le volume à 10 ml avec du PBS. Centrifuger à 315 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Retirer le surnageant. Laver deux fois avec 5 ml de PBS pour éliminer les restes de fluides contenant des FRV. Centrifugeuse à l'étape 1.4 pour chaque lavage.
    1. Remettre en suspension le culot cellulaire finale dans 2 ml de milieu de différenciation (tableau 2).
  6. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou cellulaire contre la plaque et 6,000-10,000 cellules / ml dans une plaque de 10 cm de Pétri(Culture non-tissu traité).
    1. Déterminer exactement les cellules / ml empiriquement pour chaque ligne ESC. Utilisez des boîtes de Pétri stériles normalement utilisés pour le travail des bactéries ou des plaques de faible adhérence.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats de différenciation, les ballasts électroniques doivent former des sphères qui restent en suspension sans fixer à la plaque. Testez plusieurs marques de plaques de trouver ceux qui ont le moins l'adhésion.
    2. Incuber les CES de différenciation dans une culture tissulaire C incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2.
Réactif Stock Concentration finale Volume Entreprise Numéro de catalogue
DMEM 1x 410 ml S IGMA / Aldrich D5796
FBS (ES blindé) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Acides aminés non essentiels 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutamine 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / streptomycine 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoéthanol 14,3 M 114 uM 4 pi Sigma / Aldrich M3148
Inhibition de la leucémie Factor (LIF) 10 7 unités / ml 1000 unités / ml 50 pi Millipore ESG1107
ontenu "> Tableau 1: ESC Maintenance médias.

Réactif Stock Concentration finale Volume Entreprise Numéro de catalogue
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (Projeté utilisateur de différenciation optimale) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Acides aminés non essentiels 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-glutamine 100x 1x 5 ml Vie Technologies 35050
Penncillin / streptomycine 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoéthanol 14,3 M 114 uM 4 pi Sigma / Aldrich M3148

Tableau 2: Différenciation des médias.

2. préparation de cellules EB pour infection par le virus

  1. Au stade de développement souhaité (entre les jours 2 et 3), transférer les ballasts électroniques de la boîte de 10 cm de Pétri à 15 ml tube conique. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et ajouter le lavage au tube conique.
  2. Pellet les EB à 315 g à la température ambiante pendant 5 min. Laver les cellules EB avec 5 ml de PBS.
  3. Ajouter 1 ml de solution de détachement cellulaire décongelée (protéolytique contenant des enzymes et collagénolytiques) et placer les tubes dans un bain d'eau à 37 ° (ou incubateur) pendant 30 min avec occagitation asional (agitation ou de lumière vortex).
  4. Ajouter 1 ml de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml avec une pointe p200 de la pipette. Placer le tube à 37 ° C bain d'eau à nouveau pendant 30 à 60 min.
  5. Centrifuger les cellules à 315 xg pendant 5 min et laver les cellules avec du PBS.

3. infection par le virus

  1. Remettre en suspension les cellules dans 1,5 ml de milieu de différenciation. Transférer la suspension cellulaire à un tissu non traité culture plaque à 6 puits.
  2. Préparer le retrovirus par des techniques classiques à l'avance. Ajouter 5 à 100 ul de surnageant viral dans des cellules en fonction de titre viral. Ne pas ajouter polybrene pour améliorer infection comme cela inhibe la réforme ultérieure de EB.
  3. Spinoculate les cellules avec le virus par centrifugation à 2120 xg pendant 90 min à température ambiante.

4. différenciation des cellules virales EB infectés dans les baisses suspendus

  1. Ajouter 2 ml de milieu de différenciation à chaque puits d'infected EB de suspension de cellules.
  2. Pipeter 3,5 ml de suspension cellulaire infectée EB dans un réservoir de réactif pour multipipettors stérile. Utilisez le multipipettor à pipeter 15-20 rangées de huit 20 pi gouttes sur le couvercle inversé de la plaque 15 cm de Pétri.
  3. Ajouter 10 ml de PBS stérile ou de l'eau à la partie inférieure de la plaque de Petri. Puis inverser le couvercle avec les gouttes et le lieu sur la plaque de Petri. Assurez-vous que les gouttes sont suspendus la tête en bas couvercle avec du PBS ou de l'eau ci-dessous pour garder la chambre humidifiée.
  4. Placez les plats à la 37 ° C tissu incubateur de culture avec 5,0% de CO 2.
  5. Après 2 jours, recueillir EB formés dans le rideau de gouttes d'inversion couvercle et lavage avec 4,5 ml de milieu de différenciation.
    1. médias de transfert et EBS pour une nouvelle culture de 10 cm non-tissu boîte de Pétri. Laver le couvercle une fois de plus avec 3 ml de milieu de différenciation et le transfert de la plaque de 10 cm.
  6. cellules de récolte pour l'analyse par cytométrie en flux après un total de 8culture jours à compter de la cession initiale de cellules sur un support de différenciation (-LIF).

5. cellules Préparation pour l'analyse cytomètre en flux

  1. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml avec une pipette de 10 ml. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et transférer dans le même tube conique.
  2. cellules de granules à 315 x g. Laver pastilles avec 10 ml de PBS.
  3. Ajouter 1 ml de solution décongelée de détachement cellulaire et placer les tubes dans un bain d'eau à 37 ° pendant 30 minutes avec agitation occasionnelle. Pour la détection de certains antigènes de surface des cellules, la trypsine peut être utilisé à la place.
  4. Ajouter 1 ml de milieu de différenciation et pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml. Utilisez une pointe de p200 à la fin de la pipette pour aider à briser-up digéré EB en suspension de cellules isolées.
    1. Placer le tube dans un bain d'eau à 37 C ° pendant encore 60 min pour que les protéines membranaires intégrales à recycler à la surface de la cellule.
  5. Pellet cellules à 315 g pendant 5 min.
  6. Laver les cellules wie 0,1% de sérum albumine bovine fraction V (BSA) préparé dans du PBS (PBS / BSA) et incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence spécifique.

6 Analyse des flux cytométrie de progéniteurs hématopoïétiques

  1. Placer 10 6 cellules EB dérivés dans 5 ml de 12 x 75 mm tube rond en bas. Pour régler cytomètre en flux réglages de compensation, utiliser des billes de rémunération selon les instructions du fabricant.
  2. cellules de granules à 315 x g. Verser le surnageant et remettre le culot en solution résiduelle PBS / BSA dans le tube.
  3. Pour la détection de l'ESC CAH, incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence: anti-souris CD41-PE (R-phycoérythrine) et anti-CD117 de souris (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanine Cyanine 7).
    1. Diluer anticorps 1: 100 dans du PBS / BSA. Ajouter 100 ul d'anticorps dilué dans chaque échantillon. Déterminer la dilution correcte des anticorps pour chaque fournisseur, clone, et beaucoup ou anticorps. Déterminer la dilution optimale pour le marquage de cellules individuellement.
  4. Incuber des échantillons sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min.
  5. Ajouter 2 ml de cellules PBS / BSA et granulés à 315 g pendant 5 min.
  6. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 300 pi de PBS ou un autre tampon isotonique.
  7. Filtrer les remises en suspension des cellules à travers un bouchon de crépine de cellule (0,35 M) pour enlever les grands agrégats de cellules.
  8. Analyser les cellules sur un cytomètre de flux.

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Résultats

Dans ces études gélatinisées VR4 (dérivée de la souche de souris 129X1 / SvJ) CES ont été utilisés. EB ont été isolés à 3 jours de différenciation. Pour obtenir les meilleurs résultats EBS doivent être sphériques et non-adhérente (Figure 1A, B). Après spinoculation avec le virus co-exprimant la GFP marqueur fluorescent avec un gène d'intérêt, EB ont été reformé par la méthode de la goutte pendante. EB ont été réformés avec succès à partir de suspensions cellulaires préparées à partir de 2.0, 2.5 et 3,0 ...

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Discussion

Comme discuté ci-dessus, les clones qui expriment de manière inductible ESC un gène d'intérêt peuvent être générés en utilisant des systèmes de doxycycline, toutefois, la production de ces lignes est de temps et de main-d'oeuvre. Décrite dans ce protocole est une méthode pour exprimer un gène d'intérêt dans la suspension cellulaire unique préparé à partir ESC dérivé EB. Ces cellules infectées sont ensuite réformé en EB en goutte suspendue pour examiner la différenciation ultérieure. Dans l'exemple

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par un projet pilote et des subventions de faisabilité du Centre de la faculté de médecine de l’Université de l’Indiana (IUSM) pour l’excellence en hématologie moléculaire (NIDDK, 5P30DK090948). Un financement supplémentaire a été fourni par une subvention d’amélioration biomédicale de l’IUSM. Nous tenons à remercier le Dr Karen Cowden Dahl pour ses commentaires sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMSigma/AldrichD5796
β ;-mercaptoéthanolSigma/AldrichM3148
FBS (ES Screened)HycloneSH30070.03E
FBS (Defined)HycloneSH30070.03
Non-essential Amino AcidsLife Technologies11140
L-GlutamineLife Life Technologies35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Trypsine/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Trypsine/EDTALife Technologies25200
Falcon Plaques de culture tissulaire 6- puitsFisher Scientific08-772-1B
Falcon Plaques non traitées 6 puitsFisher Scientific08-772-49
Boîte de Pétri Faucon 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Boîte de Pétri Faucon 15 cmFisher Scientific08-757-148
Tube Faucon 5 mlFisher Scientific14-959-11A
Tube Faucon 5 ml avec capuchon de filtre cellulaireFisher Scientific08-771-23
Réservoirs stériles blancsU.S.A. Scientific111-0700
Rat anti-souris CD41 PE-conjuguéBiolegend133906
Rat anti-souris CD117 APC/CY7-conjuguéBiolegend105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418

Références

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