L'analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Résumé

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

Résumé

Lésion cérébrale ischémique est parmi les affections les plus courantes et les plus dévastatrices de compromettre le bon fonctionnement du cerveau et conduit à la persistance des déficits fonctionnels chez les patients atteints souvent. Malgré les efforts de recherche intensifs, il n'y a toujours pas de traitement efficace disponible qui réduit une lésion neuronale et protège les neurones dans les zones ischémiques du secondaire mort retardée. La recherche dans ce domaine implique généralement l'utilisation de modèles animaux élaborés et problématiques. Cultures organotypique Entorhino-hippocampique contestées par manque d'oxygène et de glucose (OGD) sont établis dans des modèles in vitro qui imitent l'ischémie cérébrale. Le nouvel aspect de cette étude est que les modifications des vaisseaux sanguins du cerveau sont étudiés, en plus de modifications neuronales et la réaction à la fois le compartiment et le compartiment neuronal vasculaire peut être comparée et corrélée. Les méthodes présentées dans ce protocole d'élargir considérablement les applications potentielles de la ouganotypic approche de la culture de la tranche. L'induction de l'hypoxie ou OGD seul peut être appliquée par des moyens relativement simples dans des cultures de tranches organotypiques et entraîne des dommages fiable et reproductible dans le tissu neural. Ceci est en contraste frappant avec les expériences sur les animaux complexes et problématiques induisant accident vasculaire cérébral et ischémie in vivo. En élargissant l'analyse pour inclure l'étude de la réaction du système vasculaire pourrait fournir de nouveaux moyens sur la façon de préserver et de restaurer les fonctions cérébrales. L'approche de la culture de la tranche présentée ici pourrait se développer en un outil intéressant et important pour l'étude des lésions cérébrales ischémiques et pourrait être utile pour tester des mesures thérapeutiques potentielles visant à la neuroprotection.

Introduction

Le système nerveux central est particulièrement sensible à une perte ou une réduction de l'oxygène et de glucose alimentation par le système vasculaire. Même une assez courte interruption de l'approvisionnement en sang au cerveau peut provoquer une perte permanente de la fonction des zones du cerveau concernées mènent aux syndromes de temps typiques. En plus de la perte neuronale dans les zones touchées primaires, il existe généralement une perte neuronale retardée supplémentaire à travers des dommages secondaires. Malheureusement, jusqu'à présent, aucun traitement neuroprotecteur pour la réduction de la mort neuronale secondaire était disponible ^1. Les efforts de recherche pour étudier les mécanismes de dommages secondaires reposent sur ​​l'utilisation de modèles animaux d'ischémie cérébrale comme l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et diverses techniques d'occlusion thrombotique (pour une revue récente, voir ^2). En parallèle, également en raison de limitations d'ordre éthique avec l'utilisation de modèles animaux, la culture organotypique de divers tissus du système nerveux central ont été utilisés qui permettent à l'étudy de réactions neuronales à différents types de blessures ^3-5.

Pour l'étude de la réaction neuronale dans des conditions qui imitent les lésions cérébrales ischémiques, le système de modèle de privation d'oxygène et de glucose (OGD) a été développé. Dans ce modèle, les cultures de tranches sont temporairement exposées à un milieu dépourvu de glucose et a été équilibrée avec de l'azote gazeux en l'absence d'oxygène. Avec un tel traitement, il est possible d'induire une lésion neuronale et la perte qui est assez similaire à celui observé après une lésion ischémique in vivo ^{6, 7.} Dans l'hippocampe, ce traitement induit une perte neuronale dans CA1 spécifiquement, mais pas dans l' région CA3 ou le gyrus denté de l'hippocampe. En revanche, l'étude des réactions vasculaires dans des cultures de tranches jusqu'à présent n'a pas été largement engagé. Une raison évidente est l'absence de circulation et de perfusion vaisseau sanguin dans le modèle de culture de la tranche. Cependant, nous avons montré précédemment qu'il est possible de maintenir bvaisseaux Lood du SNC tranche cultures pendant plusieurs jours ^{8, 9.}

L'objectif global de cette méthode est de surveiller non seulement le sort des neurones après les autres ministères mais étendre l'étude sur le sort et le remodelage du système vasculaire qui est une partie importante de la réponse de blessure. Jusqu'à présent, de telles études ont nécessité l'utilisation de l'expérimentation animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Dans le protocole présenté ici, nous allons détailler la façon dont ces études peut être fait dans les cultures organotypique entorhino-hippocampique attaqué ni à l'hypoxie ou par des lésions excitotoxiques suivie d'une analyse des deux réactions de survie et des vaisseaux sanguins neuronales. Ce protocole est basé sur une étude publiée précédemment sur ​​ce sujet ¹⁰ et peut être utile pour tout laboratoire s'intéresse aux interactions neurovasculaires dans le SNC.

Protocole

Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive du Conseil Communautés européennes du 22 Septembre 2010 (2010/63 / UE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses.

1 Mise en place de cultures organotypique Entorhino-hippocampiques

1. Préparer organotypiques cultures tranche de entorhino-hippocampique (de EHOSCs) de chiots jour 4 (P4) de souris postnatales utilisant la méthode statique d'incubation ^4,11. Ici, utiliser des souris C57BL6 et CB6F1.
   1. Prenez environ 30 minutes par chiot de la souris pour la préparation des cultures de tranche, soit 3 h pour une portée de 6 chiots de souris. Effectuer toutes les mesures dans des conditions stériles dans un plan de travail à flux laminaire avec des instruments chirurgicaux stérilisés.
   2. Afin d'éviter une interférence possible de la position de la tranche le long de l'axe septo-temporelle, en utilisant uniquement de l'hippocampe des tranches de la moitié du septum. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à la température ambiante.
2. Coupez til la tête d'un chiot P4 de la souris avec des ciseaux chirurgicaux. Aucune anesthésie n'est nécessaire pour cette étape.
   1. Retirez le crâne autour du cerveau et identifier la fissure entre l'extrémité caudale des hémisphères cérébraux et le mésencéphale. Retirez délicatement la partie de la rostrale du cerveau pour le mésencéphale du crâne et de le placer dans le milieu de la préparation glacée composé de MEM complété avec une forme stabilisée de L-glutamine.
3. Poursuivre la dissection sous un stéréomicroscope avec le cerveau étant immergé dans le milieu de préparation à froid de glace. Retirer méninges restantes des hémisphères corticaux. Identifier l'hippocampe à la surface caudale interne de l'hémisphère et le séparer avec le cortex entorhinal adjacent du reste du cerveau.
   1. Transférer le tissu à un broyeur de tissus et de coupe de 400 pm d'épaisseur des tranches dans des conditions aseptiques transversal à l'axe septo-temporal de l'hippocampe.
4. Placer les tranches sur CEinserts de culture ll (environ 6 tranches par plaquette) et les incuber dans des plaques 6 puits avec 1 ml par puits de milieu d'incubation (47 ml de MEM, 25 ml de milieu Eagle, 25 ml de sérum de cheval, 1 ml glutamax I, 1 ml d'une solution stérile à 10% de glucose, pH 7,3) dans une atmosphère humidifiée avec 5% _de CO2 à 37 ° C. Changer le support le lendemain, puis tous les deux jours jusqu'à 1 semaine.

2 In Vitro L'hypoxie et l'oxygène-glucose privation de reperfusion

1. Voir le tableau 1 pour un échéancier précis de la procédure. EHOSCs de culture pendant 5 jours (DIV5) avant l'exposition à l'hypoxie ou d'autres ministères. A ce point de temps de changer de support de milieu d'incubation contenant du sérum de cheval à 25% de milieu sans sérum avec la composition suivante: milieu Neurobasal avec supplément de 2% de B27, 1% de glutamax supplémentaire et 0,1% de glucose.
2. Préparer le milieu d'autres ministères comme indiqué dans la référence 7 .Les concentrations finales des composants sera la suivante: 0,3mM CaCl _2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM NaHCO _3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 2 mM MgSO _4, et 10 mM de saccharose à pH 6,8. Ajouter 1 ml de milieu AM à chaque puits de deux plaques de culture tissulaire à 6 puits.
   1. Perfuser le milieu AMG avec N ₂ pendant 1 heure dans une chambre d'hypoxie et puis sceller et garder O / N dans un incubateur à 37 ° C.
   2. Utiliser des bandes anaérobies comme indicateurs hypoxiques. Pensez aux médias d'être l'oxygène libre lorsque la couleur des bandes a changé du rose au blanc.
   3. Pour l'induction de l'hypoxie, utiliser un milieu sans sérum de glucose au lieu de milieu des autres ministères. Avant utilisation, le milieu de perfuser N ₂ dans une chambre à l'hypoxie tel que décrit ci-dessus pour le milieu OGD.
3. Avant que les tranches sont exposées à la OGD, perfuser le milieu OGD nouveau avec _N2 pendant 30 min. Ajouter 2 ul de 1 mg / ml d'iodure de propidium (PI) solution par puits (pour une concentration finale de 2 pg / ml) pour les tranches pendant 30 minutes et sélectionnerseulement tranches saines pour l'expérimentation comme indiqué par un faible nombre de cellules positives PI.
4. Utilisez le calendrier de l'exposition des autres ministères et la reperfusion indiqué à la figure 1. Priver tranches de soit que l'oxygène (hypoxie) ou de l'oxygène et du glucose (OGD) pendant 15 min.
   1. Pour l'induction de l'hypoxie ou d'autres ministères, transférer tranches dans le milieu des autres ministères et garder pendant 15 min dans la chambre de l'hypoxie. Assurez-vous que tous les fluides qui restent sur les côtés de l'insert sont aspirés loin lorsque les cultures sont passés du milieu régulier à moyen OGD et le dos.
   2. Après l'hypoxie ou d'autres ministères, remplacer le milieu AMG avec un milieu exempt de sérum oxygéné et cultures sont autorisés à récupérer pour 3, 24 ou 48 heures dans un milieu sans sérum dans l'incubateur régulière à 37 ° C avec 5% de CO _2. Ajouter PI nouveau avant la fixation de la détermination de la mort cellulaire.

3. traitements pharmacologiques de Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

1. CulturEHOSCs e pendant 5 jours (DIV5) dans du milieu d'incubation avant l'exposition à des traitements pharmacologiques. Lancer traitements pharmacologiques, soit pendant ou immédiatement après l'OGD OGD quand les tranches sont transférées dans un milieu sans sérum.
2. Les traitements pour la protection des autres ministères.
   1. Ajouter 100 uM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) ou 1 uM de tétrodotoxine (TTX) au milieu de culture au cours de l'induction OGD (pendant 15 min) ou immédiatement après l'induction AM pendant 30 min. Ensuite, incuber dans normoxique milieu sans sérum pendant 48 heures avant fixation.
3. Traitements pour l'induction de la mort excitotoxique.
   1. Après 5 jours d'incubation de cultures de commutation de milieu de milieu sans sérum contenant 100 uM (RS) -α-amino-3-5-méthyl-4-hydroxy-isoxazolepropionique (AMPA) pendant 30 min.
   2. Retirez le milieu de culture contenant AMPA par aspiration (prendre soin d'enlever tout moyen résiduel sur inserts), puis transférer les tranches de nouvelles plaques avec un milieu exempt de sérum normal etles garder pendant 48 heures jusqu'à ce que la fixation.

4. fixation et Immunocoloration Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

1. L'iodure de propidium (PI) coloration.
   1. Ajouter PI pendant 30 minutes dans le milieu de culture de tranches vivant à une concentration de 2 ug / ml. Voir cultures vivantes avec un microscope inversé équipé d'une optique de fluorescence et sélectionnez tranches pour d'autres traitements. Pour la coloration PI en combinaison avec l'immunohistochimie, ajouter une solution de PI 30 min avant la fixation des cultures.
2. Fixation des tranches.
   1. Retirer le milieu de culture à partir de la plaque à 6 puits et ajouter 3 ml fraîchement préparée de 4% de paraformaldehyde (PFA) à chaque puits. Ensuite, placez la plaque de 6 puits dans un réfrigérateur et fixer O / N à 4 ° C.
   2. Retirer la solution de PFA le jour suivant et se laver les tranches 3-4 fois avec du tampon phosphate salin (PBS).
3. L'élimination des tranches à partir de la culture de la cellule insert et procédure de blocage pour l'immunohistochimie de sections flottantes.
   1. Détacher délicatement et retirez les tranches des inserts de culture en utilisant une peinture art pinceau de la taille 0 ou moins. Transférer chaque tranche individuelle dans un puits d'une plaque de 96 puits rempli de tampon de blocage (PBS avec 3% de sérum normal de chèvre (NGS) et 2% de Triton-X100). Conserver les tranches dans le tampon de blocage pendant 2 h à température ambiante sous agitation constante par un agitateur orbital.
4. Immunocoloration des cultures tranche
   1. Pour le marquage des vaisseaux sanguins utilisent anti-laminine polyclonaux à une dilution de 1: 200 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100.
   2. Pour les neurones d'étiquetage utilisent anti-protéine 2 associée aux microtubules (MAP 2) à une dilution de 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100.
   3. Incuber les tranches avec des anticorps primaires pendant 48 heures à 4 ° C avec agitation constante. Après la période d'incubation, les laver dans du PBS avec 0,5% de Triton-X100 à 4.3 fois.
   4. Anticorps secondaires Diluer 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100. Incuber les tranches pendant 2 heures à la température ambiante dans l'obscurité avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa fluorophores. Utilisez le chèvre anti-lapin approprié ou anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à Alexa 350 ou 488.
   5. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les tranches à trois reprises avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS); monter sur des lames de verre et lamelle les diapositives avec Mowiol.
5. Microscopie des coupes colorées
6. Voir les coupes colorées soit sur un microscope standard avec un équipement à épifluorescence ou avec un microscope confocal. Prenez des photos avec un appareil photo approprié. Pour certaines images, inverser le contraste de fluorescence afin de produire des navires sombre colorées sur un fond lumineux (figures 5 et 6).

5 Détermination de la densité du navire régional dans les cultures

1. Quantifier la vessel densité basé sur les passages de navires comme décrit dans la référence 8.
2. Utilisez coupes colorées pour la laminine pour ces mesures. Superposer les images enregistrées de grossissement de 10X avec une grille 6 x 6, où chaque grille est égale à 100 x 100 um par mètre carré, champ total de 0,25 mm ^2.
3. Superposer trois de ces réseaux dans la région CA1, CA3, DG, et CE (figure 2). Comptez le nombre de navires traversant les lignes de la grille.
4. Pour obtenir des résultats avec un bon niveau de pertinence statistique, effectuer des mesures dans au moins trois expériences indépendantes, chacune comprenant des données à partir de 3 souriceaux avec 3 tranches par chiot de la souris.
5. Déterminer la valeur moyenne de passages de navires dans les grilles de chaque région et d'effectuer une analyse statistique par ANOVA avec correction de Bonferroni comme test post hoc (p <0,05 défini comme significatif) en utilisant un logiciel de statistique appropriée.

Résultats

Privation d'oxygène et de glucose hypoxie induisent la mort neuronale et de la réduction d'un vaisseau sanguin en particulier dans la région CA1 de l'hippocampe.
OGD ou la privation de l'oxygène seul pendant 15 min ont induit une forte induction de la mort cellulaire comme on le voit par l'iodure de propidium en particulier dans la zone CA1 de l'hippocampe (figure 3) similaire à celle décrite précédemment ^7. Avec les marqueurs de visualiser le réseau de vaisseaux sanguins, on a ...

Discussion

Avec les méthodes présentées ici, les cultures organotypiques d'hippocampe de tranche peuvent être utilisés comme un outil polyvalent pour étudier les changements en matière plastique dans le tissu neuronal après une blessure. Bien que les cultures de tranches organotypiques ont été utilisés dans le passé pour l'étude de réactions neuronales après une ischémie ^{de 6, 7,} du nouvel aspect de l'étude simultanée de changements vasculaires améliore considérablement les applications possibles de ce procé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu essentiel minimum MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	forme stabilisée de L-glutamine
Inserts de culture cellulaire Millicell	Millipore	PICM03050
Milieu basal Eagle  ;	Gibco	41010-026
Sérum de cheval	Gibco	26050-088
Milieu neurobasal	Gibco	21103-049
Supplément de B27	Gibco	17504-044
Bandelettes anaérobies	Sigma-Aldrich	59886
Solution d’iodure de propidium	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R& D systems	0169-10
CNQX	R& D systems	0190/10
TTX	R& D systems	1078/1
polyclonal anti-laminine	Sigma-Aldrich	L9393  ;
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-souris 350	Sondes moléculaires	A11045
Alexa anti-souris 488	Sondes moléculaires	A11001
Alexa anti-lapin 350	Sondes moléculaires	A11046
Alexa anti-lapin 488	Sondes moléculaires	A11008
Logiciel de statistiques	Logiciel GraphPad	GraphPad Prism
McIlwain hachoir à tissus	Ted Pella	10180
Chambre d’hypoxie	Billups-Rothenberg	MIC-101