Ce protocole implique des procédures détaillées pour l’isolement des cellules dérivées de l’urine de patients atteints de dystrophie musculaire ; leur reprogrammation efficace et rapide par transduction du virus Sendai.
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Article de méthode
Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l'urine cellules dérivées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cardiomyopathie dystrophique est une conséquence mal compris de la dystrophie musculaire. Générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP) provenant de patients atteints de dystrophie musculaire est une source précieuse cellulaire pour des systèmes de modèles in vitro de la maladie à l'intérieur et peut être utilisé pour des études de criblage de médicaments. Les cellules d'urine provenant de patients ont été utilisés dans une reprogrammation réussie dans les cellules souches pluripotentes induites afin de modéliser une cardiomyopathie dystrophique. Répondre aux préoccupations de l'intégration des systèmes de vecteurs de sécurité, nous présentons un protocole utilisant un vecteur de virus Sendai non-intégration pour la transduction de Yamanaka facteurs dans les cellules d'urine prélevés chez des patients atteints de dystrophie musculaire. Ce protocole génère entièrement reprogrammé clones dans les 2-3 semaines. Les cellules pluripotentes sont indemne de vecteurs par passage-13. Ces CSPi dystrophiques peuvent être différenciées en cardiomyocytes et utilisés soit pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour le dépistage de la drogue.
Introduction
La cardiomyopathie est la deuxième principale cause de décès chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (MD). Bien que des mutations dans le gène de la dystrophine liée à l'X se produisent dans une: 3500 naissances masculines, on sait très peu sur les événements moléculaires et cellulaires conduisant à une dégradation progressive du muscle cardiaque. cellules souches pluripotentes humaines induites provenant de patients atteints de dystrophie musculaire ont émergé comme un nouvel outil pour étudier les mécanismes de la maladie sous-jacents et à utiliser pour le dépistage de drogues 1,2.
Le malaise prévue de biopsies de la peau ou des échantillons de sang peut dissuader les jeunes patients et / ou leurs tuteurs de donner son consentement pour la participation à l'étude. Les échantillons d'urine sont une source non invasive de cellules somatiques qui sont amendable des procédés de reprogrammation. Nous avons récemment montré que les cellules d'urine prélevés de patients atteints de dystrophie musculaire peuvent être cultivées et efficacement reprogrammé en utilisant CSPi transduction rétrovirale avec les facteurs Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, et c-Myc; OSKM) 1. L'inconvénient de délivrance de gène rétroviral est l'intégration aléatoire de gènes de reprogrammation dans les chromosomes de l'hôte. Pour surmonter cette limitation, nous avons utilisé le virus Sendai non-intégration pour la reprogrammation des cellules d'urine.
Ce protocole détaille le virus Sendai reprogrammation des cellules isolées urine de patients atteints de dystrophie musculaire qui peut ensuite être différenciées en cardiomyocytes ou d'autres types de cellules pour une étude plus approfondie. Ce protocole peut également être adapté à d'autres maladies spécifiques des patients.
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Protocole
NOTE: Les patients et / ou leurs tuteurs doivent donner un consentement éclairé à participer à un Institutional Review Board étude approuvée.
1. Tampons et préparations des médias
- tampon de lavage: Pour préparer 100 ml de tampon de lavage, ajouter 1 ml de stylo 100x / Solution streptococcique (100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine) à 99 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Progenitor urinaire cellulaire (UPC) Medium: Pour préparer le milieu UPC, mélanger des volumes égaux de kératinocytes Free Serum (KSF) Medium + de cellules souches moyen.
- KSF Medium: Pour préparer le milieu de kératinocytes, ajouter 5 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 50 ng / ml d'extrait pituitaire bovin (BPE), 30 ng / ml de toxine cholérique, et la solution pen / strep (100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) à 500 ml de milieu KSF.
- Moyen de cellules souches: Ajouter trois quarts de DMEM avec un quart des médias Ham-F12 et de compléter avec 10% de FBS, 0,4 pg / ml hydrocortisone, 0,1nM toxine du choléra, 5 ng / ml d'insuline, 1,8 x 10 -4 M d'adénine, 5 ug / ml de transferrine, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml d'EGF, et pen / strep solution.
- hES moyenne: 20% Ajouter remplacement KO-sérum (M-SR), 1x MEM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 100 uM de β-mercaptoéthanol, 20 ng / ml de bFGF et pen / strep à 400 ml de DMEM / F12.
2. Prélèvement d'échantillons d'urine
- Demander aux patients de boire des liquides 30 min avant la collecte d'urine pour se assurer qu'une quantité adéquate (~ 30-40 ml) d'urine peut être collectée.
- Donner aux patients et / ou leurs tuteurs un kit de collecte d'urine contenant les éléments suivants: (1) des instructions écrites sur la façon d'obtenir l'échantillon captures d'urine stérile ou propre, (2) toilettes anti-bactériennes humides, et (3) un 100 ml stérile collecte de spécimens tasse. Demander aux patients pour recueillir l'échantillon.
- Placer immédiatement les échantillons d'urine sur la glace et transfert à l'laboraTory dans une glacière. Traiter l'urine pour l'isolement cellulaire immédiatement. Si un retard est inévitable, stocker les échantillons sur la glace jusqu'à 4 heures avec une perte minimale de la viabilité cellulaire.
3. Isolement et expansion des cellules d'urine
REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2.
- L'aide de pipettes stériles, les échantillons d'urine pour le transfert stériles tubes de centrifugation de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant laissant 1 ml dans le tube; attention à ne pas perturber le culot cellulaire.
- Remettre en suspension et de combiner les pellets à partir de tubes multiples dans 7 ml de tampon de lavage et répéter centrifugation à 400 g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer soigneusement le surnageant, en laissant le culot de cellules et de ~ 0,2 à 0,5 ml de surnageant. Remettre en suspension dans 2-3 ml de Progenitor urinaire cellulaire (UPC) à moyen et à transférer la suspension dans 4-6 puits d'une nonplaque de 24 puits revêtue.
- Après 72 h, compléter la culture avec 0,5 ml de milieu frais UPC par puits et changer moyenne tous les 2-3 jours après. Les érythrocytes et des cellules squameuses qui ne se attachent pas à la plaque seront enlevés avec les moyennes changements.
- Surveiller la culture après 4-6 jours.
Remarque: Les petits 2-4 colonies de cellules vont commencer à apparaître. Les cellules seront arrondies ou allongées qui représentent de type I ou II de l'épithélium rénal (RE) des cellules respectivement 3. - Changer le support tous les 2-3 jours car une fois les cellules apparaissent, ils seront soumis à une phase d'expansion rapide.
- Une fois que les cellules atteignent 80-90% de confluence, autour de 9-15 jours après placage, et le passage dissocier les cellules (15,000-18,000 cellules / cm 2) sur 2-4 puits de plaque à 24 puits pour poursuivre son expansion. Marquer comme ce passage d'une cellule (P1).
- Caractériser les cellules d'urine pour les spécifications de la lignée à travers l'analyse de cytométrie en flux, immunohistochemcoloration ical ou par réaction en chaîne de polymérase-transcriptase inverse (RT-PCR).
- Reprogrammer des cellules isolées d'urine (section 4) ou congelez-les dans un milieu de congélation (DMEM complété avec 10% de sérum et 10% de DMSO) pour cryoconservation à long terme.
4. urine cellulaire Reprogrammation Utilisation Sendai Virus
NOTE: La manipulation et l'utilisation des EPI (équipements de protection individuelle) est recommandée lors de la manipulation des agents de transfection. Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2. L'élimination appropriée des transfection de cellules de l'agent et / ou transfectées est recommandé d'éviter tout risque de risques environnementaux et sanitaires. Pour l'urine cellules reprogrammation, utiliser une reprogrammation Kit Sendai avec des modifications du protocole d'alimentation dépendant du fabricant tel que détaillé ci-dessous.
- Pour assurer la reprogrammation de haute efficacité utilisant le virus Sendai, l'utilisation des passages 1-5 de cellules d'urine qui sont rapideLy divisant. Si les cellules ne se répliquent pas bien ou deviennent sénescentes, jetez-les car ils ne seront pas reprogrammer efficacement.
- Seed 60 000 cellules par puits dans deux puits d'une plaque à 6 puits. Marquer ce que la Journée -2. Régler la densité d'ensemencement des cellules (5 x oct 4 à 9 x 10 4 cellules par puits) comme nécessaire pour atteindre 80 à 90% de confluence au jour 0.
- Le jour 0 (48 h après étalement des cellules), préparer les vecteurs de reprogrammation Sendai (DVE) contenant chacun des quatre facteurs de OSKM. Ajouter chacun des vecteurs à 1 ml de milieu préchauffé UPC. Utiliser une MOI de 1 à 1,5 (de 5 à 7,5 x 10 5 CIU), qui est suffisante pour la reprogrammation des cellules d'urine. Aspirer le milieu et ajouter lentement 1 ml de la UPC + SeV à une bien des cellules d'urine. Utilisez la seconde ainsi que la transduction contrôle négatif.
- Le Jour 1, remplacer le milieu UPC + SeV avec le milieu UPC frais. Certains mort cellulaire est observée après 24 h en raison de la cytotoxicité virale.
- Selon efficacité de Clon reprogramméformations e et la morphologie compacte, ne cessent de changer le milieu tous les jours jusqu'au jour 6 ou 7.
- Un jour avant la dissociation des cellules transduites (jour 5 ou 6), préparer des plaques d'alimentation MEF par placage mitomycine C (10 ug / ml pendant 3 heures)-MEF traitées à une densité de 5 x 10 4 cellules / cm 2, sur 0,1 % de gélatine enduite 100 mm 2 plats de culture.
- Le lendemain (jour 6 ou 7), dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine, remettre en suspension les cellules dans du milieu UPC et de la plaque 5 x octobre 4-2 x 10 5 cellules / mm 2 100 MEF plaque d'alimentation.
- Le lendemain, passer à moyen hES et de changer le milieu tous les jours. Respecter les cellules sous un microscope pour surveiller cellules transformées.
REMARQUE: Les cellules forment des agrégats clonales et une morphologie caractéristique pavée et ayant noyau supérieur rapport cytoplasmique (12-18 jours après transduction). - Dans les deux à trois semaines après la transduction, prélever des colonies et de les transférer sur de nouvelles plaques pour clonextension al.
- Effectuer la coloration de cellules vivantes pour la sélection de clones iPSC en incubant des cellules avec TRA-1-81 anticorps pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2 suivie d'une contre-coloration avec un colorant fluorescent spécifique conjugué anticorps secondaire pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2.
- Utilisez un G 1½ aiguille 26 pouces de contre-éclore les grands TRA-1-81 clones positifs iPSC en petits morceaux de taille égale (4-6 pièces par clone).
- Utiliser une pipette à pointe stérile pour ramasser et le transfert de 10 à 20 pièces hachurées de multiples clones dans chaque puits de Matrigel (10 ug / cm 2) doté d'un revêtement plaque à 24 puits avec du milieu hES.
REMARQUE: Pièces d'un clone unique plaqué individuellement dans un seul puits ne étendre ou de maintenir la pluripotence. - Changer de hES à moyen iPSC 24-48 heures après les clones reprogrammées sont attachés à la surface Matrigel.
- Lors de l'entretien sur des plaques enduites de Matrigel, SCRA manuellementpe-off des cellules différenciées ou contaminantes cellules nourricières MEF aide d'une pipette à pointe pour enrichir iPSC (MD-iPSC) clones dystrophiques entièrement reprogrammées et pluripotentes.
- Après clones individuels ont atteint ~ 100 taille um, d'élargir les clones en dissociant avec mM d'EDTA 0,48 (acide éthylènediaminetétraacétique) solution pendant 3 min et le placage de petits agrégats de cellules de MD-iPSCs en suspension dans du milieu iPSC (additionné de 5 uM Y27632, la Rho kinase inhibiteur ) sur matrigel frais (10 ug / cm 2) revêtu 12 plaque bien. Changer le milieu iPSC quotidienne.
- La reprogrammation complète de chaque clone peut être déterminée à la fois par analyse d'expression génique de gènes de OSKM et la coloration immunohistochimique de marqueurs de la pluripotence (Oct3 / 4 et TRA-1-81). Une évaluation rigoureuse du potentiel de la pluripotence devrait être utilisée pour confirmer lignes iPSC entièrement reprogrammées peuvent se différencier en trois feuillets embryonnaires. Ceci peut être réalisé soit en corps embryoïdes (EB) la formation et de la différenciation ou d'un dosage teratoma formation dosage.
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Résultats
La plupart des cellules souches isolées à partir d'urine humaine sont positives pour les marqueurs progénitrices et péricytes uroépithéliales tels que CD44, CD73, et CD146 (97,37%, 97,09% et 97,3%, respectivement: la figure 1A et 1B). Ces cellules ont également exprimé d'autres marqueurs mésenchymateuses tels que l'alpha-actine musculaire lisse et vimentine (figure 1B). Analyse RT-PCR donne la preuve d'une population mixte de cellules dans les cultures en ce qu 'une fai...
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Discussion
Modélisation des maladies cardiovasculaires à l'aide CSPi devient une approche commune pour comprendre la contribution génétique 4-6. Certaines difficultés imprévues d'obtenir des échantillons de cellules de patients, en particulier les jeunes enfants, peuvent être évités en offrant la possibilité d'une approche non invasive comme une collection d'urine. Dans cette jeune population de patients, il est souvent difficile de recueillir un volume d'urine suffisante pour produire des cellules d...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Le développement de ce protocole a été soutenu par Advancing a Healthier Wisconsin et le National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, par le biais de la subvention numéro 8UL1TR000055. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Gobelet à échantillons avec couvercle | STL | Supply M9AMSAS340 | pour le prélèvement d’échantillons d’urine |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Couvertures rondes en verre | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Life | Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep sans glutamine ; | Life Technologies | 15140-122 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| B-27 Supplément avec insuline (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| B-27 Supplément sans insuline (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Versene, 1:5 000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| bFGF (10 µ ; g) | Life Technologies | 13256-029 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Cartouches de compteur de cellules | Life Technologies | C10228 | |
| Sérum knockout (500 ; ml Bouteille) | Life Technologies | 10828-028 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Culture cellulaire de récupération Congélation Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant |
| utilisation Mélange nutritif F-12 de Ham ; | Life Technologies | 11765-054 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| EGF Protéine humaine recombinante, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Insuline, Recombinant Humain, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Inhibiteur de ROCK (Y-27632) | Selleck | S1049 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit ; | Qiagen | 74104 | |
| iScript Kit de Synthèse d’ADNc | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualifié | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Adénine Bioréactif | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Toxine cholérique de Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Holo-transferrine de l’homme | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sel sodique | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DAPI ; | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous milieu de montage | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16 % Paraformaldéhyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - étiqueté avec FITC ; | BD Biosciences | 560977 | |
| Souris anti CD146 - étiqueté avec PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Souris anti CD73 - marqué avec PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Souris anti-&alpha ;-action musculaire lisse | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Souris anti-Vimentine | Abcam | ab8978-100 | |
| Souris Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Lapin anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Souris Anti Dystrophine | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Références
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- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
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Réimpressions et autorisations
