Ce protocole implique des procédures détaillées pour l’isolement des cellules dérivées de l’urine de patients atteints de dystrophie musculaire ; leur reprogrammation efficace et rapide par transduction du virus Sendai.
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Article de méthode
Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Dystrophie musculaire patients: efficace Reprogrammation libre-intégration de l'urine cellules dérivées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cardiomyopathie dystrophique est une conséquence mal compris de la dystrophie musculaire. Générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP) provenant de patients atteints de dystrophie musculaire est une source précieuse cellulaire pour des systèmes de modèles in vitro de la maladie à l'intérieur et peut être utilisé pour des études de criblage de médicaments. Les cellules d'urine provenant de patients ont été utilisés dans une reprogrammation réussie dans les cellules souches pluripotentes induites afin de modéliser une cardiomyopathie dystrophique. Répondre aux préoccupations de l'intégration des systèmes de vecteurs de sécurité, nous présentons un protocole utilisant un vecteur de virus Sendai non-intégration pour la transduction de Yamanaka facteurs dans les cellules d'urine prélevés chez des patients atteints de dystrophie musculaire. Ce protocole génère entièrement reprogrammé clones dans les 2-3 semaines. Les cellules pluripotentes sont indemne de vecteurs par passage-13. Ces CSPi dystrophiques peuvent être différenciées en cardiomyocytes et utilisés soit pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour le dépistage de la drogue.
Introduction
La cardiomyopathie est la deuxième principale cause de décès chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (MD). Bien que des mutations dans le gène de la dystrophine liée à l'X se produisent dans une: 3500 naissances masculines, on sait très peu sur les événements moléculaires et cellulaires conduisant à une dégradation progressive du muscle cardiaque. cellules souches pluripotentes humaines induites provenant de patients atteints de dystrophie musculaire ont émergé comme un nouvel outil pour étudier les mécanismes de la maladie sous-jacents et à utiliser pour le dépistage de drogues 1,2.
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Protocole
NOTE: Les patients et / ou leurs tuteurs doivent donner un consentement éclairé à participer à un Institutional Review Board étude approuvée.
1. Tampons et préparations des médias
- tampon de lavage: Pour préparer 100 ml de tampon de lavage, ajouter 1 ml de stylo 100x / Solution streptococcique (100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine) à 99 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Progenitor urinaire cellulaire (UPC) Medium: Pour préparer le milieu UPC, mélanger des volumes égaux de kératinocytes Free Serum (KSF) Medium + de cellules souches moyen.
- KSF Medium: Pour préparer le milieu....
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Résultats
La plupart des cellules souches isolées à partir d'urine humaine sont positives pour les marqueurs progénitrices et péricytes uroépithéliales tels que CD44, CD73, et CD146 (97,37%, 97,09% et 97,3%, respectivement: la figure 1A et 1B). Ces cellules ont également exprimé d'autres marqueurs mésenchymateuses tels que l'alpha-actine musculaire lisse et vimentine (figure 1B). Analyse RT-PCR donne la preuve d'une population mixte de cellules dans les cultures en ce qu 'une fai.......
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Discussion
Modélisation des maladies cardiovasculaires à l'aide CSPi devient une approche commune pour comprendre la contribution génétique 4-6. Certaines difficultés imprévues d'obtenir des échantillons de cellules de patients, en particulier les jeunes enfants, peuvent être évités en offrant la possibilité d'une approche non invasive comme une collection d'urine. Dans cette jeune population de patients, il est souvent difficile de recueillir un volume d'urine suffisante pour produire des cellules d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Le développement de ce protocole a été soutenu par Advancing a Healthier Wisconsin et le National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, par le biais de la subvention numéro 8UL1TR000055. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Gobelet à échantillons avec couvercle | STL | Supply M9AMSAS340 | pour le prélèvement d’échantillons d’urine |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Couvertures rondes en verre | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Life | Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep sans glutamine ; | Life Technologies | 15140-122 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| B-27 Supplément avec insuline (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| B-27 Supplément sans insuline (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Versene, 1:5 000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| bFGF (10 µ ; g) | Life Technologies | 13256-029 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Cartouches de compteur de cellules | Life Technologies | C10228 | |
| Sérum knockout (500 ; ml Bouteille) | Life Technologies | 10828-028 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Culture cellulaire de récupération Congélation Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant |
| utilisation Mélange nutritif F-12 de Ham ; | Life Technologies | 11765-054 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| EGF Protéine humaine recombinante, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Insuline, Recombinant Humain, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Inhibiteur de ROCK (Y-27632) | Selleck | S1049 | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit ; | Qiagen | 74104 | |
| iScript Kit de Synthèse d’ADNc | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualifié | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Adénine Bioréactif | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Toxine cholérique de Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Holo-transferrine de l’homme | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sel sodique | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| DAPI ; | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous milieu de montage | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16 % Paraformaldéhyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - étiqueté avec FITC ; | BD Biosciences | 560977 | |
| Souris anti CD146 - étiqueté avec PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Souris anti CD73 - marqué avec PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Souris anti-&alpha ;-action musculaire lisse | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Souris anti-Vimentine | Abcam | ab8978-100 | |
| Souris Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Lapin anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Souris Anti Dystrophine | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Références
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
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Réimpressions et autorisations
