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L'immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

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DOI :

10.3791/52036

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30 août 2014

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1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

Dans cet article

Résumé

Le présent travail illustre la commodité de l’utilisation de l’immunothérapie sublinguale pour stimuler la réponse immunitaire innée dans les poumons et conférer une protection contre la pneumonie pneumococcique aiguë chez la souris.

Résumé

La voie sublinguale a été largement utilisée pour délivrer de petites molécules dans la circulation sanguine et pour moduler la réponse immunitaire à différents endroits. Il a été démontré qu’il induit efficacement des réponses humorales et cellulaires aux sites systémiques et muqueux, à savoir les poumons et le tractus urogénital. La vaccination sublinguale peut favoriser la protection contre les infections des voies respiratoires inférieures et supérieures ; Il peut également favoriser la tolérance aux allergènes et améliorer les symptômes de l’asthme. La modulation de la réponse immunitaire pulmonaire par immunothérapie sublinguale (SLIT) est plus sûre que l’administration directe de formulations par voie intranasale, car elle ne nécessite pas l’administration de molécules potentiellement nocives directement dans les voies respiratoires. Contrairement à l’administration intranasale, les effets secondaires impliquant une toxicité cérébrale ou une paralysie faciale ne sont pas favorisés par l’ITSL. Les mécanismes immunitaires sous-jacents à l’ITSL restent insaisissables et son utilisation pour le traitement des infections pulmonaires aiguës n’a pas encore été explorée. Par conséquent, le développement de modèles animaux appropriés de SLIT est nécessaire pour explorer davantage ses avantages potentiels.

Ce travail montre comment effectuer l’administration sublinguale d’agents thérapeutiques chez la souris pour évaluer leur capacité à protéger contre la pneumonie aiguë à pneumocoque. Les aspects techniques de la manipulation de la souris lors de l’inoculation sublinguale, de l’identification précise de la muqueuse sublinguale, du drainage des ganglions lymphatiques et de l’isolement des tissus, du lavage broncho-alvéolaire et des poumons sont illustrés. Les protocoles de préparation de la suspension de cellules uniques pour l’analyse FACS sont décrits en détail. D’autres applications en aval pour l’analyse de la réponse immunitaire sont discutées. Les aspects techniques de la préparation de l’inoculum de Streptococcus pneumoniae et de la provocation intranasale chez la souris sont également expliqués.

SLIT est une technique simple qui permet de cribler des molécules candidates pour moduler la réponse immunitaire des poumons. Les paramètres affectant le succès de l’ITLS sont liés à la taille moléculaire, à la sensibilité à la dégradation et à la stabilité des formulations hautement concentrées.

Introduction

L’objectif global de ce travail est d’illustrer les bénéfices de l’immunothérapie sublinguale pour le traitement des infections respiratoires aiguës (IRA) et de présenter les avantages de cette voie d’administration par rapport à d’autres voies d’administration, à savoir intranasale.

ARI causent des millions de décès chaque année, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Streptococcus pneumoniae reste l’un des principaux agents étiologiques de la pneumonie bactérienne chez les nourrissons et les personnes âgées1,2. À l’heure actuelle, le principal traitement disponible repose sur l’utilisation d’antibiotiques mais des souches résistantes apparaissent continuellement3,4.

< classe p = 'jove_content'> SLIT induit des réponses larges au niveau systémique et aussi au niveau muqueux, en particulier au niveau des voies respiratoires5. Son efficacité a été prouvée contre l’infection grippale, favorisant une protection à long terme avec la production de réponses humorales et cellulaires6,7. En outre, il a été démontré que le traitement prophylactique avec des lysats bactériens délivrés par voie sublinguale réduisait les exacerbations de bronchite chronique obstructive chez les personnes âgées8 et prévenait les infections respiratoires récurrentes chez les enfants9. SLIT a été largement utilisé pour le traitement des allergies et de l’asthme. Des études cliniques avaient non seulement démontré son efficacité à moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires, mais aussi son innocuité10. Malgré l’intérêt croissant des entreprises pharmaceutiques et des chercheurs pour le SLIT, les mécanismes impliqués dans l’induction des réponses immunitaires de la muqueuse après l’administration sublinguale de composés restent obscurs. Récemment, l’attention s’est portée sur les mécanismes favorisant la tolérance associés à la désensibilisation aux allergènes. Il a été proposé que les cellules résidentes et recrutées au niveau de la muqueuse sublinguale, comme les cellules dendritiques et les macrophages, peuvent favoriser la tolérance après SLIT11-13. Les cellules dendritiques de la muqueuse buccale peuvent favoriser les cellules T auxiliaires productrices d’IFN-gamma et d’IL-1011, ainsi que la recirculation vers la muqueuse génitale distale et favoriser les cellules T CD8+ 14. Cependant, on sait peu de choses sur l’impact de l’ITSL sur les cellules innées ou sur sa capacité à améliorer l’élimination des agents pathogènes lors d’infections respiratoires aiguës.

Le contrôle naturel de l’infection pneumococcique dans les poumons dépend en grande partie de l’activation efficace et rapide des défenses innées locales. Nous avons précédemment montré que l’augmentation de l’immunité innée des poumons par une dose intranasale unique de flagelline (FliC), un agoniste de TLR5 et NLRC4, protège 75 à 100 % des souris exposées à une dose létale d’un isolat clinique de Streptococcus pneumoniae sérotype 1. Il a été démontré que cette protection dépendait du recrutement local de cellules GR1+ (probablement des polynucléaires neutrophiles, PMN) et non des anticorps, cellules B ou T15.

La flagelline est le composant structurel du flagelle bactérien. Dans sa forme monomère, il est reconnu par deux récepteurs de reconnaissance d’agents pathogènes (PRR), TLR5 qui détecte la fliC16 extracellulaire et l’inflammasome NLRC4/NAIP5 qui détecte la flagelline17,18 intracellulaire. Lorsque la FliC est détectée par les PRR, une réponse inflammatoire importante est déclenchée. Nous et d’autres avons démontré que l’instillation de FliC purifié de Salmonella enterica sérovar Typhimurium dans les poumons entraîne une production rapide de chimiokines et de cytokines, en particulier lorsqu’elles sont reconnues par l’épithélium des poumons qui, à leur tour, orchestrent le recrutement de cellules immunitaires dans les voies respiratoires, principalement les PMN15, 19-21. Bien que transitoire, l’infiltration substantielle de neutrophiles qui a lieu dans les voies respiratoires après l’administration nasale de FliC pourrait être une préoccupation si l’on s’oriente vers des thérapies cliniques à usage humain. Une inflammation excessive pourrait être préjudiciable à la fonction pulmonaire. De plus, il a été démontré que l’administration intranasale de molécules immunostimulantes peut provoquer une paralysie faciale et/ou une toxicité cérébrale22-24.

L’immunothérapie sublinguale offre une alternative plus sûre pour moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires par rapport à la voie intranasale. Il est non invasif, indolore, simple et a une bonne observance du patient25. De plus, comme mentionné précédemment, il peut induire des réponses protectrices dans la muqueuse respiratoire sans les risques associés à l’administration intranasale ou intrapulmonaire directe de formulations. La voie sublinguale pourrait également être utilisée pour délivrer des molécules qui ont des effets importants sur le système immunitaire des poumons, mais qui se sont avérées toxiques ou qui provoquent une grande inflammation lorsqu’elles sont administrées par voie intranasale. Outre ces avantages, les formulations pour l’immunothérapie sublinguale ont un coût de fabrication inférieur puisque des produits non stériles peuvent être administrés par cette voie et le choc endotoxique n’est pas un problème pour l’ITSL. D’autre part, il convient de noter que des doses plus élevées de composés immunostimulants par rapport à celles utilisées par voie intranasale ou parentérale sont nécessaires pour induire une réponse immunitaire dans les poumons ; Des solutions hautement concentrées sont également nécessaires lors de l’utilisation du modèle murin de SLIT, car le site anatomique où les formulations sont déposées est petit.

Sur la base de nos données publiées précédemment, nous avons développé un modèle de protection en utilisant l’immunothérapie sublinguale avec la flagelline comme immunostimulant modèle. Nous avons démontré qu’une dose unique de flagelline induisait une survie de 60 % contre la pneumonie pneumococcique invasive causée par la souche de sérotype 1, tandis que toutes les souris du groupe témoin sont mortes de l’infection dans les 5 jours. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’un plus grand nombre de PMN sont recrutés dans les voies respiratoires des animaux protégés après un traitement sublingual à la flagelle, suggérant que ces cellules pourraient être impliquées dans le mécanisme de protection induit par l’immunothérapie sublinguale.

Cette vidéo montre en détail comment effectuer une immunothérapie sublinguale et aussi comment récupérer les tissus pertinents de la muqueuse sublinguale, drainer les ganglions lymphatiques ainsi que les poumons et les voies respiratoires pour effectuer une analyse plus approfondie. De plus, il illustre la technique générale de préparation cellulaire pour l’analyse FACS et montre brièvement comment préparer des suspensions de Streptococcus pneumoniae et comment effectuer des infections intranasales chez la souris pour mettre en place le modèle d’infection aiguë.

Protocole

Procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec le protocole n ° 08052010 071140-000821-12 et approuvé par la Commission honoraire pour l'expérimentation animale et le Conseil de la Faculté de médecine, Université de la République directive - Uruguay.

1. sublinguale administration de l'agent thérapeutique

  1. Préparation de la solution contenant l'agent thérapeutique à tester. Ajuster la concentration d'administrer un volume maximum de 10 ul par souris.
    REMARQUE: Pour flagelline purifiée à partir de Salmonella enterica sérotype Typhimurium la dose optimale pour induire une protection chez la souris infectée par la première dose létale de S. pneumoniae de sérotype 1 E1586, ce qui provoque une mortalité de 100% est de 10 pg / souris. solution de flagelline doit être chauffé à 65 ° C pendant 5 min pour assurer la libération des monomères. Pour plus d'informations sur la purification de la flagelline voir référence 26.
    1. Varconcentration efficace y de différents agents immunomodulateurs fonction de sa taille moléculaire, la pureté, la susceptibilité à la protéolyse et l'utilisation d'agents muco-adhésifs. Ajuster la concentration optimale pour chaque composé à tester afin de maximiser les effets. Si des études antérieures par voie intranasale ont été réalisées pour un composé particulier, utiliser une dose initiale de 5 à 10 fois supérieure à tester son efficacité par voie sublinguale.
  2. Anesthésier la souris par l'injection d'un cocktail contenant 110 mg / kg de kétamine avec 5,5 mg / kg Xylacine et de laisser les animaux se reposent pendant 7 à 10 min.
  3. Confirmez anesthésie appropriée en appuyant doucement sur la patte de l'une des pattes postérieures; si bien anesthésié l'animal ne se déplace pas en réponse au stimulus.
  4. Étendre une mince couche de pommade vétérinaire sur les yeux de chaque souris pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie.
    REMARQUE: Les anesthésiques par inhalation comme isofluorane peuvent également être utilisés à la place de kétamine / Xylacine si un système équiperped avec chambre et le nez cônes induction est disponible. Utilisez la chambre d'induction pour anesthésier les animaux et administrer le immunostimulant par voie sublinguale. Connecter immédiatement l'animal à un cône de nez pendant au moins 15 min pour le garder sous anesthésie pour éviter d'avaler et permettre l'absorption du composé thérapeutique.
  5. Pipeter la solution contenant la solution d'immunostimulant ou le contrôle du véhicule; avec le pouce et l'index de la main non dominante prend la souris et maintenez-le en position verticale.
  6. Utilisation de la place de la main dominante une paire de pinces fermées sous la langue et le maintenir en place à l'aide des doigts majeur et l'annulaire, ouvrir légèrement la pince pour soulever la languette.
  7. Prendre la pipette et administrer la solution sur la surface du côté de la bouche et dorsale de la langue.
  8. Retirer les pinces et laisser le reste de la souris pendant 3 à 5 min avant de le remettre dans la cage. Afin de s'assurer que la normothermie est maintenue dans le micro anesthésiée, connecter les cages à un système de chauffage cage. Si tel système n'est pas disponible, placez la souris appartenant au même groupe de traitement de nouveau dans une cage correspondante côté de l'autre sur la literie et les couvrent que partiellement avec des feuilles de papier de soie propres à les aider à maintenir la température du corps.
  9. Prélever des échantillons de tissus à n'importe quel point dans le temps après l'instillation de l'agent immunomodulateur à analyser les changements dans les populations de cellules induites par le traitement.
    NOTE: Dans l'administration de ce protocole particulier de la flagelline a été réalisée 2 h avant l'épreuve. Déterminer le temps optimal entre le traitement et le défi pour chaque agent thérapeutique particulier et l'agent pathogène à tester.

2 Préparation de la suspension bactérienne et intranasale Challenge Streptococcus pneumoniae

REMARQUE: S. pneumoniae est un agent pathogène humain naturel qui peut provoquer des maladies mortelles comme la pneumonie invasive, la septicémieet la méningite. La transmission peut se produire lorsque inhalé ou en contact avec la muqueuse. Par conséquent, tous les échantillons qui ont pu être en contact avec S. pneumoniae doit être traitée dans une installation de biosécurité de niveau II appropriée en utilisant une enceinte de sécurité biologique de classe II. Vérifiez les procédures d'opération standard de votre institution en matière de manipulation des agents pathogènes de type II pour les vêtements de protection, l'élimination des déchets et des mesures de sécurité supplémentaires qui peuvent s'appliquer. Les animaux infectés doivent être gardés dans des cages individuellement ventilées dans des isolateurs équipés de filtres HEPA. Vaccins anti-pneumococciques et antibiothérapie sont disponibles. Pour plus d'informations voir les références 27 et 1.

  1. Décongeler une aliquote de suspension d'un stock de travail de Streptococcus pneumoniae de nombre d'UFC bactérienne connue préparé comme décrit dans 15.
  2. Centrifuger pendant 5 min à 2500 xg et RT.
  3. Jeter le surnageant et laver le culot bactérien par mise en suspension dans 1 ml de stsolution saline erile. Utiliser des pointes de filtre lors de la préparation de suspension bactérienne, dilutions ou de contestation des animaux.
  4. Centrifuger à nouveau comme décrit dans l'étape 2.2.
  5. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans le volume approprié de solution saline stérile pour obtenir une suspension de 4x10 5 UFC / 50 pi. Cette dose correspond à la dose minimale bactérienne de S. pneumoniae de sérotype 1 E1586 qui provoque une mortalité de 100% chez des souris BALB / c selon des études antérieures 15.
    REMARQUE: Lors de l'établissement d'un modèle de pneumonie à pneumocoque chez la souris, la dose minimale bactérienne provoquant 100% de mortalité doit être déterminée pour chaque combinaison particulière de la souche bactérienne, le sérotype et souche de souris.
  6. Homogénéiser la suspension bactérienne par vortex ou aspiration et refoulement 5 fois.
  7. Charge 50 pl de la suspension bactérienne à l'aide d'une pointe de filtre stérile et inculquer le volume total dans les narines d'une souris anesthésiée. Tenez le UPRI de la sourisght pendant 2 min et laisser reposer en position dorsale pendant 2 min. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux et le retour des animaux à la cage; assurez-vous de maintenir la normothermie sous anesthésie.
    NOTE: Dans cette étude provocation bactérienne a été réalisée dans un volume de 50 ul pour assurer la livraison d'au moins 90% du total de CFU dans les poumons que déterminé précédemment à 15,28. Pour minimiser la détresse de petits volumes de l'animal (par exemple, 20 pi) peuvent être utilisés. Cependant, la livraison efficace des bactéries dans les poumons doit être cochée; cela peut se faire par récolte les poumons 5 min après la provocation et le comptage des CFU dans les homogénats de poumons par étalement des dilutions en série sur des plaques de gélose-sang.
  8. Confirmer le nombre de CFU dans la suspension bactérienne utilisée pour l'infection par étalement des dilutions en série de 10 fois sur des plaques de gélose au sang. Incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de compter le nombre de colonies mucoïdes présentant une caractéristique de halo vert d'albactéries pha de hémolytiques.

3 Collection de tissus et la préparation d'échantillons pour la cytométrie de flux (FACS)

3.1) collection de tissus

  1. Euthanasier l'animal par dislocation cervicale ou à l'aide de CO 2 chambre; ouvrir la cavité thoracique tout le chemin jusqu'à la nuque et faire une incision le long des jambes avant d'exposer la face ventrale du cou et sous-maxillaire.
  2. Avec la pointe recourbée pinces fines tirez doucement les glandes salivaires et les tissus mous adjacents à exposer la face dorsale du plancher de la bouche. Utilisation de courbes fines pinces de pointe, prendre la mandibule et les ganglions lymphatiques mandibulaires accessoires en tirant délicatement et placez-les dans un tube contenant RPMI complet (cRPMI, pour 500 ML 10% du fœtus de sérum bovin, 5 ml d'une solution contenant 10 000 U / ml La pénicilline et 10 mg / ml de streptomycine et 5 ml de solution de L-Glutamine 200 mM) ou de la solution de conservation de l'acide nucléique selon le procédé en aval qui serontêtre effectuée plus tard.
  3. Pour ouvrir la cavité thoracique faire une incision dans la membrane; en utilisant une paire de pinces à dents de souris serrer le cartilage xiphoïde du sternum et soigneusement couper les nervures des deux côtés dorsaux à partir de fausses côtes tout le chemin jusqu'à atteindre le point où les nervures se rencontrent véritables du manubrium du sternum.
  4. En tenant le cartilage xiphoïde du sternum avec la pince, tirez doucement pour exposer les organes de la cavité thoracique.
  5. Retirer les côtes complètement en coupant les premières côtes et la clavicule. Le thymus apparaît comme une structure blanche de deux lobes situés dans la partie antéro du thorax à proximité de la base du coeur.
  6. Prenez l'un des lobes de serrage avec une paire de pinces et d'utiliser une paire de ciseaux pour enlever les ligaments entre sa face inférieure et le péricarde. Continuer à supprimer le deuxième lobe.
  7. Identifier la cavité abdominale et l'ouvrir en coupant le long de l'axe médian de la mparoi uscular pour exposer les organes. Avec une paire de pinces couper la veine cave postérieure et l'aorte thoracique; éliminer l'excès de sang avec un tissu absorbant.
  8. Pour analyser les populations de cellules résidentes et infiltrant des alvéoles effectuent un lavage broncho-alvéolaire (BAL). Couper les muscles dans la partie ventrale du cou pour exposer la trachée et de l'œsophage; à séparer les incisions font sur les côtés latéraux et dorsales des structures.
  9. Soulevez la trachée avec la pince et faire une petite incision avec un scalpel à introduire une pipette de transfert mince de pointe remplie de 1 ml de PBS sans Ca2 + / Mg 2 + plus 1 mM d'EDTA. Instiller et aspirer le volume total au moins trois fois; aspirer et transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 ml et le placer sur de la glace.
  10. Pour analyser les populations de cellules présentes dans le parenchyme pulmonaire, les poumons première perfuser en injectant 5 ml de PBS sans Ca2 + / Mg2 + + 1 mM d'EDTA dans le ventricule droitdu cœur.
    NOTE: Cela permettra d'éliminer la plupart des globules rouges et des cellules immunitaires présentes dans les vaisseaux sanguins des poumons. Si la perfusion a été effectuée correctement, la couleur des poumons passera du rose au blanc.
  11. Isoler le coeur des poumons par serrage de l'embase du ventricule gauche et délicatement couper des vaisseaux sanguins avec des ciseaux pour le retirer complètement. Prenez les poumons perfusés et les placer dans cRPMI ou solution nucléique conservateur acide en fonction de l'analyse en aval à effectuer.
  12. Pour l'analyse des populations de cellules de la muqueuse sublinguale, isoler la tête de l'animal et enlever les glandes salivaires et les tissus mous adjacents si elle n'a pas été fait à l'étape 3.2.1.
  13. Faire une incision sur chaque côté de la bouche jusqu'à l'articulation de la mandibule et séparer la mâchoire inférieure avec la langue et le plancher de la bouche, en utilisant des épingles fixer sur le tableau de dissection. Tirez la langue; l'aide d'un scalpel faire une incision où la basoi de la languette rencontre le plancher de la bouche jusqu'à ce qu'il atteigne les troisièmes molaires pour exposer la muqueuse sublinguale.
  14. Retirez la langue complètement; faire une biopsie poinçon de 0,5 mm et le placer à côté des incisives inférieures. Couper de l'insertion du tissu gingival sublinguale et appuyez doucement jusqu'à ce que le plancher de la bouche a été coupé complètement.
  15. Répéter une fois de plus placer maintenant le poinçon de biopsie à proximité des troisièmes molaires pour compléter l'ablation du tissu sublinguale. Placer sur un tube propre contenant cRPMI ou conservateur acide nucléique.

3.2) La préparation des échantillons pour l'analyse FACS.

  1. Transférer le tissu du poumon isolé à partir de chaque souris dans une plaque à 24 puits et les hacher avec une paire de ciseaux propres jusqu'à l'obtention de petits morceaux de tissu d'environ 2 mm. Ajouter 1 ml par puits de milieu de digestion contenant 30 mg de collagénase de type II, 50 ug DNAse I dans 1 ml de milieu RPMI sans SVF. Introduire à la pipette de haut en bas cinq fois et incuber à37 ° C et 5% de CO2 pendant 40 min.
    1. Pour l'analyse des populations de cellules dans le tissu par voie sublinguale, remplacer le milieu de digestion dans 3.2.1 avec un contenant 2 unités de dispase, 30 mg de collagénase de type II, 50 ug DNAse I dans 1 ml de RPMI. Incuber le tissu prélevé à partir de l'une souris dans 500 pi de milieu de digestion de 20 minutes à 37 ° C dans un agitateur orbital à 50 rpm.
  2. Après incubation, on pipette de haut en bas jusqu'à 10 fois ou plus de 30 secondes jusqu'à ce que le tissu a été perturbé. On filtre la suspension de cellules si une cellule 40 um stérile filtre et on lave avec 5 ml de PBS supplémenté avec 5 mM d'EDTA.
    REMARQUE: La digestion complète de la matrice extracellulaire et de tissu fibreux ne sera pas atteint. Cependant, des temps plus longs d'incubation en présence de collagénase et / ou la dispase ou trituration agressif ne sont pas recommandées, car il en résultera une augmentation de la mort cellulaire et la destruction des protéines extracellulaires qui affectent le résultat d'ensemble du FACS.
  3. Centrifugeuse à 400 xg, 5 min, 4 ° C.
    1. Pour l'analyse des populations cellulaires dans le BAL, centrifuger les cellules à 400 xg, 5 min, à 4 ° C et passez à l'étape 3.2.4.
    2. Pour l'analyse des populations de cellules dans les ganglions lymphatiques, placer un filtre de 70 um de la cellule sur une boîte de Pétri stérile et on a mis le ganglions lymphatiques avec 1 ml de cRPMI dans la crépine. Prenez le plongeon d'une seringue stérile de 2 ml et l'utiliser comme un pilon pour écraser les ganglions lymphatiques contre la maille de la crépine. Rincer la crépine de cellules avec 1 ml de cRPMI frais et transférer les cellules de la boîte de Pétri dans un tube stérile.
  4. Prenez une portion représentative de chaque échantillon et tacher avec du bleu Trypan pour déterminer le nombre de cellules viables.
  5. Remettre en suspension les cellules dans de l'EDTA-FACS: PBS-EDTA 5 mM, 1% de sérum albumine bovine à obtenir une suspension de 2x10 7 cellules / ml et ajouter 50 ul dans un tube cytomètre.
  6. Préparer un mélange d'anticorps 2X contenant l'appropriate combinaisons d'anticorps dirigés contre des marqueurs de surface et des fluorochromes selon l'instrument FACS disponible. Ajouter 50 ul de l'anticorps mélange 2X dans chaque tube contenant la suspension cellulaire.
    REMARQUE: Titrer chaque anticorps marqué par un fluorochrome pour déterminer la quantité optimale à utiliser, pour un protocole détaillé voir référence 29.
  7. Incuber 30 min sur la glace dans l'obscurité.
  8. Laver une fois avec 3 ml de FACS-EDTA et centrifuger les cellules par centrifugation à 400 g pendant 5 min à 4 ° C, remise en suspension des cellules dans 200 ul du même tampon et analyser dans un cytomètre de flux.
    NOTE: Si la manipulation d'un grand nombre d'échantillons, le protocole de coloration à l'analyse FACS décrit ci-dessus peut être effectuée dans des plaques à fond en U à 96 puits à la place de tubes cytomètre. Cependant, si l'on utilise des plaques à 96 puits étapes de lavage doit être effectué par l'addition de 200 ul de FACS-EDTA et répétant quatre fois filage vers le bas des cellules à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C entre chaque washiétape ng.
  9. À ce stade, fixer les échantillons pour l'analyse par cytométrie en flux plus tard (jusqu'à 72h après fixation).
    1. Pour fixer les cellules, après marquage avec les FACS-anticorps laver les cellules dans du PBS sans Ca 2 + / Mg 2 +, 1 mM EDTA sans FBS. Suspendre les cellules dans 50 ul du même tampon et ajouter 50 ul d'une solution à 4% de paraformaldehyde fraîchement préparé dans hypertonique (2X) du PBS sans Ca2 + / Mg2 +.
    2. Incuber pendant 20 min à température ambiante et laver 3 fois dans FACS-EDTA.
    3. Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de FACS-EDTA et conserver à 4 ° C et à l'abri de la lumière pendant 72 h.
      REMARQUE: FSC-SSC peut être affectée par la fixation. Si la fixation des échantillons de vérifier la compatibilité des anticorps marqués par fluorescence avec le fabricant depuis colorants en tandem peuvent être dégradés en présence d'agents de fixation. Si les échantillons proviennent d'animaux infectés fixation est fortement recommandé de veiller à ce qu'aucun des agents pathogènes viables seront présents lors analychanter les échantillons dans la machine FACS depuis microaerosols peuvent être générées lors de l'acquisition de l'échantillon.

4 Extraction de l'ARN total, synthèse d'ADNc et PCR en temps réel.

4.1) Extraction de l'ARN et synthèse de l'ADNc.

  1. Homogénéiser le tissu dans la solution de conservation de l'acide nucléique de choix par rupture mécanique (par exemple, en utilisant un homogénéisateur à rotor-stator, à haute vitesse d'agitation et de tissus ruptor billes, etc). Centrifuger à 12 600 g pendant 15 min et 4 ° C pour éliminer les débris de tissu. Transférer le surnageant dans un tube propre.
  2. Extrait de l'ARN avec la méthode de choix en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE: l'ARN est très sensible à la dégradation, si elle ne va pas être utilisé tout de suite après l'isolement, faire des aliquotes et les stocker dans des tubes sans RNase à -80 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée. Les tubes doivent être manipulés avec des gants en tout temps. Après décongélation des échantillons deoujours les garder sur la glace.
  3. Mesurer l'absorption d'acides nucléiques à 260 nm et le calcul de la concentration en pg / pl.
  4. Préparez DNAse-je mélanger par addition de (1 échantillon): 7,6 pi d'eau ultra-pure, 1 pl de tampon 10X DNase I, 0,4 pi de DNase I (niveau d'amplification) stock 1 U / ul, et ajouter 8,4 pi de la DNAse-je mélanger à chaque échantillon contenant 1 ug d'ARN total.
    1. Utilisation d'ARN à une concentration de 1 ug / ul et réaliser la réaction de rétrotranscription (RT-PCR) en ajoutant 1 pi de l'ARN total en tant que matrice. Si les échantillons sont trop dilué et la concentration est plus faible que prévu, d'ajouter de plus grands volumes d'ARN total à la place de l'eau. Ne pas dépasser 20% du volume final de la réaction lors de l'ajout de l'ARN spécialement si le protocole d'extraction d'ARN de choix impliqué mélange phénol-chloroforme, depuis des traces de phénol peuvent affecter le rendement de la RT-PCR.
  5. Incuber 15 minutes à température ambiante puis 10 min à 4 ° C ou iCE. (Ne pas dépasser la durée d'incubation !!)
  6. Ajouter 1 pi d'EDTA 25 mM (moléculaire de qualité biologie) à chaque tube et on incube à 65 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la DNase-I.
  7. Préparer rétrotranscription (RT) mélange comme suit (pour une réaction): 1 ul d'amorces hexamères aléatoires licence 0,2 mg / ml, 1 ul de dNTP stock 10 mM, tampon 5X M-MLV-RT 4 pl, 2 pl de DTT 0,1 M, 1 ul actions RNAse OUT 40 U / ul, et 1 pi M-MLV rétrotranscriptase actions 200 U / pl.
  8. Ajouter 10 ul de mix RT-PCR à la DNAse I-tube de réaction de 10 ul.
  9. Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur selon le programme suivant:
    Cycle 1X: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C
  10. Diluer l'ADNc de 1: 5 par ajout de 80 pl d'eau ultrapure. Stocker à -20 ° C.

4.2) PCR en temps réel (qPCR).

  1. Préparer qPCR mélange réactionnel comme suit (pour 1 réaction): mélange maître 5 pi contenant la Taq ADN Polymerase, SYBR colorant vert, tampon PCR, dNTP mix et MgCl 2 (voir 4.2.2 ci-dessous); 0,9 pi d'une solution 10 uM d'actions de l'amorce de l'avant, 0,9 pi d'une solution 10 uM d'achat d'actions de l'amorce inverse, l'eau ultra-pure de 1,2 pi et 2 pi de matrice d'ADNc, préalablement diluée comme indiqué dans l'étape 4.1.10.
    NOTE: protocoles concentration des réactifs et des cyclistes utilisés dans cette section ont été optimisés pour être réalisée spécifiquement avec les réactifs et instruments décrits dans le "Tableau des Matériaux et réactifs", d'autres marques peuvent être utilisés, mais les volumes de réaction, la concentration des réactifs et le protocole de vélo peuvent varier. Vérifiez vos instructions du fabricant avant de procéder à la RT-qPCR.
  2. Mettre en place l'instrument qPCR comme suit:
    Cycle de 1X: 15 min, 95 ° C
    40X cycles: 15 sec, 95 ° C puis 1 min, 60 ° C (à cette acquisition fluorescence point).
    Remarque: Pour la quantification relative de l'ARNm selon la méthode d'un Ct 30 référee gène doit être choisi pour la normalisation des valeurs de Ct. Référence gène de choix devrait être testée dans des conditions d'essai spécifiques comme son expression peut varier; ACTB, GAPDH ou 18S sont certains des gènes habituellement choisis comme références.
  3. Mettre en place la valeur de seuil et analyser les données.

Résultats

L'immunothérapie sublinguale peut être utilisé avec succès pour moduler la réponse immunitaire des poumons. Nous avons montré qu'une seule dose de la flagelline, l'agoniste et NLRC4 TLR5, peut induire une régulation à la hausse significative de l'ARNm codant pour la CXCL1 des chimiokines, CCL20 et la cytokine IL-6 par rapport à une solution saline traitée contrôles. Pliez induction de niveaux d'ARNm a culminé à 8 h après fente et revenir à des niveaux de base après 20 heures (Figure 1). Toutefois, lorsque SLIT a été effectuée 2 heures avant l'infection intranasale avec S. Pneumoniae, les niveaux de CXCL1 et IL6 ARNm demeurent significativement régulés à la hausse, même 24 heures après SLIT par rapport aux animaux non traités (figure 2).

L'analyse des populations cellulaires dans le BAL et le tissu pulmonaire par FACS a montré que les animaux traités avec FliC par voie sublinguale ont augmenté le nombre de neutrophiles dans les voies respiratoires, mais pas dans les tissus des poumons (Figure 3).

la figure 4, VSL avec flagelline promu protection et augmenté la survie contre la pneumonie à pneumocoques aigu.

figure-results-1
Figure 1: Cinétique de profil de transcription des poumons après l'immunothérapie sublinguale avec la flagelline. Des souris BALB / c âgées de huit à dix semaines (n = 4) ont été traités avec 10 pg de la flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. Les poumons ont été prélevés à différents moments et on les place dans de conservation des acides nucléiques. Extraction de l'ARN total a été effectuée et l'ADNc a été synthétisé. les niveaux d'ARNm ont été évalués par PCR en temps réel utilisant des amorces spécifiques figurant dans Table 1. quantification relative a été réalisée selon la méthode ACt utilisant des niveaux d'ARNm ACTB pour la normalisation. Les résultats sont présentés comme multiplication par rapport à une solution saline groupe traité par la médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p <0,05), calculée selon le test de Mann-Whitney. Les résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes.

figure-results-2
Profil transcriptionnel de Figure 2 poumons pendant la pneumonie à pneumocoque après immunothérapie sublinguale avec la flagelline (n 7 n = 4 pour le groupe témoin et = pour le groupe traité). Huit à 10 semaines souris BALB / c ont été traités avec 10 mg de flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. 2 heures plus tard souris ont été exposées par voie intranasale avec la dose létale minimale (DLM), provoquant 10Mortalité de 0% d'un isolat clinique de S. pneumoniae de sérotype 1 E1585, correspondant à 4x10 5 UFC / 50 pi. Les poumons ont été prélevés 24 heures après la provocation et stockés dans de préservation de l'acide nucléique jusqu'à ce que l'extraction d'ARN et synthèse d'ADNc ont été réalisées. PCR en temps réel a été effectuée (Voir la liste amorce dans le tableau 1) et la quantification relative a été réalisée selon la méthode ACt utilisant des niveaux d'ARNm ACTB pour la normalisation. Les résultats sont présentés comme multiplication par rapport à une solution saline groupe traité par la médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p <0,05), calculée selon le test de Mann-Whitney.

figure-results-3
Figure 3 Analyse des polynucléaires neutrophiles (PMN) le recrutement dans les tissus et les voies respiratoires des poumons après fente. Huit àDes souris BALB / c âgées de 10 semaines (n = 4) ont été traités avec 10 pg de la flagelline ou une solution saline par voie sublinguale, sous anesthésie. 2 heures plus tard souris ont été exposées par voie intranasale avec le MLD de S. pneumoniae de sérotype 1 E1585. 24 heures après la provocation, BAL a été effectuée et les poumons ont été traitées pour l'analyse FACS. PMN ont été identifiés comme CD11b cellules Ly6G haut / haut / CD11c négatifs et basé sur le profil FCS-SSC. Les résultats sont exprimés en tant que pourcentage de PMN à l'égard du nombre total de cellules dans le BAL et les poumons. Les barres représentent médiane ± SEM. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p <0,05), calculée selon une voie test de Mann-Whitney.

figure-results-4
Figure 4 VSL avec flagelline protège les souris contre la pneumonie à pneumocoques aigu. S. pneumoniae de sérotype 1 E1585. La survie a été évaluée sur une base quotidienne. Les courbes de Kaplan-Meier ont été comparés selon log-rank (Mantel-Cox) test. Les astérisques indiquent les différences statistiquement significatives (p <0,05) .Résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes.

Nom Séquence 5'-3 ' PCR longueur du produit (pb)
mB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
mB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
mIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

Le tableau 1 liste d'amorces utilisés pour l'analyse par PCR en temps réel. Des séquences d'amorces spécifiques utilisées pour l'analyse qPCR. Amorces sens et antisens pour ACTB de la souris, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa et CXCL1 sont présentés comme des séquences 5'-3 'et la longueur de produit attendu est indiqué en paires de bases (pb).

Discussion

L'administration sublinguale d'agents thérapeutiques a été prouvé comme un moyen utile pour moduler la réponse immunitaire dans les voies respiratoires. Le principal avantage de VSL pour le traitement des maladies respiratoires est qu'elle n'implique pas la livraison directe des composés dans les poumons ou les narines, être sûr que les traitements basés sur l'administration intranasale 31.

L'immunothérapie sublinguale peut être utilisé pour moduler la réponse immunitaire de différentes façons, que ce soit pour l'induction de réponses de régulation qui peut améliorer les symptômes de l'inflammation allergique et l'asthme 32 ou à induire une activation transitoire de mécanismes immunitaires innées pour traiter des infections pulmonaires aiguës comme indiqué ici.

Le modèle de souris présentée dans cette vidéo est un procédé commode pour le criblage de composés différents comme agents thérapeutiques pour fente.

Ce modèle animal offre un moyen utile pour déterminer l'impactde la SLIT dans la réponse immunitaire des poumons, ainsi que dans d'autres organes (par exemple,. drainage des ganglions lymphatiques ou des sites distaux des muqueuses) qui ne peut pas être imitée par l'utilisation de modèles in vitro. Bien qu'il existe plusieurs documents qui décrivent les résultats obtenus en utilisant l'immunothérapie sublinguale, méthodes détaillées pour les procédures de l'administration sublinguale n'ont pas encore été mis à disposition. En outre, le modèle peut être utilisé pour l'évaluation de vaccins sublinguaux visant à conférer une protection systémique ainsi que locale dans les voies respiratoires.

Comme montré dans la vidéo d'accompagnement, l'administration sublinguale de composés est une procédure simple qui peut être facilement réalisée sans qu'il soit nécessaire de formation étendue. En règle générale, une personne compétent dans la manipulation des animaux, il faudra 1 heure pour effectuer SLIT dans un groupe de 10 souris en utilisant des anesthésiques injectables comme décrit dans ce protocole. Si la récusation contre le pneumocoque est effectuée ainsi, 90 min supplémentaire sera nécessaire pour préparerla suspension bactérienne et effectuer provocation intranasale des animaux.

Les protocoles FACS présentés ici permettent de caractériser pratique de l'impact de la fente sur le site de l'administration locale, les ganglions lymphatiques drainant ainsi que leurs effets sur la dynamique des cellules des poumons.

L'analyse séparée de la teneur et du parenchyme pulmonaire bronchoalvéolaire est important de discriminer résidant à l'abri de l'infiltration des voies respiratoires et des types de cellules à partir de ceux qui restent à l'intérieur du tissu. L'analyse du contenu BAL permet l'étude du chiffre d'affaires des macrophages alvéolaires ainsi que la dynamique de recrutement des cellules dans les espaces alvéolaires induits par des traitements différents, par exemple., PMN, les éosinophiles, les monocytes. BAL peut également être utilisé pour évaluer la présence de cytokines et de chimiokines sécrétées par Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ou la détection d'anticorps IgA sécrétées induites après vaccination par voie sublinguale. Etude du tissu du poumonpermettant la caractérisation d'autres types de cellules, les cellules dendritiques Classiquement, les cellules T et les cellules B.

Préparation des échantillons de LBA et les ganglions lymphatiques de l'analyse FACS est simple. Après la collecte de l'échantillon, normalement de 60 minutes sont nécessaires pour compléter le protocole de coloration pour 10-20 échantillons. En revanche, l'isolement de cellules provenant de tissu pulmonaire ou par voie sublinguale, il faudra plus de temps car la digestion de la matrice extracellulaire est nécessaire. L'absorption de l'agent thérapeutique administré par voie sublinguale peut être adressée par le suivi de fluorescence des molécules radiomarquées ou en utilisant des systèmes d'imagerie in vivo.

L'immunothérapie sublinguale est une méthode attrayante pour induire efficacement des réponses immunitaires de l'appareil respiratoire ainsi que de manière systémique qui peut être utilisé pour traiter ou prévenir des troubles respiratoires. L'élucidation des mécanismes de détermination de la tolérance par rapport à l'activation de la réponse immunitaire dans les voies respiratoires après SLIT is cruciale pour permettre la conception rationnelle de nouvelles stratégies thérapeutiques qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec différents traitements disponibles contre les affections respiratoires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Jean-Claude Sirard du Centre d’Infection et d’Immunité de Lille, Institut Pasteur de Lille-France, pour avoir aimablement fourni la flagelline purifiée et le Dr Teresa Camou, Directrice du Laboratoire National de Référence, Ministère de la Santé de l’Uruguay, pour avoir aimablement fourni la souche pneumococcique.

Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à M. Diego Acosta et M. Ignacio Turel de BichoFeo Producciones-Uruguay pour leur engagement et leur travail acharné tout au long de la production et de l’édition de la vidéo.

Ce travail a été soutenu par les subventions PR_FCE_2009_1_2783 et BE_POS_2010_1_2544 de l’Agence nationale de recherche et d’innovation, ANII de l’Uruguay, du Programme de développement des sciences fondamentales, PEDECIBA de l’Uruguay et de la Commission sectorielle de la recherche scientifique, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de kétamine (50 mg/ml)Pharma Service, Uruguay
Solution de xilacine (2 %)Portinco S.A., Uruguay
Seringue stérile de 1 mlModern, Uruguay
Aiguille stérile de 27 gModern, Uruguay
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Sérum de veau fœtalATCC302020
Pénicilline/Streptomycine SolutionSIGMAP4333
PBS stérile sans Ca2+/Mg2+PAAH21002
Type-I CollagenaseLife Technologies/Gibco17100017
Déoxyribonucléase I (DNAse-I)SIGMAD4513
DispaseLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 rat conjugué anti souris IgG2b anti CD11bBD 550993Clone M1/70
APC hamster conjugué anti souris IgG1 anti CD11cBD550261Clone HL3  ;
APC-Cy7 rat conjugué anti souris IgG2a anti Ly6GBD560600Clone 1A8
Solution saline stérileLaboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay
Tryptic Soy AgarBD Difco, France236950
Sang de mouton défibrinéBiokey, Uruguay
Boîtes de Pétri stérilesGreiner633180
p10 PipetteGilsonF144802
p20 PipetteEppendorf3120000097
p200 PipetteGilsonF123601
p200 PipetteCappC200
p200 PipetteEppendorf3120000054
p1000 PipetteEppendorf3120000062
Filtres stériles p10Greiner771288
stérile p200Greiner739288
stérile p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Pince à pointe fine en acier inoxydable.SIGMAZ168785/Z168777Courbée et droite
Pince à tissu de pansementSIGMAF4392Longueur 8 pouces
Pince à micro-dissectionSIGMAF4017Droite  ;
Pince à micro-dissectionSIGMAF4142  ;courbé
Ciseaux MayoSIGMAZ265993  ;
ScalpelSAKIRA MEDICAL
Biopsie stérile Punch & Oslash ; 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079D5 mm de diamètre peut également être utilisé
Tubes stériles 1,5 ml Deltalab200400P
Tubes stériles 15 mlGreiner188271
Tubes stériles 50 ml TubesGreiner227261
Pipettes sérologiques stériles 5 mlGreiner606160
Pipettes sérologiques stériles 10 mlGreiner607160
Pipettes sérologiques stériles 25 mlGreiner760180
Enceinte de sécurité biologique, classe IIsérie Thermo Scientific1300, type A2
Micro-Isolateur  ; RackRAIR  ; IsoSystem  ;76144WSuper  ; Souris  ; 1800 AllerZone  ;
Microcentrifugeuse réfrigéréeEppendorfLegend Micro 21R
HeraeusBiofuge-pico
CentrifugeuseThermo ScientificSorval ST40R
CO2 Incubateur  ;Modèle ThermoScientific  ; 3111
Stérile Pipettes pasteur à pointe fineDeltalabD210022
Pipettes pasteur stérilesDeltalab200007
Stérile à plaque 24 puitsGreiner662160
Trypan Blue Solution  ;Life TechnologiesT10282
Compteur automatique de cellules - CountessLife TechnologiesC10227  ;
Lames de chambre de comptage cellulaire CountessLife TechnologiesC10312
Tubes de cytométrie en fluxBD343675
Cytomètre en flux - FACS Canto-IIBD
Instrument de PCR en temps réel - Rotor Gene Q ou ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol ReagentLife Technologies15596-026Moléculaire Biologie Grade
DNAse-ILife Technologies18068-015Biologie moléculaire
Grade DNAse-I Buffer 10XLife Technologies18068015Biologie moléculaire Grade
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Biologie moléculaire
Eau ultra-pureLife Technologies10977Biologie moléculaire Grade
RNAse OutTechnologies de la vie100000840Biologie moléculaire
Grade Amorces hexamères aléatoiresde la vieN8080127Biologie moléculaire
Tampon M-MLV-RT LifeTechnologies18057-018Biologie moléculaire Grade
M-MLV-RT EnzimeLife Technologies28025-021Biologie moléculaire Grade
QuantiTect Syber Green Kit PCRQiagen204143Biologie moléculaire
Amorces spécifiques au grade  ;de la vieBiologie moléculaire
Pince à filtre Pince à filtre Technologies Technologies

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Mots-clés

Pneumonie pneumococciqueMod le murinCytom trie en fluxLavage broncho alv olaireSuspension de cellules uniquesStreptococcus pneumoniaeAgonistes des TLRR ponse immunitaireIsolement des ganglions lymphatiques
L'immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës
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