Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

10.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/52042

⸱

12 janvier 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

Dans cet article

Résumé

Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

Résumé

Nous rapportons ici un protocole robuste et efficace pour l’expression de protéines fluorescentes après injection d’ARNm dans des ovocytes non fécondés de l’amphioxus céphalochordé, Branchiostoma lanceolatum. Nous utilisons des constructions pour mCherry et eGFP ciblées sur membrane et nucléaire qui ont été modifiées pour s’adapter à l’utilisation des codons amphioxus et des séquences consensus de Kozak. Nous décrivons le type d’aiguilles d’injection à utiliser, le protocole d’immobilisation des ovocytes non fécondés et la configuration globale de l’injection. Cette technique génère des embryons marqués par fluorescence, dans lesquels la dynamique des comportements cellulaires au cours du développement précoce peut être analysée à l’aide des dernières stratégies d’imagerie in vivo. Le développement d’une technique de micro-injection chez cette espèce d’amphioxus permettra des analyses d’imagerie en direct des comportements cellulaires dans l’embryon ainsi que des manipulations spécifiques aux gènes, y compris la surexpression et l’inactivation des gènes. Dans l’ensemble, ce protocole consolidera davantage le chordé basal amphioxus en tant que modèle animal pour aborder les questions liées aux mécanismes du développement embryonnaire et, plus important encore, à leur évolution.

Introduction

Pendant le développement, une seule cellule donne naissance à un organisme entier dans un processus très complexe qui implique les deux divisions et les mouvements cellulaires. Pour mieux comprendre les principes biologiques sous-jacents la dynamique du comportement cellulaire, biologie du développement ont commencé à utiliser des techniques d'imagerie in vivo par fluorescence. Compartiments spécifiques des cellules, telles que les membranes cellulaires, peuvent soit être marquées par des traitements avec des colorants fluorescents, une approche entravée par le manque de spécificité et de la pénétration du tissu 1, ou par l'introduction spécifique dans l'embryon d'ARNm exogène codant pour les protéines fluorescentes deux. Différentes techniques peuvent être utilisées pour la prestation efficace de composés exogènes, tels que les ARNm. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à, la micro-injection, l'électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection et 3,4 transduction. Bien que toutes ces approches peut être utilisé pour introduire des composés exogènes dans unle développement embryonnaire, la micro-injection ne permet l'application de quantités prédéfinies et précis dans chaque cellule 3. techniques de microinjection ont été décrits pour tous les principaux systèmes de modèle de développement 4 (par exemple, les mouches des fruits, des vers nématodes, de poisson zèbre, grenouilles, souris) ainsi que pour certains autres modèles 4, y compris ceux utilisés pour des études comparatives visant à comprendre l'évolution des mécanismes de développement (par exemple, les anémones de mer, vers annélides, les oursins, tuniciers d'ascidies, l'amphioxus de céphalochordé).

Céphalochordés, qui, avec les tuniciers et les vertébrés établissent le phylum des chordés, sont particulièrement bien adaptés modèles pour étudier l'évolution des chordés et la diversification des vertébrés d'un ancêtre invertébrés 5-8. La lignée de céphalochordé divergé très tôt pendant l'évolution des chordés; et céphalochordés existantes, qui sont subdivisés en trois genres (Branchiostoma, Asymmetron et Epigonichthys), ressemblent vertébrés à la fois en termes d'anatomie et de l'architecture globale du génome 5-8. Sur les 30 espèces de céphalochordés qui ont été décrites à ce jour, cinq sont disponibles pour des études embryologiques et de développement 6,9: Asymmetron lucayanum (le lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (le amphioxus Floride), Branchiostoma lanceolatum (l'amphioxus européenne), Branchiostoma belcheri (le amphioxus chinoise) et Branchiostoma japonicum (le amphioxus japonais). Adultes mûrs de trois de ces espèces (B. lanceolatum, B. belcheri et B. japonicum) peuvent être induits à pondre à la demande au cours de la saison de reproduction 10,11. En outre, au moins pour B. lanceolatum, frai efficace peut aussi être induite dans l'eau de mer artificielle 12, ce qui rend cette espèce de céphalochordé particuliers accessible pour laborators qui ne ont pas accès à l'eau de mer naturelle. La combinaison, dans B. lanceolatum, d'un accès pratique et fiable pour les embryons avec une méthode de livraison efficace, tels que la micro-injection, jusqu'à présent, la seule technique de livraison développé en amphioxus (à la fois B. et B. floridae belcheri) 13-15, va permettre le développement d'un nouvelle gamme de techniques de manipulation, y compris la lignée tracing- et les approches de comportement de cellules dynamique.

Un protocole pour la micro-injection d'ARNm efficace pour exprimer des protéines fluorescentes dans le B. lanceolatum embryon a donc été développé. En outre, de fournir un ensemble d'outils de base pour l'imagerie en direct de B. embryons lanceolatum, systèmes de vecteurs ont été développés qui permettent associée à la membrane nucléaire et l'expression de protéines fluorescentes. Pour le ciblage de la membrane, le renforcement de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été fusionnée à la boîte de CAAX HRAS humaine et localisation nucléaire de mCherry et eGFP étaitobtenu par fusion à l'exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (figure 1, fichier supplémentaire 1). En outre, dans le but d'optimiser la traduction des protéines, des séquences de Kozak et des codons des constructions ont été modifiées et adaptées à l'utilisation dans B. lanceolatum. Pris ensemble, la méthode d'injection et des vecteurs d'expression présentés ici serviront de base pour la génération de nouvelles approches expérimentales pour céphalochordés, notamment en utilisant les analyses par fluorescence les dernières techniques d'imagerie in vivo.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation des instruments et réactifs

  1. Transfert pipettes Pasteur
    1. Générer une série de pipettes transfert de Pasteur avec différents diamètres de pointe en tirant de longues pipettes Pasteur 230 mm dessus d'une flamme à des vitesses différentes. Assurez-vous que le cône est aussi longtemps que possible pour le contrôle lisse et fine d'aspiration.
    2. Avec une pointe en diamant, rayer la pipette le long d'une ligne perpendiculaire à la longueur de la pipette. Avec les deux mains, tirez la pipette parallèlement à sa longueur pour générer une coupe au carré. Rapidement flamme polish la pipette sans se sceller la pointe.
    3. Varier le diamètre de la pointe avec le stade des ovocytes / embryons à pipette: 300-400 um pour les ovocytes non fécondés (environ 150 m de diamètre), 600 um pour les œufs fécondés (environ 500 m de diamètre), 200 à 400 um pour neurulas hachurée. Utilisez pipettes avec un tube d'aspiration bouche-surveillé de transférer les ovocytes / embryons d'un platà l'autre.
  2. Les aiguilles d'injection
    1. Manipuler les capillaires avec des gants pour assurer des conditions RNase-free. Utilisez le verre borosilicate avec des capillaires à incandescence avec des dimensions de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longueur 10 mm.
    2. Si capillaires sont tirés sur le type de chauffage à filament aiguille extracteur décrit dans la liste des matières, utilisez les paramètres suivants: chaleur 600, Pull 50, Velocity 80, Temps 60, 200 ou 300. Pression Sinon, se assurer que la forme, qui est crucial pour injections réussies, est comme le montre la figure 2 avec les propriétés suivantes: 4-8 pm de diamètre de pointe extérieure, 2 cm de longueur conique.
      NOTE: Aiguilles peut être tiré avant la saison de frai et utilisé pendant toute la saison.
  3. Solution rouge de phénol boursier 5% (4x)
    1. Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
    2. Dans un tube de 0,22 um-filtration, peser 25 mg de phénol poudre rouge.
    3. Ajouter 0,5 ml d'eau DNase et RNase àle tube contenant la poudre.
    4. Spin pendant 3-5 min à 18 000 xg à température ambiante pour filtrer stériliser la solution et enlever les cristaux qui pourraient obstruer l'aiguille d'injection.
    5. Conserver à 4 ° C ou stocker des aliquotes de 250 ul à -20 ° C.
  4. 0,25 mg de solution de poly-lysine / ml
    1. Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
    2. Dissoudre 5 mg de poly-L-lysine dans 20 ml d'eau distillée. Magasin aliquotes de 5 ml à -20 ° C.
    3. Utiliser un aliquot décongelé immédiatement et une seule fois pour assurer une adhérence robuste et reproductible des ovocytes à l'antenne poly-lysine.
  5. la synthèse d'ARNm
    1. Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
    2. Linéariser 5 ug d'ADN d'intérêt avec l'enzyme appropriée (généralement pendant 2 heures, à 37 ° C). Pour vérifier l'exhaustivité de la digestion, de fonctionner de 2% en volume du mélange de digestion sur un gel agarose-TBE 1% dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min.
    3. Extraire la lineaADN risé avec 25: 24: 1 de phénol (pH 8,0): chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifugeuse 10 min à 18 000 xg et récupérer la phase aqueuse (supérieure).
    4. Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse.
    5. Précipiter l'ADN linéarisé avec 100: 10: 300 ADN linéarisé: 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2): 100% d'éthanol pendant une nuit à -20 ° C.
    6. Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à l'éthanol à 70%.
    7. Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez sécher et remettre en suspension dans l'eau sans RNase à une concentration finale de 0,5 ug / ul.
    8. On transcrit 1 ug d'ADN linéarisé en utilisant un kit de synthèse d'ARNm avec la polymerase appropriée, selon les instructions du fabricant.
    9. Extraire l'ARNm de 5: 1 de phénol (pH 4,7): une solution d'arrêt de chloroforme et d'acétate d'ammonium fourni avec le kit.
    10. Vortex pendant 20 secondes, CEntrifuge 10 min à 18 000 xg et recueillir la phase aqueuse.
    11. Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse.
    12. Précipiter l'ARNm avec 100% d'isopropanol pendant la nuit à -20 ° C.
    13. Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à 80% d'éthanol.
    14. Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez le culot sec à la température ambiante pendant plus de 5-10 min comme il sera alors difficile de remettre en suspension. Remettre en suspension dans l'eau DNase et RNase à une concentration finale d'au moins 2 pg / pl pour assurer une concentration d'ARNm finale décent dans le mélange d'injection.
    15. Pour vérifier la qualité et la taille du produit de transcription, exécutez 0,5 pi de l'ARNm sur un 1% agarose-TBE gel sans RNase dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min. Magasin 2 aliquotes à -80 ° C.
  6. Plats Poly-lysine
    REMARQUE: Poly-lysine coated plats sont utilisés pour immobiliser les ovocytes pendant l'injection.
    1. Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), couvrir le fond de la boîte de Pétri avec 1 ml de la solution décongelée ml 0,25 mg / poly-lysine. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    2. Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), transférer la solution de poly-lysine 0,25 mg / ml dans un autre 35 mm de culture cellulaire boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Jeter le ml solution à 0,25 mg / poly-lysine.
    4. Que les boîtes de Pétri à sec, à l'envers à la température ambiante pendant 2 heures.
    5. Stocker les plats de poly-lysine enveloppé dans une enveloppe en plastique à 4 ° C pour éviter la contamination pour une semaine maximum.
  7. plats d'agarose revêtues
    NOTE: Ils sont utilisés pour la culture injecté embryons. L'agarose fournit un coussin pour les embryons injectés et les empêche de coller au fond de la boîte.
    1. Assurez-eau de mer artificielle (ASW) en utilisant 37-38 g / L commsels erciales + 0,25 mM NaHCO 3 dans l'eau d'osmose inverse.
    2. Dissoudre l'agarose à une concentration de 1% à 0,22 um ASW-filtré par chauffage de la solution dans un four micro-ondes.
    3. Rapidement verser la solution d'agarose chaude d'un 35 mm boîte de Petri dans l'autre afin d'assurer un revêtement très mince agarose du plat.
    4. Conserver les plats d'agarose revêtues enveloppés dans Saran Wrap à 4 ° C pour éviter la contamination pendant une semaine maximum.
  8. mélange d'injection et le chargement des aiguilles d'injection
    1. Environ 2 heures avant de commencer les injections, faire un mélange d'injection en 2 ul dans RNase et de l'eau DNase avec des concentrations finales de 1 à 1,8 pg / pl de l'ARNm, 15% de glycérol, 1,25% de rouge de phénol.
      REMARQUE: Les couleurs de rouge de phénol, la solution, ce qui permet le suivi de l'efficacité d'injection, et l'identification des embryons injectés avec succès. Glycérol favorise la diffusion de l'ARNm dans le ovocyte.
    2. Centrifugeuse 4 min à 18 000 xg pourcristaux granulés. Garder sur la glace jusqu'à utilisation.
    3. Avec une pipette 10 ul, 0,5 ul de recueillir le mélange par injection, en évitant le fond du tube, où les cristaux ont été granulés.
    4. Remblai d'au moins deux aiguilles d'injection (en cas une pauses pendant l'injection) par pipetage la baisse de 0,5 pi de mélange d'injection à la grande ouverture de l'aiguille.
    5. Installer les aiguilles dans un récipient de stockage de liquide au fond à 4 ° C pour éviter l'évaporation du mélange d'injection. Laissez le mélange d'injection voyager lentement à la pointe de l'aiguille d'injection pendant au moins 1 heure pour minimiser la création de bulles.
    6. Magasin mélange d'injection supplémentaire à -80 ° C pendant un maximum de trois utilisations supplémentaires, après quoi détériore la qualité de l'ARNm (données non présentées).

2. Collecte de matériel biologique, microinjection et culture d'embryons

  1. collecte des ovocytes et de sperme
    NOTE: Voir Theodosiouet al. 12 pour un protocole détaillé pour induire la ponte et pour la collecte des gamètes.
    1. les mâles et les femelles de choc dans ASW à 23 ° C pendant 24 heures.
    2. Une à deux heures avant le coucher du soleil, transférer les adultes dans des coupes individuelles en ASW à 19 ° C, car la plupart des adultes frayer 1-2 heures après le coucher du soleil.
    3. Rincer 35 mm boîtes de Pétri dans ASW filtrée et les laisser à l'envers sec pour éviter les ovocytes de coller au fond du plat.
    4. Après la ponte, de recueillir le sperme et ovocytes immédiatement avec une pipette de 1 000 pi.
      1. Gardez sperme et ovocytes séparer de amphioxus adultes car le contact est nuisible pour la santé des gamètes (données non présentées).
      2. En outre, éviter de surprendre les adultes, ce qui conduit à des mouvements qui dissipent, et donc diluer, des spermatozoïdes et ovocytes. Pour garder le sperme actif aussi longtemps que possible et d'optimiser le taux de fécondation, de recueillir le sperme aussi concentré que possible.
    5. Gardersperme sur de la glace dans un tube de 1,5 ml.
    6. Transfert ovocytes en filtrée ASW dans les 35 mm boîtes de Pétri pré-rincé.
    7. Transfert 100-500 ovocytes avec un précédemment tiré 300-400 um transfert pipette Pasteur à un autre 35 mm boîte de Petri pour effectuer les injections.
    8. Engrais le reste de l'embrayage en tant que témoin pour les spermatozoïdes et la qualité de l'ovocyte ou pour d'autres expériences.
  2. injection des ovocytes
    1. Installer l'aiguille d'injection sur le micromanipulateur à un angle 50 ° par rapport au plan horizontal.
      REMARQUE: Angles de moins de 50 ° vont pousser les ovocytes autour sur le plat, tandis que des angles de plus de 50 ° ne permettra pas un suivi approprié de la position de l'aiguille par rapport à l'ovocyte.
    2. Sous un microscope à dissection fluorescent avec 25X oculaires, transférer 30 ovocytes avec le 300-400 um transfert pipette Pasteur sur un plat poly-lysine contenant filtrée ASW.
    3. Déposez les ovocytes long d'une ligne à transporterinjections sur une manière ordonnée et pour distinguer injectés à partir d'ovocytes non-injecté. Injecter un petit nombre (30 ovocytes) pour réduire au minimum le temps d'exposition des ovocytes à la poly-lysine, ce qui tend à déformer les embryons en développement (données non présentées).
    4. Utiliser l'éclairage à fond noir pour rendre les ovocytes translucide comme possible.
    5. Avec le mouvement de la molette grossière micromanipulateur, amener l'aiguille d'injection à proximité d'un ovocyte.
    6. Avec une pince fine, ouvrir l'aiguille au niveau où la pointe commence à être courbé. Par pulsation avec l'injecteur, vérifier que mélange d'injection est en fait rouge se écoulant hors de l'aiguille.
    7. Au grossissement de 200x et avec le mouvement bouton fine de la micromanipulateur, déplacez doucement l'aiguille d'injection dans le noyau de l'ovocyte.
      NOTE: Se il est inséré trop superficielle, la solution injectée ne sera pas rester à l'intérieur de l'ovocyte. Se il est inséré trop loin, l'ovocyte sera détruit.
    8. Injecter avec 1-3 impulsions de 120 ms Durations et 1-10 psi de pression. Si l'aiguille est assez fine, injecter à débit continu à pression constante. Assurez-vous que le volume d'injection correspond à 1/5 à 1/3 du volume d'un seul ovocyte.
    9. Après l'injection, retirez l'aiguille rapidement pour éviter les fuites de l'ovocyte.
    10. Vérifiez que la solution injectée reste dans l'ovocyte et qui après quelques secondes, la solution injectée se répand dans l'ovocyte.
    11. Passez à la prochaine ovocyte en ligne.
    12. Gardez quelques embryons non-injecté de chaque série comme contrôle négatif pour estimer la fluorescence de fond lors de la numérisation pour les embryons injectés.
  3. La fertilisation, la sélection des embryons injectés et de la culture de l'embryon
    1. Fécondation des ovocytes dès qu'une série a été injectée. Comme la qualité des ovocytes diminue avec le temps, injecter et féconder les ovocytes dans les 1 h 12 après le frai.
    2. Selon la concentration du sperme, ajouter 5/1 gouttes de sperme et d'ovocytestourbillonner le plat.
      NOTE: L'enveloppe de fertilisation devrait être apparent sur les embryons après environ 1 min.
    3. Autoriser les embryons se détacher de l'antenne poly-lysine, tout en injectant une autre série d'ovocytes.
    4. Transférer les embryons avec le 600 um transfert pipette Pasteur dans une boîte de Pétri agarose revêtues. Retirez les embryons de le plat poly-lysine dès que possible, si possible avant le stade 2 cellules.
      NOTE: En cas d'exposition prolongée à la poly-lysine, les embryons ont tendance à devenir blastulas densément-emballés, aplati sur le côté touchant le fond du plat.
    5. Au stade 2 cellules à 4 cellules, sélectionnez avec une portée de dissection fluorescente avec filtre DSR les embryons succès injectées, ce est à dire, ceux qui ont une morphologie normale qui présentent un signal rouge fluorescent rouge de phénol dérivés.
    6. Garder les embryons en culture in filtrée ASW en boîtes de Pétri agarose revêtu à 19 ° C jusqu'à ce que la scène souhaitée pourdans l'imagerie in vivo.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le protocole détaillé ci-dessus constitue la base de la micro-injection de B. ovocytes lanceolatum et donc pour l'introduction dans le développement B. embryons de lanceolatum d'ARNm codant pour des protéines fluorescentes pour l'imagerie in vivo. Bien que la technique est certainement robuste et fiable, le taux d'injections réussies utilisant ce protocole reste variable (tableau 1). L'explication très probable pour ce fait intriguant, ce est l'extrême variab...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Dans cet article, nous présentons, pour la première fois, un protocole détaillé et reproductible pour l'injection de B. ovocytes lanceolatum, qui, après B. floridae 13,14 et B. belcheri 15, est donc la troisième espèce de amphioxus, pour lesquels une telle technique a été décrite. Fait important, le protocole décrit ici comprend également la description des systèmes de vecteurs adaptés pour la production de protéines fluorescentes dans B. lanceolatum...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner l'appui par le "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette» pour l'élevage. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 et ANR-11-JSV2-002-01) à Michael Schubert, par la subvention de l'Union européenne FP6 "Embryomics» et par la subvention de l'ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "à Jean-François Nicolas et Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho est financé par une bourse de doctorat FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Les demandes pour les vecteurs décrits ici peuvent être adressées directement aux auteurs.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Consommables
35 mm Boîtes de PétriFalcon353001Unité de filtration traitée par culture
(Stericup 1 L)FisherW217190.22 μ ; m
Tubes Spin-XCostar81600.22 μ ; m
Pot de stockage d’aiguilles pour capillaires de 1,2 mm de diamètreWPIE212
Pipettesde 230 mm de long
Tube d’aspirationDutscher75056
Capillaires pour aiguilles d’injectionSutterBF 120-94-10Verre borosilicaté avec filament, diamètre extérieur 1,20 mm, diamètre intérieur 0,94 mm, longueur 10 mm
réactifs
Agarose à bas point de fusionSigmaA9414
Rouge phénoliqueSigma114537
GlycérolSigmaG2025
Poly-L-lysine hydromyrideSigmaP9155
H2O, sans DNase/RNaseGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 Kitde transcriptionAmbionAM1340kit de synthèse d’ARNm
Phenol pH 8SigmaP4557
24:1 chloroforme :alcool isoamyliqueSigmaC0549
5:1 phenol pH 4.7 :chloroformeSigmaP1944
Reef Crystal sels (200 kg)Europrix  ;Sels commerciaux
NaHCO3SigmaS6014
Equipment
Lunette de dissection fluorescente avec grossissement 200XLeicaMZ16FOculaires 25X, filtres DSR et GFP2
MicromanipulateurMarzhauzerM-33
InjecteurPicospritzermodèle II ou III
Extracteur d’aiguilleSutterP97Extracteur d’aiguille à filament chauffant
Pince fineFine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
Pasteur

Références

  1. Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
  3. Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
  4. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841(2014).
  5. Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
  6. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  7. Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
  8. Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
  9. Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  10. Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
  11. Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461(2013).
  12. Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
  13. Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
  14. Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
  15. Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
  16. Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
  17. Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
  18. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
  21. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).
  22. Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
  23. Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
  24. Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
  25. Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
  26. Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
  27. Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
  28. Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
  29. Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
  30. Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
  31. Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
  32. Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599(1371).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Expression de prot ines fluorescentestechnique de microinjectionimmobilisation d ovocytesrev tement la polylysinemicroscope de dissection fluorescencemicroscopie biphotoniqueculture d embryonsimagerie in vivo
L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.