Nous avons développé un modèle de lésions pulmonaires chez la souris par injection intra-trachéale de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ce modèle imite les lésions pulmonaires lors d’une pneumonie et est cliniquement pertinent.
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Article de méthode
Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle
Dans cet article
Résumé
Résumé
Afin d'étudier les lésions pulmonaires aiguës humaine et la pneumonie, il est important de développer des modèles animaux pour imiter différentes caractéristiques pathologiques de cette maladie. Ici, nous avons développé un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de bactéries Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ou PA). En utilisant ce modèle, nous avons pu montrer une inflammation des poumons à la phase précoce de la lésion. En outre, alvéolaire perméabilité de la barrière epitheliale a été observée par analyse de lavage broncho-alvéolaire (BAL); et la mort cellulaire alvéolaire a été observé par essai TUNEL en utilisant un tissu préparé à partir de poumons blessés. Lors d'une étape ultérieure après la lésion, on a observé une prolifération cellulaire requis pour le processus de réparation. La blessure a été résolue 7 jours à compter de l'ouverture de P. injection aeruginosa. Ce modèle imite le parcours séquentiel de l'inflammation pulmonaire, une lésion et de réparation pendant une pneumonie. Ce modèle animal cliniquement pertinente est adapté pour l'étude de la pathologie, le mécanisme de réparation, fuite une lésion pulmonaire aiguë, et peut également être utilisé pour tester des agents thérapeutiques potentiels pour cette maladie.
Introduction
Poumons sont exposés à des agents pathogènes environnementaux et sont sensibles à l'inflammation et les lésions 1-3. Dans des conditions pathologiques telles que la pneumonie ou syndrome de détresse respiratoire adulte (SDRA), les agents pathogènes ainsi que les facteurs inflammatoires libérés par les leucocytes provoquent des blessures et la mort des cellules alvéolaires 1-3. Il est important de développer des modèles animaux de lésion pulmonaire aiguë de faciliter l'étude de la pathologie de la blessure ainsi que le mécanisme de réparation.
Actuellement, la plupart des gens utilisent des modèles de lésions pulmonaires hyperoxie et la bléomycine souris induit 4. Cependant, les mécanismes d'hyperoxie blessures causées ne sont pas les mêmes que la plupart des lésions pulmonaires courantes qui se produisent au cours de la pneumonie ou de l'ARDS 5. La bléomycine blessure aiguë induite est rare dans un contexte clinique 4. Nous rapportons ici un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de P. aeruginosa 6,7. Ce modèle est cliniquement pertinente, et imite la processus qui se produisent suite à une pneumonie 8.
Comme, un pathogène nosocomial opportuniste des individus immunodéprimés, P. aeruginosa infecte habituellement les voies pulmonaires, des voies urinaires, des brûlures, des plaies, et provoque également d'autres infections du sang 6. La bactérie produit virulence facteur exotoxine A, se multiplient et déclenchent des réactions immunitaires 6. L'administration intra-trachael de P. aeruginosa correspond à la situation dans l'exposition des humains à des bactéries qui provoquent la pneumonie et à la pathologie est susceptible d'être différente de la grippe H1N1 du virus de la grippe pulmonaire induite modèle de lésion récemment rapporté 9. Depuis P. aeruginosa est un agent pathogène opportuniste, il est relativement sûr à manipuler par rapport à certains des agents pathogènes les plus virulentes. Ici, nous avons utilisé l'injection intra-trachéale à administrer les bactéries, car nous avons constaté que cette méthode introduit plus de bactéries dans la région distale alvéoles du poumon par rapport àd'autres procédures telles que l'utilisation d'un cathéter par la bouche.
Comparé à d'autres modèles de lésion pulmonaire aiguë, le P. aeruginosa modèle décrit ici est adapté à l'étude des lésions pulmonaires induites par les bactéries et par une inflammation excessive. Contrairement à d'autres modèles animaux qui utilisent P. aeruginosa pour induire une septicémie 10,11, ici nous utilisons injection intra-trachéale de ces bactéries à induire des lésions pulmonaires aiguës localisées.
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Protocole
Les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et des comités institutionnels sur la biosécurité de l'Université de l'Illinois à Chicago.
NOTE: Toutes les procédures impliquant des pseudomonas doivent être effectuées avec le niveau de biosécurité 2 (BSL2) pratiques, qui comprennent, mais ne sont pas limités à: masque, protection oculaire, blouse ou combinaison, gants et doubles. Travailler dans le cabinet de biosécurité certifié. Traiter les instruments en contact avec des bactéries avec l'eau de Javel ou de dioxyde de chlore désinfectant à base. Utilisez une boîte étanche pour transporter les échantillons.
1. P. aeruginosa Culture et de croissance
- Magasin P. aeruginosa PA103 comme un stock de bactéries dans un bouchon à vis cryovial à -80 ° C.
- Placer le flacon dans un rack dans une boîte avec 70% d'éthanol mouillé des serviettes en papier et prendre au laboratoire de biosécurité de niveau 2 (niveau L2).
- Streak les bactéries sur des plaques de gélose au sang de mouton et se développent à 37 ° C pendant environ 15 heures dans un incubateur.
- Dans une hotte BSL2, rayer les bactéries de la plaque avec des bactéries boucle et remettre en suspension dans 5 ml de PBS.
- Conservez le stock à 4 ° C pendant 3 mois. Toutefois, déterminer le titre toutes les 2 semaines.
- Diluer en série les bactéries dans du PBS (en général de 01:10 à 01:10 4 7) et la plaque à la dilution connue sur des plaques de gélose au sang de mouton.
- Incuber les plaques pour ~ 15 heures. Compter les colonies et calculer unités formant colonie (UFC) pour déterminer la concentration de bactéries.
- Remettre en suspension les concentrations appropriées (~ 5 x 10 3 UFC / ul) dans 0,5 ml de PBS dans des cryotubes de 1,5 ml à bouchon à vis stériles. Sceller les cryotubes et les placer dans un rack cryovial sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression.
- Transporter la boîte à l'animalerie BSL2. Une fois là, ouvrir la boîte dans l'armoire de BSL2.
2. P. aeruginosa instillation
- Effectuer la chirurgie de survie de façon aseptique (gants stériles, des instruments stérileset les techniques aseptiques). Utilisez un champ stérile pour fournir une surface de travail pour (autoclave) instruments chirurgicaux stériles. Stériliser les instruments à l'aide d'un stérilisateur de perles chaud entre chaque instillation trachéale procédure.
- Peser souris avant l'anesthésie. Anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg), de xylazine (5 mg / kg), en 0.1 - 0.2 ml de PBS par voie intrapéritonéale (ip). Déterminer l'efficacité de l'anesthésique par des non-réactivité de pincement de l'orteil. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Retenez souris sur un bord chirurgicale dans BSL2 armoire.
- Identifier la zone de la coupe vers le bas. Rasez ce domaine et préparer la peau à l'aide alternance alcool et povidone prélèvements d'iode 3 fois.
- Traiter la zone d'incision avec un anesthésique local (lidocaïne) que cette anesthésie est suffisante pour une chirurgie mineure comme une incision de la peau pour accéder à la trachée.
- Faire une petite incision (environ 5 mm) sur la ligne médiane du cou, et utiliser émoussé forceps de se déplacer doucement sur le muscle pour l'accès à la trachée. Exposer la trachée par dissection chirurgicale.
- Dessinez solution de bactéries dans une seringue de 1 ml à usage unique avec aiguille 27 G. Pour chaque souris, l'administration de 20 à 30 pl de bactéries à la concentration appropriée (jusqu'à 10 5 CFU chaque souris).
- Insérer l'aiguille dans la trachée. Injecter la solution lentement dans la trachée.
- Veiller à ce que les halètements des animaux, ce qui indique généralement que la solution a atteint dans les poumons.
- Fermer la plaie avec des sutures stériles (6-0 monofilament) dans des conditions aseptiques.
- Utilisez 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection sous-cutanée post-op analgésie pour contrôler la douleur post-chirurgicale.
- Assurez-vous que le temps nécessaire à l'induction de l'anesthésie initiale de fermeture de l'incision est inférieure à 15 min.
- Après l'injection, jeter les seringues et aiguilles dans un container approprié approprié.
- Traiter les instruments chirurgicaux avec Disi base de dioxyde de chlorenfectant pendant 15 minutes, rincer et retourner au laboratoire pour la stérilisation et de réutiliser au besoin.
- Maison des souris individuellement dans des cages propres au cadre chaleureux.
- Vérifiez sur l'animal toutes les 30 min jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience et commence à se déplacer; et plus tard, à des intervalles de 12 h pour les 3 premiers jours après la chirurgie.
- Conserver les souris dans le centre de BSL2 animal tout au long de l'expérience. Assurez-vous que seul tissu contenu dans la boîte scellée de quitter l'établissement BSL2 animale. Si les souris expriment l'un des comportements moribonds (définie comme la détresse respiratoire, léthargie, absence de déambuler en réponse à une stimulation douce) à tout moment de l'étude, euthanasier les souris par inhalation de CO 2 provenant d'une source en bouteille suivie par dislocation cervicale.
- Euthanasier le sujet expérimental par exsanguination sous anesthésie.
- Recueillir les tissus pulmonaires de souris euthanasiées. Effectuer ces procédures dans une hotte de BSL2. Si nécessaire, transférer l'échantillon en utilisant des tubes étanches placées dans un rack sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression pour plus de processus.
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Résultats
A partir de 24 à 72 heures après P. injection aeruginosa, cellularité accrue a été observée dans les coupes pulmonaires (figure 1A-D). Le poumon a commencé à récupérer à partir de 96 h après la lésion (figure 1E). 7 jours après P. aeruginosa, morphologie alvéoles normale a été en grande partie restaurée (figure 1F). Sections à l'aide du poumon tunnel de coloration préparés à 24 heures après P. aeruginosa a montré la mort cellulaire da...
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Discussion
Le poumon de la souris modèle de lésion Pseudomonas que nous décrivons ici imite l'ensemble du processus de l'inflammation, des lésions pulmonaires, la réparation, et la résolution qui se produisent suite à une lésion pulmonaire aiguë ou la pneumonie. Il a des avantages uniques comparaison avec plusieurs autres modèles de lésion en ce qu'il est cliniquement pertinent et relativement sûr et facile à manipuler.
L'étape critique dans la procédure est que l'injection de la so...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM) des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anesthésique : Kétamine, xylazine, lidocaïne, buprénorphine | Calibre pharmaceutique | ||
| 27 G Aiguille | Fisher 1482648 | ||
| seringue | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| ciseaux | Outils de science | ||
| Pince | Outils de science | ||
| Suture ; | Fisher | 19-037-526 | |
| Jauge oculaire, gant, blouse | |||
| à base de dioxyde de chlore | Clidox | ||
| Plaques de gélose au sang de mouton Clidox ; | Alimentation Medex | HL-1160 |
Références
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- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
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Réimpressions et autorisations
